CC BY
58
Обзоры
155
ПРОГРАММИРУЕМЫЕ БИОПОЛИМЕРНЫЕ МИКРО-И НАНОКОНТЕЙНЕРЫ ДЛЯ БИОКОМПЬЮТЕРОВ
С. Ерохина 12, Л. Пасторино 2, В. Сорокин1, В. Ерохин 13
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Генуезский университет, Генуя, Италия
3 Институт материалов для электроники и магнетизма, Парма, Италия
Programable biopolymeric micro- and nanocontainers for biocomputers
S. Erokhina 12, L. Pastorino 2, V. Sorokin 1, V. Erokhin 13
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 University of Genoa, Genoa, Italy
3 Institute of Materials for Electronics and Magnetism, Parma, Italy
Полимерные капсулы (контейнеры) широко исследуются в областях, связанных с разработкой новых лекарственных препаратов. В настоящей работе представлены данные, позволяющие рассматривать вышеуказанные объекты в качестве важных элементов биокомпьютеров, позволяющих, в частности, осуществлять направленную доставку и контролируемый запуск «главной программы» (специфические молекулы, белки, клетки) в областях с системными сбоями (нарушения работы), вызванной нежелательными реакциями. Мы также рассматриваем перспективы использования клеток в качестве пакета программ, способного осуществлять параллельную многофункциональную обработку информации в биокомпьютерах при условии того, что они будут доставлены в нужное место и активированы в нужный момент времени.
Ключевые слова: полимерные капсулы, биокомпьютер, направленная доставка, контролируемый запуск.
Нетрадиционные компьютеры представляют расширяющуюся область исследования, направленную на изучение новых материалов и принципов работы, позволяющих обеспечить в будущем реализацию новых типов вычислительных систем, способных к обучению и решению специфических задач. Существуют несколько подходов к реализации нетрадиционных компьютеров. Например, мемристоры и мемристорные приборы [1—5] широко используются в настоящее время для осуществления биоподобных цепей и сетей обработки информации, в которых они играют роль электронных аналогов синапсов [6—8]. Еще одно направление основано на использовании простых живых организмов для осуществления специфических вычислительных функций. Например, микомицет Physarum polycephalum широко используется для выполнения задач, связанных с оптимизацией и для построения диаграмм Вороного [9—11]. P. polycephalum — это одноклеточный многоядерный организм.
Биокомпьютер представляет собой еще одну линию исследования, в которой вычисления осуществляются за счет проведения химических и биохимических реакций [12—14]. Обычно такие вычислительные системы основаны на биологических молекулах и предполагают проведение энзиматических реакций. Таким образом, комбинация имеющихся в наличии молекул может рассматриваться как входной массив данных, а образование продуктов реакции — как выходной массив данных.
Полимерные микро- и нанокапсулы (ПК) представляют значительный интерес в области биокомпьютеров. ПК — это полые системы с диаметром
е-mail: [email protected]
Polymeric capsules (containers) are widely used now in researches connected to the design of new pharmaceutical preparations. Here we present data allowing to consider these objects also as essential parts of biocomputers, capable, in particular, to carry out targeted delivery and triggered start of the «main program» (encapsulated specific molecules) to the areas with damaged functioning of the system, resulted from undesirable reactions. We also consider the use of cells as program package, capable to perform parallel functions in biocomputers when delivered in a proper place and started functioning in a proper moment.
Key words: polymeric capsules, biocomputer, targeted delivery, triggered release.
