CC BY
84
10. Herr n-Arita la K.D., Kornum B.R., Mahlios J., Jiang W., Lin L., Hou T. et al. CD4+ T Cell autoimmunity to hypocretin/orexin and cross-reactivity to a 2009 H1N1 influenza a epitope in narcolepsy. 2013; 5 (216) 216ra176. Available at: www.ScienceTranslationalMedicine.
11. Persson I., Granath F., Askling J., Ludvigsson J.F., Olsson T., Feltelius N. Risks of neurological and immune-related diseases, including narcolepsy, after vaccination with Pandemrix: a population- and registry-based cohort study with over 2 years of follow-up. 2013 The Association for the Publication of the Journal of Internal Medicine. Journal of Internal Medicine, 2014; 275: 172 - 190.
12. Federal Law No. 61-FZ of 12 April 2010 On Circulation of Medicines (as amended by Federal Laws No. 192-FZ of 27 July 2010, No. 271-FZ of 11 October 2010, No. 313-FZ of 29 November 2010, No. 409-FZ of 06 December 2011, No. 93-FZ of 25 June 2012, No. 262-FZ of 25 December 2012 , No. 185-FZ of 02 July 2013, No. 317-FZ of 25 November 2013 , No. 33-FZ of 12 March 2014, No. 313-FZ of 22 October 2014) (in Russian).
13. Medication Expert Review Guidelines. Volume I. Grif & Co., 2013: 328 (in Russian)
14. State Sectoral Standard: R 52379-2005, Good Clinical Practice (GCP) (approved by Order No. 232-st of 27 September 2005 of the Federal Agency for Technical Regulation and Metrology) (in Russian)
15. Popova A.Y., Ezhlova E.B., Mel'n'ikova A.A., Frolova N.V., Miheev B.N., Rizhikov A.B. et al. Effect of annual influenza immunisation on influenza rates in Russia. Epidemiologia i Vakcinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2016; Volume 15; 1 (86): 48 - 55 (in Russian).
Протективная активность и безопасность бесклеточной коклюшной вакцины из вакцинных и свежевыделенного штамма Bordetella pertussis
Е.М. Зайцев ([email protected]), И.Г. Бажанова, М.В. Брицина, Н.У. Мерцалова,, М.Н. Озерецковская
ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова», Москва
Резюме
В работе приведены данные изучения in vivo в экспериментах на мышах протективной активности и безопасности трех вариантов бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ), содержащих комплекс протективных антигенов коклюшного микроба, из вакцинных и свежевыделенного штаммов Bordetella pertussis с различными генетическими типами коклюшного токсина, пертактина и фим-брий. Все исследованные варианты БКВ обладали протективной активностью, соответствующей требованиям ВОЗ, и были безвредны при введении мышам одной иммунизирующей дозы, рекомендуемой для введения человеку (25 мкг) ,в тесте изменения массы мышей и чувствительности к гистамину. Препарат БКВ, содержащий антигены вакцинных и свежевыделенного штаммов, обеспечил двукратное увеличение протективной активности, и также обладал протективными свойствами при экстремально высокой дозе заражения. Полученные результаты указывают на перспективность включения в состав БКВ антигенов вакцинных и свежевыделенного штаммов B. pertussis с различными генетическими типами коклюшного токсина, пертактина и фимбрий. Ключевые слова: штаммы B. pertussis, коклюшный токсин, пертактин, фимбрии, бесклеточная коклюшная вакцина, протектив-ная активность
Protective Activity and Safety of Acellular Pertussis Vaccine from Vaccine and Freshly Isolated Strain Bordetella pertussis
E.M.. Zaitsev ([email protected]), I.G. Bazhanovа, M.V. Britsina, N.U. Mertsalovа, M.N. Ozeretskovskaya
Federal State Budgetary Institution of Science«I.I. Mechnikov Science-Research Institute of Vaccines and Sera», Moscow
Abstract
