CC BY
72
пролиферация И ДИффЕРЕНЦИРОВКА ЭНДОКРИНОЦИТОВ крысы при экспериментальном диабете
М.С. Калигин 1, М.О. Мавликеев1, А.А. Титова1, А.С. Плюшкина12, М.А. Титова1, А.А. Гумерова1, А.П. Киясов12
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Proliferation and transdifferentiation of endocrinocytes of the rat during experimental diabetes
M.S. Kaligin 1, M.O. Mavlikeev1, AA. Titova 1, A.S. Plushkina 12, MA. Titova 1, AA. Gumerova 1, A.P. Kiassov12
1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
В ряде исследований было установлено увеличение числа а-клеток при экспериментальном диабете, что может быть причиной повышения уровня глюкозы в крови наряду с недостатком инсулина . При этом механизмы увеличения количества глюкагон-позитивных клеток остаются неизученными . Целью исследования стало изучение про-лиферативной активности и возможности дифференци-ровки а- и р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы при экспериментальном диабете у крыс . Работа выполнена на 33 белых беспородных крысах самцах, у которых после введения аллоксана определяли уровень глюкозы в сыворотке крови, а также изучали экспрессию инсулина, глюкагона и ядерного антигена пролиферирующих клеток . Уровень глюкозы определяли в сыворотке крови глюкозооксидазным методом . Единичные пролиферирую-щие глюкагон-позитивные клетки были обнаружены только на 14 сут . эксперимента . На этих же сроках эксперимента обнаружены бигормональные клетки, синтезирующие инсулин и глюкагон Результаты двойного окрашивания на РСЫА и глюкагон показали, что увеличение числа глюка-гон-позитивных клеток на ранних сроках экспериментального диабета не связано с их пролиферацией и, вероятно, объясняется дифференцировкой клеток-предшественниц инсулоцитов поджелудочной железы
Ключевые слова: поджелудочная железа, сахарный диабет, регенерация, пролиферация, региональные стволовые клетки
Some studies have found an increase number of a-cells in experimental diabetes, which may cause rising of blood glucose levels, along with the lack of insulin . But the mechanism of increasing the amount of glucagon-positive cells is still unknown . The aim of the study was to investigate the proliferative activity and the possibility of differentiation of a- and p-cells of the islets of Langerhans of pancreas during experimental diabetes in rats The work was performed on 33 white mongrel male rats . After alloxan injection, blood glucose levels were measured by glucose oxidase method and the expression of insulin, glucagon, and proliferating cell nuclear antigen was studied . Isolated proliferating glucagon-positive cells were found only on day 14 of the experiment . At the same time of the experiment bigormonal cells were found that synthesize insulin and glucagon The results of the double staining for PCNA and glucagon showed that the increasing number of glucagon-positive cells in early stages of experimental diabetes is not related to their proliferation Probably it is due to differentiation of the progenitor cells of the islets in pancreas
Keywords: pancreas, diabetes mellitus, regeneration, proliferation, regional stem cells .
Введение
Несмотря на многолетнее изучение сахарного диабета и поиск новых методов его лечения, это заболевания остаётся большой проблемой современной медицины . С каждым годом количество больных, страдающих сахарным диабетом, увеличивается . Если в 2011 г . в мире сахарным диабетом страдало 360 млн человек, то к 2030 г . количество больных может достигнуть 552 млн [1].
Успех в разработке новых методов лечения сахарного диабета определяется пониманием патогенеза данного заболевания . В настоящее время основной причиной гипергликемии при сахарном диабете I типа считается дефицит р-клеток островков Лан-герганса или их повреждение, что приводит к низкой концентрации инсулина и (или) нарушениям его функционирования . При этом роль другой клеточной популяции, а-клеток, и вырабатываемого ими кон-тринсулярного гормона глюкагона, в настоящее время практически не рассматривается . Однако в ряде исследований было установлено увеличение числа а-клеток при экспериментальном диабете, что также может быть причиной повышения уровня глюкозы в крови [2—5]. При этом механизмы увеличения
e-mail: mfkaligin@mail . ru
количества глюкагон-позитивных клеток остаются неизученными . Можно предположить, что оно может быть вызвано усилением пролиферативной активности дифференцированных а-клеток и(или) происходить за счёт пролиферации и дифференцировки клеток-предшественниц или других клеточных популяций . Также рядом исследователей высказывается мнение о возможности трансдифференцировки а- и Р-кпеток островков [6, 7]. Изучение этого вопроса позволит лучше понять природу сахарного диабета и в перспективе предложить новые подходы к его терапии путём регулирования межклеточных взаимодействий .