в диапазоне от сотен нм до нескольких микрон. В оболочку капсулы могут входить полимеры, наночастицы, белки, ДНК и т.п. Толщина оболочки обычно составляет 4—40 нм. Важной особенностью ПК является возможность открывания и закрывания пор в оболочке. Таким образом, внутренний объем капсул может быть заполнен заданным веществом. Именно по этой причине ПК широко исследуются для применения в качестве контейнеров для направленной доставки и контролируемого выпуска лекарственных препаратов [15, 16]. Однако данное свойство может быть очень полезным и для вышеупомянутых биокомпьютеров. Для обоснования вышеприведенного утверждения можно рассмотреть следующий пример. Подобно традиционным компьютерам, биокомпьютер может быть также подвержен воздействию вирусов. В данном случае воздействие будет сводиться к тому, что изменится состав рабочей среды таким образом, что дальнейшая обработка информации станет невозможной. Такая ситуация может возникнуть, например, из-за того что резко увеличится концентрация или активность какого-либо типа ферментов. В данном конкретном случае, антивирусная программа должна подавить эту реакцию. Ингибитор реакции может быть помещен во внутреннюю область капсулы. Однако его эффективное использование возможно только в том случае, если он будет доставлен в зону риска и выброс ингибитора произойдет только тогда, когда будет зарегистрирован факт вирусного заражения. Данную функцию в состоянии осуществить оболочка капсулы, реализованная строго определенным образом. Она должна содержать функциональные группы, способные
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
156
Обзоры
обеспечить доставку капсул в строго определенные места и обеспечить запуск главной программы (выброс активного вещества), когда настанет необходимый для этого момент.
Гораздо больший интерес в качестве инкапсулированного объекта могут представлять клетки. В данном случае — это уже даже не одна главная программа, а пакет программ, способных к одновременному выполнению целого ряда функций. Как и в предыдущем случае, соответствующая инкапсуляция клеток позволит обеспечить их доставку в нужные места, а также замедлить и/или усилить эффективность выполнения всех или некоторых функций.
В данной работе будут изложены основы метода изготовления ПК. После этого, будут приведены несколько примеров реализации различных типов оболочек ПК, позволяющих выполнить две вышеперечисленные операции, а именно: направленная доставка и контролируемый запуск.
Изготовление капсул
В основе технологии изготовления полимерных капсул лежит метод полиэлектролитной самосборки, более известный как нанесение «слой-за-слоем»
[17]. Непосредственно после первой публикации, метод привлек внимание огромного числа исследовательских групп, что связано с его простотой, отсутствием специальных требований к используемому оборудованию и возможностью создавать заданные молекулярные системы на поверхностях различной формы и широким спектром физикохимических свойств.
В самом простом виде метод предполагает использование двух растворов полимеров: полианионы и поликатионы. Образец последовательно погружается в данные растворы с последующими отмывкой и просушкой струей воздуха (азота, аргона) после нанесения каждого слоя. Каждое погружение в раствор приводит к адсорбции тонкого слоя со средней толщиной порядка 1 нм. Приведенная толщина нанесенного слоя может быть только незначительно изменена путем изменения pH и (или) ионной силы раствора. Дальнейший рост толщины адсорбированного слоя блокируется электростатическим отталкиванием заряженных полимерных молекул в растворе и зарядом поверхности, возникшим в результате адсорбции на ней именно этих молекул. То же самое происходит и в случае нанесения слоя полимера с противоположным зарядом. Цикл может быть повторен любое количество раз для нанесения пленки с наперед заданной толщиной.
Важной особенностью метода является возможность включения в оболочку не только полимеров, но и любых других заряженных объектов, таких как белки [19], ДНК [20], и т.п.
Принципиальный прорыв в использовании метода полиэлектролитной самосборки произошел в 1998 г., когда технология была впервые использована для покрытия не планарных структур [21]. Данная работа привела к возможности создания функциональных полимерных капсул, о которых и идет речь в данной работе. Основные моменты технологического процесса изготовления ПК схематически показаны на рисунке 1.
В качестве ядер для реализации функциональной оболочки обычно используются сферические неорганические частицы нужного диаметра. Первый слой оболочки создается путем помещения ядер в раствор заряженного полимера. После завершения процесса адсорбции, который обычно занимает порядка 15 мин, ядра с нанесенным слоем должны быть извлечены из раствора полимера и отмыты. После завершения процессов адсорбции, отделения и отмывки, раствор полимера с противоположным зарядом добавляется к раствору с ядрами и вышеописанные операции повторяются. Известно, что после того, как толщина оболочки превышает 4 монослоя, она становится стабильной. Таким образом, нижний предел толщины оболочки для изготовления стабильных ПК можно определить как 4 нм.