Goal. Study of the protective activity and safety of acellular pertussis vaccine (APV) using freshly isolated strain of B. pertussis. Materials and methods. Mice-hybrids F1 (CBAxC57Bl6). The B. pertussis strains: vaccine strains No. 305, No. 203, freshly isolated strain No. 287, the test neurotropic strain culture of B. pertussis No. 18323. Protective properties of the APV evaluated in accordance with the guidelines. Toxicity APV was studied by changes of body weight of mice, histamine-sensitizing properties, according to the instructions. The results and discussion. The paper presents the study of the safety and protective activity of three options acellular pertussis vaccine (APV) containing a complex of protective antigens of pertussis microbe: APV1 of vaccine strains of B. pertussis No. 305, serovariant 1.2.0, the gene for the pertussis toxin ptxA2, pertactin prnl gene, genes fimbria 2 and 3 - fim2-1 and fim3A and strain No. 203, serovariant 1.2.3, the gene for the pertussis toxin ptxA4, pertactin prnl gene, genes fimbria - fim2-1 and fim3A; APV2 of freshly isolated strain of B. pertussis No. 287, serovariant 1.0.3, the gene for the pertussis toxin ptxAl, gene pertactin prn2 genes fimbria -fim2-1 and Т^3В; APV3 of strains No. 305, No. 203 and No. 287. Shows the relationship between the protective activity of the APV and genetic types, pertussis toxin, pertactin and fimrie in their composition. Protective activity APV1, APV2 and APV3 when infecting dose of 345 LD50 was 9.0 IPU/ml (international protective units per ml) of 10.3 IPU/ml and 19.9 IPU/ml, respectively. At extremely high dose of infection (3846 LD50) protective properties possessed only APV3, protective activity it was 9.2IPU/ml, in line with who requirements - at least 8 IPU/ml. Conclusion. Enhancing the protective effects of the vaccine APV3 and freshly isolated strain can be explained by the stimulation of cellular and humoral immunity to a broader spectrum of antigenic alternative structures in pertussis toxin, pertactin and fimrie.
Key words: strains of B. pertussis, pertussis toxin, pertactin, fimbriae, acellular pertussis vaccine, protective activity
Введение
Использование корпускулярной коклюшной вакцины привело к резкому снижению заболеваемости этой инфекцией. Тем не менее, благодаря высокой степени изменчивости в генотипах бактерий B. pertussis стали появляться мутации, приведшие к появлению новых циркулирующих штаммов, отличающихся от вакцинных. Уже в начале 1960-х годов происходит повсеместное замещение штаммов сероварианта B. pertussis 1.2.3 на штаммы сероварианта 1.0.3 [1, 2]. Данный процесс усилился после замены в 1990-е годы корпускулярной вакцины на бесклеточные, которые содержат детоксицированные основные протективные антигены коклюшных бактерий - коклюшный токсин (КТ), филаментозный гемагглютинин (ФГА), белок наружной мембраны - пертактин (PRN) и фимбрии (fim2,3), представляющие агглютиногены 2 и 3. Бесклеточные вакцины, защищая привитых от тяжелых форм коклюша, не смогли предотвратить циркуляцию B. pertussis, что привело, начиная с 1995 года и по настоящее время, к вспышкам заболевания в большинстве стран мира, использующих бесклеточные препараты для профилактики коклюша [3].
Несмотря на высокий уровень охвата вакцинацией, количество вспышек инфекции не снижается, по данным ВОЗ, в 2008 году в мире зарегистрировано 16 млн случаев заболевания и 200 тыс. случаев с летальными исходами Коклюш перестал быть инфекцией, актуальной для новорожденных и младенцев, он поражает также подростков и взрослых [4].
Сиквенс анализ генома B. pertussis, проведенный в ряде стран мира, подтвердил наличие изменений в аллельных вариантах КТ, ФГА, пертактина и фимбрий 2 и 3 у современных циркулирующих штаммов B. pertussis [5, 6]. При этом характерным для циркулирующих штаммов в гене субъединицы А коклюшного микроба стал аллельный вариант ptx A1 (AJ245366) вместо ptx A2 (AJ245367) и ptx A4 (AJ245368), содержащихся в гене вакцинных штаммов, в геноме пертактина циркулирующих штаммов - аллельный вариант prn2, в отличие от аллелей вакцинных штаммов - prn1. Увеличивается количество свежевыделенных штаммов, содержащих «невакцинные» аллели фимбриальных генов fim2 и fim3. Вместо аллельных вариантов «вакцинных» штаммов fim2-1 и fim3А регистрируются штаммы с аллелями fim2-2 и fim3В. Таким образом, структура генов коклюшного токсина, пертактина и фимбрий штаммов B. рertussis, используемых для производства АКДС- вакцины, не соответствует структуре этих генов циркулирующих в настоящее время штаммов коклюшного микроба. Изменения в геноме B. рertussis могут быть связаны с появлением более токсичных штаммов и возникновением вспышек заболевания коклюшем [7, 8].