Целью исследования стало изучение пролифера-тивной активности и возможности дифференцировки и трансдифференцировки а- и р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы при экспериментальном диабете у крыс
Материал и методы
Исследование проведено на 33 белых беспородных крысах самцах массой 200—250 г, которые были разделены на группы . Животным 1 группы
внутрибрюшинно вводили аллоксан (Sigma-Aldrich, США) в 1 мл 0,02 М ацетатного буфера рН = 4,0 в дозе 180 мг/кг; животным 2 группы вводили ацетатный буфер (контроль действия растворителя) . Животные 3 группы — интактные . Через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28 сут . у животных забирали кровь для биохимического исследования, животных выводили из эксперимента и забирали поджелудочную железу для морфологического анализа . Парафиновые срезы поджелудочной железы окрашивали иммуно-гистохимически с коммерческими антителами против инсулина (Novocastra, клон 2D11-H5, США), глюкагона (DAKO, Дания), PCNA (DAKO, клон PC10, Дания). Для флуоресцентного окрашивания на глю-кагон были использованы вторичные кроличьи IgG, меченные Alexa Fluor 546, на инсулин — мышиные IgG, меченные Alexa Fluor 488 . Уровень глюкозы определяли в сыворотке крови глюкозооксидазным методом [8].
Количественные данные представлены в виде медианы (1—3 перцентиль), статистическая обработка результатов производилась с помощью критерия Вилкоксона в программном пакете STATISTICA 8 . 0 . Различия считали достоверными при p<0,05 .
Результаты и обсуждение
Через 1 сут . после введения аллоксана общее состояние животных первой группы значительно отличалось от состояния особей других групп . Животные становились вялыми, отмечены полидипсия, полиу-рия и отсутствие аппетита. Результаты эксперимента показали отсутствие изменений уровня глюкозы в крови крыс второй и третьей групп . После введения диабетогенного препарата первой группе уровень глюкозы в крови изменялся; динамика изменений представлена на графике (рис 1)
Рис. 1. Уровень глюкозы в сыворотке крыс до и на различных сроках после введения аллоксана, ммоль/л: * — статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем глюкозы (нулевые сутки);
** — статистически значимые различия по сравнению с первыми сутками (р<0,05)
Известно, что в норме клетки, секретирующие глюкагон, расположены по периферии островков поджелудочной железы крысы в 1—2 ряда . Через 1 сут . эксперимента при выраженной гипергликемии наблюдали увеличение числа глюкагон-позитивных клеток по периферии островков, количество их рядов клеток увеличивалось . Через 2—3 сут . эксперимента количество клеток, экспрессирующих глюкагон, продолжало расти . Даже в крупных островках на глюкагон были окрашены не только периферические отделы, но и центральные области . Такую картину наблюдали до конца эксперимента (рис . 2, 3) . Таким образом, результаты исследования подтвердили увеличение числа а-клеток при экспериментальном диабете у крыс . Очевидно, что этот факт имеет важное значение в патогенезе сахарного диабета и развитии гипергликемии, и его необходимо учитывать при разработке новых методов лечения этого заболевания
Одним из возможных механизмов, объясняющих рост числа а-клеток, может быть их пролиферация В обычных условиях в поджелудочной железе пролиферация наблюдается в единичных клетках островков и некоторых ацинусов (рис . 4А) . Через 1 сут . экспериментального диабета пролиферирующих клеток становится больше по сравнению с нормой (рис . 4Б) . В островках позитивно окрашенные ядра располагались равномерно по всему объему, в некоторых островках число пролиферирующих клеток доходило до 25—30 на срез островка . Также следует отметить, что размеры PCNA+ ядер были заметно меньше, чем у непролиферирующих клеток . Максимальное число пролиферирующих клеток в островках мы наблюдали через 1 сут экспериментального диабета, далее оно снижалось и через 7 сут . приближалось к норме . В ацинусах также было выявлено повышение числа пролиферирующих клеток до 3—4 в каждом ацину-се . При проведении двойного окрашивания на PCNA и глюкагон пролиферирующие глюкагон-позитивные клетки в островках обнаружены только на 14 сут эксперимента (рис 4В) До этого момента, несмотря на увеличение числа глюкагон-позитивных клеток, пролиферирующих клеток среди них не было . У интактных животных таких клеток также обнаружено не было .