Следующим шагом технологического процесса является растворение ядер. Природа материалов ядер такова, что они растворяются при pH среды ниже 4,0. Данная операция приводит к созданию полых капсул, которые впоследствии можно заполнить требуемым соединением. Для этого нужно будет использовать важнейшую особенность полых капсул — вариацию проницаемости оболочки (образование пор) при изменении величины pH раствора: образование пор происходит при значениях pH ниже 4,0, и их закрытие происходит, когда значение pH превышает 7,0. Таким образом, заполнение контейнера будет происходить при добавлении в раствор требуемых молекул и при одновременном понижении pH раствора. После заполнения контейнеров, pH раствора должна быть увеличена с последующим применением процесса отмывки, аналогичного применяемому в процессе изготовления оболочек капсул. Как это было неоднократно экспериментально продемонстрировано, капсулированное вещество будет находиться в объеме капсул до тех пор, пока в оболочке не откроются поры.
А Б В Г Д
Рис. 1. Схема процесса изготовления полимерных капсул:
А, Б, в — нанесение оболочки; г — растворение ядра; д — полая капсула
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
157
Направленная доставка
Предлагаемая система на основе ПК допускает два вида направленной доставки: грубое и точное наведение на цель. Первое предполагает доставку в достаточно обширную область, в которой возможна необходимость высвобождения инкапсулированного препарата. Для достижения данной цели, оболочка капсулы может быть изготовлена таким образом, чтобы содержать магнитные наночастицы. Эффективная возможность подобной модификации оболочек капсул была продемонстрирована экспериментально [22]. При этом, доставка капсул к областям, где может возникнуть необходимость использования капсулированных субстанций, может быть осуществлена посредством использования внешнего магнита. Данная операция схематически показана на рисунке 2А.
В некоторых специфических случаях, связанных с локальным характером протекания реакций в областях расположения определенных химических групп, может потребоваться режим точного наведения. Это означает, что активное вещество (главная программа) должно быть доставлено не просто в зону риска, но и занять строго определенное место, гарантирующее наибольшую эффективность воздействия на среду при высвобождении, что связано с оптимальной стерической конфигурацией всех компонентов предполагаемой реакции.
Для достижения данной цели поверхность капсул может быть модифицирована путем иммобилизации подходящего рецептора. В частности, в наших предыдущих работах мы модифицировали поверхность капсул антителами к токсинам (молекулы иммуноглобулина IgG) [23]. Как было продемонстрировано,
разработанный метод иммобилизации обеспечил прочное присоединение антител к поверхности капсул в конфигурации, обеспечивающей оптимальные условия связывания антигенов. Процесс точной наводки ПК схематически показан на рисунке 2Б.
Контролируемый выпуск активного вещества
(запуск главной программы)
В идеальном случае, активация главной программы (выброс активного вещества) должен происходить автоматически, когда в системе возникнут необходимые для этого условия. Используя аналогию с традиционным компьютером, капсулированное вещество может рассматриваться как главная программа, призванная выполнить, например, антивирусное действие. Продолжая аналогию, мы можем рассматривать оболочку в качестве побочной программы, задачей которой является доставка главной программы к подверженному риску домену и ее запуск при возникновении требуемых условий. Данная вспомогательная программа может быть определена как «система слежения», реагирующая на изменение условий среды, что соответствует английскому «event listening daemon» program.
Если, например, нежелательные изменения состава среды предполагают увеличение кислотности, контролируемый запуск «главной программы» произойдет автоматически, так как открытие пор в оболочке при понижении pH является общим свойством практически всех видов оболочек капсул. Однако такая ситуация не всегда имеет место. В этом случае можно предложить две стратегии запуска главной программы, схематически проиллюстрированные на рисунке 3.
Рис. 2. Грубая (а) и точная (б) доставка ПК
А
Б
Рис. 3.
Запуск «главной программы»: автоматический (А)
и индуцированный внешним воздействием (б)
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
158
Обзоры
Первая стратегия предполагает создание оболочки, проницаемость которой может быть изменена из-за присутствия продуктов реакций, происходящих в активной среде (рис. 3А). В данном случае оболочка должна содержать элементы, разрушающиеся при возникновении нежелательных продуктов реакции. В качестве примера, иллюстрирующего данный подход, можно обратиться к эксперименту, направленному на разработку систем доставки лекарственных препаратов, в частности, препаратов, направленных на лечение артрита [24, 25]. Заболевание приводит к увеличению концентрации в теле заболевшего человека ферментов MMP1, разрушающих коллаген, являющийся одним из основных компонентов соединительной ткани. В данном случае, коллаген использовался в качестве одного из основных материалов оболочки. Было экспериментально показано, что выпуск капсулированного препарата был возможен только в том случае, когда в рабочей среде содержались вышеупомянутые ферменты. В принципе, данный подход может быть применен в ряде случаев, когда тип нежелательных продуктов реакций, приводящих к сбою системы, определен с достаточной точностью. При этом нужно будет только создать оболочку, способную изменить свою проницаемость в присутствии этих молекул.