Установлена возможность проникновения бактерий B. pertussis в различные эукариотические
клетки макроорганизма и находиться там, переходя в авирулентное состояние в результате перемещения мобильных генетических /S-элементов в специфические сайты оперона bvgAS, контролирующего экспрессию большинства детерминант вирулентности и возможность восстанавливать исходное вирулентное состояние, как было показано на примере с пертактином [9]. Возможно, что это явилось причиной появления стертых форм заболевания и бессимптомного носительства возбудителя инфекции.
Одним из возможных путей повышения протек-тивной активности бесклеточных коклюшных вакцин является использование в производстве циркулирующих штаммов B. pertussis.
В НИИВС им. И.И. Мечникова был адаптирован к жидкой питательной среде выделенный от больного коклюшем штамм B. pertussis, депонированный в ГИСК им. Л.А. Тарасевича под № 287 серовар 1.0.3. и запатентованный как продуцент важнейших протективных антигенов. Была разработана технология получения из этого штамма бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ).
Цель настоящих исследований - изучение про-тективной активности и безопасности бесклеточной коклюшной вакцины, приготовленной из культур вакцинных и свежевыделенного штамма B. pertussis № 287.
Материалы и методы
Животные: мыши-гибриды F1 (CBAxC57Bl6), массой 12 - 14 и 14 - 16 грамм, получены из питомника «Андреевка» Московской области.
Штаммы В. pertussis: вакцинный штаммы № 305, серовариант 1.2.0, ген коклюшного токсина ptxA2, ген пертактина prnl, гены фимбрий 2 и 3 - fim2-1 и fim3A; штамм № 203 (селекционированный в НИИВС им. И.И. Мечникова из вакцинного штамма 475, предлагаемый в качестве продуцента коклюшного токсина, депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича 10.11.89 г.), серовариант 1.2.3, ген коклюшного токсина ptxA4, ген пертактина prn1, гены фимбрий - fim2-1 и fim3A; свеже-выделенный штамм № 287, серовариант 1.0.3, ген коклюшного токсина ptxА1, ген пертактина prn2, гены фимбрий - fim2-1 и fim3B; тест-штамм нейро-тропной культуры B. pertussis № 18323.
Бесклеточная коклюшная вакцина (БКВ) получена из супернатанта жидкой среды культивирования В. рertussis штаммов №№ 305, 203 и 287 [1].
Белок определяли методом Lowry [10].
Протективные свойства БКВ оценивали в соответствии с руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11, 12] на модели развития менингоэнцефалита у мышей, зараженных нейротропной вирулентной культурой В. pertussis штамм 18323. Испытуемыми препаратами иммунизировали 3 группы по 16 мышей разными дозами с 5-ти кратным интервалом (2,5; 0,5 и 0,1 мкг белка). Одновременно анало-
гичные группы мышей иммунизировали разными дозами отраслевого стандартного образца имму-ногенной активности и остаточной токсичности коклюшной вакцины (ОСО-3). Через 14 дней, мышей заражали интрацеребрально, не менее 100ЛД50 В. pertussis штамм 18323, наблюдали за ними в течение 14 суток, ежедневно регистрируя число выживших животных и рассчитывая величину ЕД50 для испытуемых препаратов и ОСО. Используя полученных данные, вычисляли количество международных защитных единиц (МЗЕ) в 1,0 мл испытуемых препаратов. Опыт сопровождали контролем ЛД50 живой коклюшной культуры. По требованиям ВОЗ заражающая доза культуры должна быть не менее
100LD50.
Токсичность БКВ определяли по изменению массы тела мышей и, гистаминсенсибилизирую-щим свойствам, согласно руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [12].:
• Статистические методы: ED50 (доза, вызывающая 50% выживаемости мышей) и МЗЕ/мл (Международная защитная единица в 1 мл вакцины) рассчитывали по методу Вильсон и Вустер с использованием таблиц Национального института здоровья США [11].