Результаты исследования демонстрируют, что пролиферация в ткани поджелудочной железы происходит как в норме, так и при экспериментальном диабете Результаты двойного окрашивания на PCNA и глюкагон показали, что увеличение числа глюкагон-позитивных клеток на начальных сроках экспериментального диабета не связано с их пролиферацией . Единичные пролиферирующие глюка-гон-позитивные клетки были обнаружены только на 14 сут эксперимента Очевидно, что процессы пролиферации не играют значимой роли в увеличении числа а-клеток при экспериментальном диабете Однако возникает закономерный вопрос: к какому клеточному типу можно отнести пролиферирующие клетки островков? Ранее нами было показано, что Р-клетки проявляют пролиферативную активность в первые трое суток экспериментального диабета, однако PCNA+/инсулин+ клетки были единичными [9], тогда как в целом пролиферативная активность клеток островка в это время довольно высокая . Логично предположить, что в пролиферацию вступают прогениторные клетки островков, которые затем дифференцируются в а-клетки, чем и объясняется увеличение их количества на этих сроках экспериментального диабета
*ШШРШША . Л
Рис. 2.
Глюкагон-позитивные клетки в поджелудочной железе крысы в норме и при экспериментальной гипергликемии: А — норма; Б — через 3 сут.; В — через 5 сут.; Г — через 14 сут.
ИГХ-реакция с антителами к глюкагону.
Продукт реакции красного цвета. Докраска ядер — гематоксилин. Ув. х200
Пгкхцадь глюкагам+ клеток, мкм-
Рис. 3.
Площадь глюкагон-позитивных клеток на срезах поджелудочной железы крыс без введения и на различных сроках после введения аллоксана, мкм2. Различия статистически значимы между всеми значениями кроме 0 и 2 сут., 1 и 7 сут., 14 и 21 сут., 21 и 28 сут.
Рис. 4. PCNA-позитивные ядра красного (А, Б) и синего (В) цвета в инсулоцитах и ацинарных клетках поджелудочной железы крысы: А — норма;
Б — 1 сут. гипергликемии;
В — двойное окрашивание на PCNA (синий цвет) и глюкагон (красный цвет), 14 сутки; пролиферирующие а-клетки показаны стрелками.
ИГХ-реакции с антителами к PCNA и глюкагону.
Докраска ядер — гематоксилин. Ув.: А х400, Б х200, В х1000
Поскольку было установлено, что пролиферация не играет существенной роли в возрастании числа а-клеток, далее нами был рассмотрен другой предполагаемый исследователями вариант объяснения этого события — трансдифференцировка а- и р-клеток [6, 7]. Изучение динамики популяции инсулин-позитивных клеток позволило установить, что через 1 сут экспериментальной гипергликемии в островках уменьшается количество этих клеток, в центре островков появлялись инсулин-негативные участки . Через двое суток эксперимента инсулин-позитивные клетки стали единичными, и такая картина сохранялись до конца эксперимента (рис 5, 6) В неокрашенных клетках сохранялась четкая структура ядер, признаков некроза р-кпеток, которые описываются при воздействии аллоксана [8, 10], на светооптическом уровне мы не наблюдали
Интересно, что при сопоставлении результатов морфометрических исследований серийных срезов, окрашенных на инсулин и глюкагон, оказалось, что в островках некоторых образцов сумма площадей инсулин- и глюкагон-позитивных частей островка была больше, чем полная площадь островка, то есть инсулин- и глюкагон-позитивные области частично перекрывали друг друга . Очевидно, это объясняется тем, что при экспериментальном диабете в островках появляются клетки, одновременно синтезирующие оба гормона — инсулин и глюкагон . Это предположение было подтверждено при двойном иммунногистохи-мическом окрашивании на инсулин и глюкагон . Коэк-спрессия клетками инсулина и глюкагона также была показана с помощью двойного иммунофлуоресцент-ного окрашивания (рис . 7) . В норме такие клетки не обнаружены
Рис. 5.
Инсулин-позитивные клетки в поджелудочной железе крысы в норме и при экспериментальной гипергликемии: А — норма; Б — через 1 сут.; В — через 2 сут.; Г — через 28 сут.
ИГХ-реакция с антителами к инсулину. Продукт реакции красного цвета. Докраска ядер — гематоксилин. Ув.: А, В х400, Б, Г х200
Рис. 6.