Однако можно представить себе ситуацию, когда нежелательные продукты реакции не приводят к изменению проницаемости оболочки капсул. В этом случае необходимо применение внешнего воздействия, способного активировать запуск главной программы. Можно предложить различные стратегии, описанные в литературе и позволяющие осуществить подобные воздействия. Например, УФ [26] и ИР [27] облучения были эффективно использованы для изменения проницаемости оболочек капсул. Однако если система состоит в том числе и из биомолекул, такое воздействие может привести к нежелательным побочным эффектам: УФ облучение может привести к мутациям на генетическом уровне, а ИК воздействие может термически разрушить прилегающие ткани. Чтобы избежать нежелательных последствий, мы разработали метод, позволяющий осуществить контролированный выброс капсулированного препарата при облучении капсул зеленым светом очень низкой интенсивности, не оказывающей никаких побочных эффектов на систему [28].
В данном случае был использован бактериоро-допсин: протонный насос, активируемый поглощени-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Chua L. Memristor — the missing circuit element. IEEE Trans. Circuit Theory 1971; 18: 507-19.
2. Strukov D.B., Snider G.S., Stewart D.R. et al. The missing memristor found, Nature 2008; 453: 80-3.
3. Yang J.J., Pickett M.D., Li X. et al. Memristive switching mechanism for metal/oxide/metal nanodevices. Nature Nanotechnology 2008; 3: 429-33.
4. Borghetti J., Snider G. S., Kuekes P. J. et al. «Memristive» switches enable «stateful» logic operations via material implication. Nature 2010; 464: 873-6.
5. Erokhin V., SchQz A., Fontana M.P. Organic memristor and bio-inspired information processing. Int. J. Unconventional Computing. 2010; 6: 15-32.
6. Jo S. H., Chang T., Ebong I. et al. Nanoscale memristor device as synapse in neuromorphic systems. Nano Lett. 2010; 10: 1297301.
7. Krzysteczko P., Muenchenberger J., Schafers M. et al. The memristive magnetic tunnel junction as a nanoscopic synapse-neuron system. Adv. Mater. 2012; 24: 762-6.
ем видимого света с длиной волны около 570 нм. Реализованные оболочки капсул содержали ориентированные слои бактериородопсина, осуществляющие перенос протонов в объем капсул при их облучении. Таким образом, поглощение света приводит к закачиванию протонов внутрь капсул, и, как следствие, локальное понижение pH и открывание пор в их оболочке. Квантовая эффективность бактерио-родопсина близка к ста процентам, следовательно, запуск главной программы может быть осуществлен с очень малыми энергетическими затратами. Процесс запуска схематически изображен на рис. 3Б.
Выводы
В данной работе мы попытались отметить важнейшие свойства полимерных капсул, позволяющие рассматривать их в качестве ключевых элементов биокомпьютеров. Главная программа, предназначенная для выполнения специфических функций, помещается в объем капсулы. Оболочка капсулы выполняет роль вспомогательной программы, обеспечивающей доставку главной программы в нужное место и ее запуск в нужный момент.
В дальнейшем предполагается использование данного подхода для создания комплекса программ для биокомпьютеров - инкапсуляция клеток, способных к одновременному выполнению координированного массива функций. В настоящее время ведутся работы [29, 30], демонстрирующие принципиальную возможность модификации поверхности клеток с помощью ЛбЛ метода. Таким образом, целенаправленное изменение свойств клеток с помощью ЛбЛ метода позволяет предположить возможность их использования в биокомпьютерах в обозримом будущем.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Частично данная работа была профинансирована Социальным фондом региона Лигурия (Италия) в рамках проекта PO CRO Fondo Sociale Eurnpeo Regione Liguria 2007-2013 Asse IV «Capitale Umano» ob.specifico I/6 di cui all'avviso pubblico approvato con DGR 1283/2011.
