CC BY
51
Проведенный нами анализ функциональных ОірЛЛЬрКЛ у культуры Иг-6 подавляется спе-
групп активного центра показал, что активность цифическим ингибитором сериновых протеиназ
внеклеточных протеиназ по субстрату - фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ).
Таблица 2
Ингибиторный анализ функционального центра
Ингибитор Ур-6
ФМСФ 1 (ст.) 9,7
ЕДТА 94
IAA 100
ДТТ 96
Спирт 98
Ингибиторы цистеиновых протеиназ - йод-ацетамид (ИАА) и металлопротеиназ - этилен-диаминтетраацетат (ЭДТА) либо совсем не оказывали влияния на активность, либо подавляли активность в незначительной степени (табл. 2). Представленные данные вместе с данными о предпочтительном субстрате исследуемых ферментов позволяют отнести их к классу серино-вых протеиназ субтилизиноподобного типа.
Литература
1. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика: пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
2. Кевбрин В.В. Термофильные алкакофильные микроорганизмы // Тр. Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского. Вып. 14: Алкалофильные микробные сообщества. - М.: Наука, 2007.- С. 374-396.
3. Ward O.P. Proteolytic enzymes. In. M. Moo-Young Editor. Comprehencive Biotechnol. - 1985. - V.3. - P. 789-818.
4. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.
Лаврентьева Елена Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший преподаватель кафедры экспериментальной биологии БГУ, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, факс: 8(3012)43-30-34; 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, БГУ, тел. (деканат): 8(3012)21-15-93, факс: 8(3012)21-05-88, е-mail: lena [email protected]
Раднагуруева Арюна Арсалановна - аспирант Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, е-mail: aryuna [email protected]
Намсараев Баир Бадмабазарович - доктор биологических наук, зав. лабораторией микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, зав. кафедрой экспериментальной биологии БГУ, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, факс: 8(3012)43-30-34; 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, БГУ, тел. (деканат): 8(3012)21-15-93, факс: 8(3012)21-05-88, е-mail: bair [email protected]
Lavrentieva E/ena Vladimirovna - candidate of biological sciences, research worker of ICEB SD RAS, microbiology laboratory, tel.: 8(3012)43-49-02, [email protected]
RadnaguruevaAryunaArsa/anovna- post-graduate student of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, tel.: 8(3012)43-49-02, e-mail: [email protected]
Namsaraev Bair BadmabazarovicA - professor, doctor of biological sciences, head of department of experimental biology, BSU, head of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, tel.: 8(3012)43-49-02, tel.: 8(3012)21-15-93.
УДК 582.28: 577.15 И.П. Осипова, А.Б. Инкежинова, Э.В. Данилова
ПРОТЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ МИНЕРАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ ВОСТОЧНЫХ САЯН*
* Работа выполнена при финансовой поддержке грантов МО РФ РНП.2.1.1./2165,
СО РАН № 58 и № 95, РФФИ № 10-04-01185а
Определена протеазная активность бактерий минеральных источников Восточных Саян. Показано, что внеклеточная протеаза активизируется на 3 и 4 сутки в матах и на в 2 сутки в иле.
Ключевые слова.'минеральные источники, маты, ил, внеклеточная протеаза, бактерии.
I.P. Osipova, A.B. Inkezhinova, E.V. Danilova PROTEASE ACTIVITY OF MINERAL SPRINGS OF THE EASTERN SAYANS
The article describes protease activity of bacteria in mineral springs of the Eastern Sayans. Extracellular proteaza is activated in mats on the third or the fourth day, and in the silt it becomes active on the second day.
Key words: mineral springs, mats, silt, extracellular proteaza, bacteria.
Оптимальными местами обитания для различных групп микроорганизмов и их сообществ являются горячие и холодные выходы минеральных вод в горной системе Восточных Саян (Хойто-Гол, Жойгон). Ранее проведенные исследования позволили выявить, что именно микробные маты и донные отложения (ил) данных источников являются местами их наибольшей активности [2].
Наиболее широко распространенная и активно функционирующая в исследуемых минеральных источниках группа протеолитических бактерий синтезирует протеазы, входящих в число наиболее интенсивно изучаемых ферментов.
Интерес к ним не ослабевает не только в связи с их коммерческой значимостью, но и с широким применением в фундаментальных исследованиях [3].
Целью исследования являлось определение внеклеточной протеазной активности в культурах протеолитических бактерий в микробных матах и илах гидротерм Хойто-Г ол и Жойгон.
Задачами исследования являлись определение численности и активности роста биомассы бактерий в течение времени инкубации; выделение бактерий в чистую культуру, определение протеазной активности в динамике.
Объекты и методы исследования
В качестве объекта исследований были использованы накопительные и чистые культуры протеолитических бактерий, выделенные из микробных матов и илов изучаемых источников.