Результаты и обсуждение
Приготовлены по оригинальной методике [13] три варианта БКВ, содержащие комплекс протек-тивных антигенов коклюшного микроба:
• БКВ1 - штаммы B. pertussis № 305 и № 203;
• БКВ2 - свежевыделенный штамм В. pertussis № 287;
• БКВ3 - штаммы № 305, № 203 и № 287 (табл. 1).
Как видно из таблицы, БКВ1 содержала основные протективные антигены двух вакцинных штаммов - № 305 серовар 1.2.0, ген коклюшного токсина ptx A2, ген пертактина prn1 и ген фимбрий fim2-1 и fim3A, № 203, серовар 1.2.3, ген коклюшного токсина ptx A4, ген пертактина prn1 и ген фимбрий fim2-1 и fim3A; БКВ2 содержала основные протективные антигены свежевыделенного штамма № 287 серовар 1.0.3, ген коклюшного токсина ptxA1, ген пертактина prn2 и ген фимбрий fim2-l и Ат3В; БКВ3 содержала антигены всех трех штаммов.
В первой серии опытов заражающая доза культуры B. pertussis тест-штамма № 18323 составляла 345ЛД50. При этом протективная активность БКВ1 составила 9,0 МЗЕ/мл, БКВ2- 10,3 МЗЕ/мл (различия не достоверны) и БКВ3 - 19,3 МЗЕ/мл (различия с БКВ1 и БКВ2 статистически достоверны). Таким образом, все испытанные препараты БКВ обладали протективной активностью и содержали не менее 8 МЗЕ/мл, что соответствует требованиям ВОЗ.
При повторном исследовании протективных свойств БКВ1, БКВ2 и БКВ3 заражающая доза
вирулентной культурой B. pertussis штамм № 18323 составила 3846LD50. Как следует из данных таблицы 1, защитные свойства при таких условиях БКВ1 были на уровне 7,0 МЗЕ/мл, БКВ2 - 4,6 МЗЕ/мл, БКВ3 - 9,2 МЗЕ/мл. В этом опыте защитные свойства проявила только БКВ3, состоящей из смеси штаммов.
Все три препарата были исследованы на безвредность в тесте изменения массы тела мышей, которым вводили белок в дозе 25 мкг, что соответствует одной иммунизирующей дозе, рекомендуемой для человека (см. табл. 1). Все препараты были безвредны в испытанной дозе, поскольку прибавка веса по отношению к контролю составляла более 60%, что в соответствии с руководством по доклиническому исследованию коклюшных вакцин и анатоксинов свидетельствует об отсутствии токсичности у испытуемых БКВ [11, 12].
Также были изучены сенсибилизирующие свойства БКВ1, БКВ2 и БКВ3. Мышей, иммунизировали вакцинами в дозах 25, 50 и 100 мкг белка и отраслевым стандартным образцом ГСА коклюшной вакцины (ОСО-5), начиная с 10 ME в объеме 0,5 мл, через 12 дней мышам внутрибрюшинно вводили гистамин гидрохлорид в дозе 2,5 мг/мышь в объеме 0,5 мл, контрольной группе животных - 0,5 мл физиологического раствора. Через сутки гибели животных не было и ГСД50 (50% гистаминсенсиби-лизирующая доза) составляла более 100 мкг, что в четыре раза превышала иммунизирующую дозу для человека (25мкг). ГСД50 1,698 МОЕ/мл.