Площадь инсулин-позитивных клеток на срезах поджелудочной железы крыс без введения и на различных сроках после введения аллоксана, мкм2
* — статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем глюкозы (нулевые сут.),
** — статистически значимые различия по сравнению с 1-ми сутками,
*** — статистически значимые различия по сравнению со 2-ми сутками,
& — статистически значимые различия по сравнению с 3-ми сутками,
# — статистически значимые различия по сравнению с 5-ми сутками,
§ — статистически значимые различия по сравнению с 7-ми сутками (p<0,05)
Б ^
5 ^V- * . **
глюкагон - РЛР! 1———■
Д. •1 "ж ■ .р
• .4 '•'
'' ' "1 >
ж. л ■ Л ■5 ИДОч г *
. V" У -
инсулин — глюкагон/ инсулин
Рис. 7. Коэкспрессия инсулина и глюкагона инсулоцитами при экспериментальном диабете: А — двойное иммунногистохимическое окрашивание на инсулин (синий цвет) и глюкагон (красный цвет) поджелудочной железы крысы при экспериментальном диабете, 3 сут. эксперимента, стрелка — эндокриноциты, содержащие оба гормона;
Б — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на глюкагон (красный) и инсулин (зеленый) в поджелудочной железе крысы при аллоксановом диабете, 14 сут. эксперимента, докраска ядер — DAPI. Ув. х1000
Учитывая полученные результаты, мы предполагаем как минимум три механизма увеличения числа а-клеток при экспериментальном диабете у крыс . Как было отмечено выше, пролиферирующие клетки островка, вероятнее всего, представляет собой пул прогениторных клеток. Одновременное увеличени-ечисла глюкагон-позитивных клеток и распространение их вглубь островка позволяет предположить, что прогениторные клетки-предшественницы после пролиферации начинают дифференцироваться в глюкагон-позитивные а-клетки . Установленный же нами факт появления бигормональных глюкагон+/ инсулин+ клеток свидетельствует о возможности последующей дифференцировки вновь образованных а-клеток в р-кпетки . Таким образом, последовательность событий в островках при регенерации поджелудочной железы, вызванной аллоксаном, в целом соответствует событиям, развертывающимся в ходе пренатального развития инсулоцитов человека, дифференцирующихся из С-к^-позитивных клеток эпителия протоков поджелудочной железы . Эти клетки выселяются из протоков, образуют островки и являются предшественницами а- и Р-клеток, причем С-к^-позитивные клетки дифференцируются в р-клетки через стадию глюкагон-по-зитивных а-клеток [11]. Также через глюкагон-про-дуцирующую стадию С-к^-позитивные клетки могут дифференцироваться в р-клетки и при экспериментальном диабете у крыс [2, 3]. Однако остаются неизвестными сроки восстановления клеточного состава островков при экспериментальном диабете, и этот вопрос требует обязательного изучения
Другим механизмом, обеспечивающим увеличение количества а-клеток, является их пролиферация Однако этот путь включается на поздних сроках
эксперимента (после 14 сут . ), и, вероятно, имеет минимальное значение
Наконец, учитывая снижение числа р-клеток при отсутствии признаков их некроза, можно предположить возможность трансдифференцировки этих клеток в а-клетки, что подтверждается результатами других исследователей [6, 7]. Так, на трансгенных Zebгafish, у которых а-клетки были мечены GFP, а р-клетки — dsRed, было показано, что после разрушения р-клеток метронидазолом через некоторое время новые р-клетки имели метку (GFP), которая до этого была только у а-клеток [6]. Похожие результаты исследователи получили в эксперименте на мышах [7]. Авторы высказали предположение, что полученные данные отражают процесс трансдиффе-ренцировки а-клеток в р-клетки . Одним из ключевых факторов, играющих роль в этом процессе, авторы называют транскрипционный фактор Pdx1, который сам или в сочетании с другими факторами способен, например, стимулировать гепатоциты [12, 13] и ацинарные клетки поджелудочной железы [14] к синтезу инсулина . Pdx1 связывается непосредственно с промоутерами инсулина и глюкагона [15] таким образом, что это приводит к ингибированию экспрессии глюкагона и индуцированию транскрипции инсулина [16]. К другим факторам перепрограммирования можно отнести, например, N1^6 . 1, который также может внести свой вклад в ингибиро-вание гена глюкагона и активацию генов р-клеток [16] или Рах4, который регулирует баланс между а- и р-клетками путем противодействия с Агх в эндокринных клетках предшественницах [17]. При этом необходимо отметить, что все перечисленные факторы играют роль в дифференцировке клеток поджелудочной железы в период её пренатального
развития [18, 19]. В нашем эксперименте, вероятно, мы наблюдали обратный процесс, и часть р-клеток трансдифференцировалась в а-клетки . Возможное участие в этом процессе указанных выше факторов и их значение еще предстоит установить, однако уже сейчас становится понятно, что а- и р-клетки обладают значительной пластичностью фенотипа, и поэтому при разработке новых методов лечения сахарного диабета открывается перспектива поиска методов направленного воздействия на клетки этих популяций путем стимуляции или репрессии генов,
кодирующих определенные транскрипционные факторы или другие регуляторные белки
Благодарности
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Whiting D . R ., Guariguata L . , Weil С . et al . IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030 . Diabetes Res . Clin . Pract . 2011; 94(3): 311-21.