Посевной материал выращен на среде Пфеннига с добавлением пептона в качестве субстрата [1]. Чистые культуры получали на плотной питательной среде того же состава. Ежедневно посевы просматривали и подсчитывали число выросших колоний и отбирали для дальнейших пересевов колонии всех морфотипов, которые высевали на «скошенный» агар с целью получения чистой культуры бактериального изолята. Изучение морфологических, культуральных
свойств проводили по методам описанным ранее [1, 2].
Для определения протеолитической активности культуральную жидкость (КЖ) отбирали через каждые 24 часа в течение 5 суток. КЖ была использована из третьего и четвертого разведений. Биомассу отделяли от КЖ центрифугированием. Затем в КЖ добавляли 0,0025% азида натрия, препятствующего развитию микроорганизмов. Хранение осуществляли при + 4оС. Общую протеолитическую активность определяли
по белковому субстрату - азоказеину и желатине. Метод основан на взаимодействии тринит-робензосульфокислоты (ТНБС) со свободными аминными группами пептидов и аминокислот, приводящем к окрашиванию продуктов реакции в желтый цвет, пропорционально количеству вступивших в реакцию КН2-групп. В реакционную смесь входили 15G мкл G,5% водного раствора желатина, 1GG мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0) и 5G мкл культуральной жидкости. В качестве контроля использовали смесь, состоящую из 15G мкл желатина и 15G мкл буфера. Образцы инкубировали в термостате при 37оС в течение ночи. На следующий день реакцию останавливали добавлением 3GG мкл 1G% трихло-руксусной кислоты и образцы выдерживали 30 мин на холоде. Образовавшийся осадок оставшегося белка удаляли центрифугированием. Затем в супернатант добавляли 4GG мкл свежеприготовленного 0,5М NaOH. Интенсивность окраски полученных образцов измеряли на спектрофотометре при длине волны 440 нм.
Результаты
Численность протеолитических бактерий во всех отобранных пробах достигала 1 млн кл/мл и постоянно была на 2-3 порядка выше по сравнению с количеством остальных бактерий-деструкторов.
Протеолитические бактерии при росте на агаризованной среде образуют колонии трех морфологических типов с преобладанием одного (III морфотип) варианта. I морфотип - колонии диаметром до 10 мм, слабовыпуклые, белые; II морфотип - колонии диаметром 15 мм, глянцевые; III морфотип - колонии до 3-4 мм, круглой формы с ровными краями, белые, слабовыпуклые.
Из преобладающего III морфотипа получена чистая культура бактерий и по своим морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам была близка к роду Bacillus sp.^^. 1)
Рис. 1. Bacillus sp.
И.П. Осипова, А.Б. Инкежинова, Э.В. Данилова. Протеазная активность бактерий минеральных источников Восточных Саян
Результаты исследований показали, что максимум протеазной активности обоих разведений в пробах Жойгона приходился на 3 сутки (Б 0,118 и 0,125). Активность сохранялась еще на одни сутки, затем происходил спад. Максимальный рост биомассы происходил на 5 сутки. В пробе микробного мата гидротермы Хойто-Гол максимальная активность выявлена на 4 сутки (Б 0,144 и 0,124). Максимальный рост биомассы также наблюдался на 5 сутки (рис. 2 и 3). Необходимо отметить, что разведения не играют существенной роли и показывают себя как повторности опытных проб. Активность протеазы и рост биомассы были идентичными.
Протеазная активность в иле (рис. 4) показала, что фермент становится активным уже на 2 сутки и данные значения наблюдаются на 3 и 4 сутки определения в отличие от активности в микробных матах. Рост биомассы достигает максимальных значений на 4 и 5 сутки.
Проба №2 Jg 3-0B
Рис.3. Протеазная активность бактерий в пробах микробных матов Хойто-Г ол
- Разведение II (протеазн. активность) Разведение III (протеазн. активность) Разведение II (биомасса)
- Разведение III (биомасса)
Рис.2. Протеазная активность бактерий в пробах микробных матов Жойгона
Проба №1 Jg5
о,
о,
Л
Б о,
о
£ о,
о
с о,
к
S о,
о
? о,
s
Ё о,
° о, о,
- Разведение I (протеазн. активность) Разведение I (протеазн. активность)
- Разведение I (биомасса)
- Разведение I (биомасса)
3 4 б
Сутки
Рис.4. Протеазная активность бактерий в пробах из ила источника Хойто-Гол
Таким образом, анализ полученных данных показал, что внеклеточная протеаза активизируется на 3 и 4 сутки в матах, а в иле фермент становится активным уже на 2 сутки. Максимальный рост биомассы в микробных матах наблюдается на 5 сутки, а в иле объем биомассы достигает максимального значения на 4 сутки.