Следует отметить, что все исследованные препараты БКВ обладали протективными свойствами. При заражающей дозе 345LD50БКВ1 (из вакцинных штаммов) и БКВ2 (из свежевыделенного штамма B. pertussis) обладали равной протективной активностью (9,1 и 10,3 МЗЕ/мл соответственно), хотя отличались по типам коклюшного токсина, пертактина и фимбриям (fim3B). Препарат БКВ3, содержащий антигены вакцинных и свежевыде-ленного штаммов, обеспечил увеличение протек-тивных свойств в два раза - 19,9 МЗЕ/мл. При высокой дозе заражения требуемым уровнем защиты обладала только БКВ3 - 9,2 МЗЕ/мл, что свидетельствовало о ее более выраженных протективных свойствах. Необходимо подчеркнуть, что БКВ3 была идентична БКВ1 по наличию в ее составе агглютиногенов 1, 2 и 3, однако в отличие от последней включала в себя три типа коклюшного токсина, два типа пертактина и ген фимбрий (fim3B), характерный для циркулирующих штаммов, что может свидетельствовать о наличии связи между протективной активностью БКВ и генетическими типами коклюшного токсина, пертактина и фимбрий в их составе. Иммунитет к коклюшу опосредован активацией антигенспецифических Т-хелперов 1 типа, продуцирующих определенный набор ци-токинов и синтезом антител к различным антигенам B. pertussis. Изменения генов КТ, пертактина и фимбрий циркулирующих штаммов B. pertussis
Таблица 1.
Генетическая характеристика штаммов B. pertussis и биологические свойства бесклеточных вакцин, созданных на их основе
Генетическая характеристика штаммов Биологические свойства вакцин
Препарат БКВ Заражающая доза тест-штамма Протектив-ная активность (МЗЕ/ мл) Изменения массы тела мышей
(штаммы ) fim 2, 3 ген ptxA ген ргп ген прирост массы в г в % по отношению к контролю**
БКВ1 345 LD50 3846 LD50 9,0 7,0 3,0 ±0,1 81
305 (1.2.0)* 203 (1.2.3) fim2-1 fim3A fim2-1 fim3A ptxA2, ptxA4 prni prnl
БКВ2 345 LD50 3846 LD50 10,3 4,6 2,9 ±0,1 78
287 (1.0.3) 3 — 1 ptxAl prn2
БКВ3 345 LD50 3846 LD50 19,3 9,2 2,9 ±0,1 78
305 (1.2.0) fim2-1 fim3A ptxA2, prnl
203 (1.2.3) fim2-1 fim3 А ptxA4 prnl
287 (1.0.3) 3 — 1 ptxA1 prn2
*серовар штаммов B. pertussis **физиологический раствор
обусловлены мутациями, приводящими к изменению аминокислотного состава кодируемых этими генами белков и формированию в их составе новых антигенных детерминант. В соответствии с этим, усиление протективного эффекта БКВ из вакцинных и свежевыделенного штамма можно объяснить стимуляцией клеточного и гуморального иммунитета к более широкому спектру анти-генноактивных структур в составе КТ, пертактина и фимбрий.
Все препараты были безвредны в опытах на животных в одной иммунизирующей дозе для человека и не обладали гистаминсенсибилизирующим действием даже при введении четырех доз.
Полученные результаты указывают на перспективность включения в состав БКВ вакцинных и свежевыделенного штаммов B. pertussis с различными генетическими типами коклюшного токсина, пертактина и фимбрий.
Выводы.
1. Все исследованные типы БКВ обладали протек-тивной активностью, соответствующей требованиям ВОЗ.
2. БКВ1 из смеси штаммов и БКВ2 из свежевыделенного штамма обладали равной протективной активностью - 9,0 и 10,3 МЗЕ/мл соответственно при заражающей дозе 345LD50.
3. Препарат БКВ3, содержащий генотипы коклюшного токсина, пертактина и фимбрий из смеси штаммов и свежевыделенного штамма, обеспечил увеличение протективных свойств в два раза - 19,3 МЗЕ/мл. При заражении дозой 3846LD50, десятикратно превыщающей требуемую, только БКВ3 обладал протективной активностью - 9,2 МЗЕ/мл.
4. Показана перспективность включения в состав БКВ протективных антигенов, выделенных как из производственных, так и циркулирующих штаммов.
Литература
1. Шинкарев А.С., Мерцалова Н.У, Мазурова И.К. , Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н. и др. Современные штаммы B. pertussis: иммунобиологические свойства и совершенствование вакцин. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; 4: 20 - 25.
2. Bouchez V., Hegerle N., Strati F., Njamkepo E., Guiso N. new Data on Vaccine Antigen Deficient Bordetella pertussis Isolates. Vaccines (Basel). 2015; Sept 14; 3 (3):751 - 70.