2 . Плюшкина А.С., Калигин М . С., Андреева Д. И . и др . C-kit-позитивные клетки островков поджелудочной железы крысы как клетки-предшественницы эндокриноцитов при аллоксановом диабете . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; VII(3): 138-41.
3 . Калигин М . С ., Плюшкина А . С ., Титова А .А . и др . С-kit и дес-мин-позитивные клетки в регенерации островков поджелудочной железы при экспериментальном диабете у крыс . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; VIII (3): 113-5 .
4 . Habener J . F ., Stanojevic V . а-cell role in p-cell generation and regeneration . Islets 2012; 4(3): 188-98 .
5 . Алеева Г . Н ., Киясов А . П ., Миннебаев М . М . и др . Динамика В- и А-клеточной популяций поджелудочной железы и содержания глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете . Бюл . эксперим . биол . мед. 2002; 133(2): 151-3 .
6 . Ye L ., Robertson M .A ., Hesselson D . et al . Glucagon is essential for alpha cell transdifferentiation and beta cell neogenesis . Dev . 2015; 142(8): 1407-17 .
7 . Thorel F ., №pote V ., Avril I . et al . Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss . Nature 2010; 464(7292): 1149-54 .
8 . Орехович В . Н . Современные методы в биохимии . М . : Наука; 1977, 392 .
9 . Калигин М . С ., Титова А.А., Плюшкина А. С . Пролиферация клеток поджелудочной железы при экспериментальном диабете Гены и Клетки 2014; 9 (3): 85-8 .
10 . Lenzen S . The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes . Diabetologia 2008; 51(2): 216-26 .
11. Калигин М . С ., Гумерова А .А, Титова М . А. и др . C-kit маркёр стволовых клеток эндокриноцитов поджелудочной железы . Морфология 2011; 140 (4): 32-7 .
12 . Li W . C . , Horb M . E ., Tosh D . et al . In vitro transdifferentiation of hepatoma cells into functional pancreatic cells . Mech . Dev . 2005; 122(6): 835-47 .
13 . Fodor A., Harel C . , Fodor L . et al . Adult rat liver cells transdifferentiated with lentiviral IPF1 vectors reverse diabetes in mice: an ex vivo gene therapy approach . Diabetologia 2007; 50(1): 121-30 .
14 . Zhou Q ., Brown J ., Kanarek A . et al . In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells . Nature 2008; 455(7213): 627-32 .
15 . Chakrabarti S . K . , James J . C . , Mirmira R . G . Quantitative assessment of gene targeting in vitro and in vivo by the pancreatic transcription factor, Pdx1 Importance of chromatin structure in directing promoter binding . J . Biol . Chem . 2002; 277(15): 13286-93 .
16 Schisler J C, Jensen P B , Taylor D G et al The Nkx6 1 homeodomain transcription factor suppresses glucagon expression and regulates glucose-stimulated insulin secretion in islet beta cells PNAS USA 2005; 102(20): 7297-302 .
17 Collombat P , Mansouri A , Hecksher-Sorensen J et al Opposing actions of Arx and Pax4 in endocrine pancreas development . Genes Dev . 2003; 17(20): 2591-603 .
18 Jonsson J , Carlsson L , Edlund T et al Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice . Nature 1994; 371: 606-9 .
19 . Collombat P ., Hecksher-S0rensen J ., Serup P . , Mansouri A. Specifying pancreatic endocrine cell fates . Mech . Dev . 2006; 123; 501-12 .
Поступила: 21.09.2015