Литература
1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: Элеватор, 2000. - 512 с.
2. Данилова Э.В., Бархутова Д.Д., Брянская А.В., Намса-раев З.Б., Намсараев Б.Б. Влияние экологических условий на распределение функциональных групп микроорганизмов в минеральных источниках Хойто-Гол (Восточные Саяны) // Сибирский экологический журнал. -2009. - №1. - С. 45-53.
3. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика: пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
4. Романенко В.И., Кузнецова С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. - Л.: Наука, 1974. - 194 с.
2
б
7
Осипова Ирина Павловна - аспирант кафедры общей и экспериментальной биологии Бурятского государственного университета, 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, тел.: 8 (3012) 21-15-93.
Инкежинова Анна Борисовна - студент 5 курса биолого-географического факультета Бурятского государственного университета, 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, тел.: 8 (3012) 21-15-93.
Данилова Эржена Викторовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ИОЭБ СО РАН, лаборатория микробиологии, 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
Osipova Irina Pavlovna-post-graduate student of BSU, Ulan-Ude, Smolina str., 24a, 670000, tel.: 8 (3012) 2115-93, e-mail: [email protected]
Inkezhinova Anna Borisovna - five year student of BSU, faculty of biology and geography, Ulan-Ude, Smolina str., 24a, 670000, 8 (3012) 21-15-93.
Dani/ova Erzhena Viktorovna - cand. of biological sciences, senior research worker of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str.,6, e-mail: [email protected]
УДК 576.8 (571.54+571.55) З.М. Потапова, Д.Д. Цыренова, Б.Б. Намсараев
СТРУКТУРА ВИДОВОГО СОСТАВА АЛКАЛОФИЛЬНЫХ И ТЕРМОФИЛЬНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ЗАБАЙКАЛЬЯ*
* Работа выполнена при поддержке грантов Министерства образования и науки РФ №РНП 2.1.1/2165, Научно-образовательного центра «Байкал», РФФИ № 08-05-00968-а.
Был проведен анализ видового состава цианобактерий экстремальных систем Забайкалья с помощью коэффициента флористической общности. В зависимости от физико-химических условий, существующих в экосистемах, формируются разнотипные цианобактериальные сообщества.
Ключевые слова: видовой состав, алкалофильные, термофильные цианобактерии, коэффициента флористической общности.
Z.M. Potapova, D.D. Tsyrenova, B.B. Namsaraev STRUCTURE OF SPECIFIC COMPOSITION OF ALCALOPHILIC AND TERMOPHILIC CYANOBACTERIA OF ZABAIKALIE
The analysis of species composition of cyanobacteria of extreme systems of Zabaikalie by means of coefficient of floristic generality was carried out. Polytypic cyanobacterial communities are formed in depence on physical-chemical conditions existing in ecosystems.
Key words: specific composition, alcalophilic and termophilic cyanobacteria, coefficient of floristic generality.
Введение
Любые организмы, живущие на Земле, занимают определенное и уникальное место в составе биоценозов. Однако роль некоторых групп, в частности цианобактерий, в эволюции и существовании биосферы представляется особенно значительной. В процессе эволюции цианобактерии не только создали условия, необходимые для возникновения и жизни эукариот, но и являлись предками хлоропластов растений [6]. Возрастание интереса к экстремофильным цианобактериям связано также с применением их в биотехнологии [14].
В настоящее время цианобактерии широко распространены в экстремальных местах обитания, таких как термальные источники и содовосоленые озера, где они являются основными продуцентами органического вещества и активно участвуют в круговороте биогенных элементов.
Целью наших исследований было определение и анализ видового разнообразия алкало-фильных и термофильных цианобактерий экстремальных экосистем Забайкалья.
Материалы и методы исследования
Исследования изученных водоемов были проведены с 2001 по 2009 г. Изученные содовосоленые озера географически делятся на две группы: озера Селенгинской Даурии (Республика Бурятия) -Сульфатное, Белое, Верхнее Белое, Соленое, и озера Онон-Борзинского бассейна (Забайкальский край) - Зун Торей, Борзинское, Бабье, Саган Нур, Хилганта, Зун Холво, Ехэ Тором. Исследованные гидротермы расположены в Курумканском, Баргузинском районах и Байкальской области: Гаргинский, Аллинский,
Уринский, Сеюйский, Горячинский, Баунтов-ский и Гусихинский источники.
Определение физико-химических параметров и отбор проб для микробиологических исследований проводили по общепринятой методике [1], [2], [10]. Определение таксономической принадлежности цианобактерий на основании морфологических признаков проводили по Еленкину и Голлербаху [5], [7] и уточняли по Комареку и Анагностидису [12], [13]. Для оценки сходства или различия таксономического спектра цианобактерий был применен коэффициент флористической общности Жаккара, модифицированный Малышевым [9].