8. Erokhin V., Berzina T., Camorani P. et al. Material memristive
device circuit with synaptic plasticity: learning and memory.
BioNanoScience 2011; 1: 24-30.
9. Nakagaki T. Smart behavior of true slime mold in a labyrinth. Res. Microbiol. 2001; 152: 767-70.
10. Nakagaki T., Yamada H., Ueda T. Interaction between cell shape and contraction pattern in the Physarum plasmodium. Biophys. Chem. 2000; 84: 195-204.
11. Adamatzky A., Erokhin V., Grube M. et al. Physarum chip project: growing computers from slime mould. Int. J. Unconventional Computing 2012; 8: 319-23.
12. Adamatzky A. Topics in reaction-diffusion computers. J. Computational Theor. Nanosci. 2011; 8: 295-303.
13. Privman V., Zavalov O., Halamkova L. et al. Networked enzymatic logic gates with filtering: New theoretical modeling expressions and their experimental application. J. Phys. Chem. B. 2013; 117: 14928-39.
14. Katz E., Privman V. Enzyme-based logic systems for information processing. Chem. Soc. Rev. 2010; 39: 1835-57.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
159
15. De Geest B.G., De Koker S., Sukhorukov G.B. et al. Polyelectrolyte microcapsules for biomedical applications. Soft Matter. 2009; 5: 282-91.
16. Pastorino L., Erokhina S., Erokhin V. Smart nanoengineered polymeric capsules as ideal pharmaceutical carriers. Curr. Org. Chem., 2013; 17: 58-64.
17. Decher G. Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicomposites. Science 1997; 277: 1232-7.
18. Schmitt J., Decher G., Dressick W. J. et al. Metal nanoparticle/ polymer superlattice films: Fabrication and control of layer structure. Adv. Mater. 1997; 9: 61-5.
19. Lvov Y., Haas H., Decher G. et al. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a carged virus. Langmuir 1994; 10: 4232-6.
20. Montrel M.M., Petrov A.I., Shabarchina L.I. et al. Spectroscopic study of thin multilayer films of the complexes of nucleic acids with cationic amphiphiles and polycations: their possible use as sensor elements. Sens. Actuat. B. 1997; 42: 225-31.
21. Sukhorukov G. B., Donath E., Lichtenfeld H. et al. Layer-bylayer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles. Colloids Surfaces A 1998; 137: 253-66.
22. Mobius D., Miller R., editors. Novel methods to study interfacial layers. Amsterdam: Elsevier Science; 2001.
23. Nabok A. V., Erokhin V., Erokhina S. et al. Extraction of mycotoxines from acqueous solutions using functionalized
polyelectrolyte-coated nanoparticles. NanoBioScience 2013; 3:
79-84.
24. Pastorino L., Erokhina S., Konovalov O. et al. Permeability variation study in collagen-based polymeric capsules. BioNanoScience 2011; 1: 192-7.
25. Erokhina S., Konovalov O., Bianchini P. et al. Release kinetics of gold nanoparticles from collagen microcapsules by total reflection X-ray fluorescence. Colloids Surfaces A 2013; 417: 83-8.
26. Bedard M. F., De Geest B. G., Skirtach A. G. et al. Polymeric microcapsules with light responsive properties for encapsulation and release. Adv. Colloid Interface Sci. 2010; 158: 2-14.
27. Bedard M.F., Braun D., Sukhorukov G.B. et al. Toward selfassembly of nanoparticles on polymeric microshells: Near-IR release and permeability. ACS Nano 2008; 2: 1807-16.
28. Erokhina S., Benassi L., Bianchini P. et al. Light-driven release from polymeric microcapsules functionalized with bacteriorhodopsin. J. Am. Chem. Soc. 2009; 131: 9800-4.
29. Kommiereddy I., Ichinose I., Lvov Y. et al. Nanoparticle multilayer: Surface modification for cell attachment and growth. J. Biomed. Nanotechnol. 2005; 1: 286-90.
30. Pavlov A. M., Sukhorukov G. B., Gould D.J. Location of molecules in layer-by-layer assembled microcapsules influences activity, cell delivery and susceptibility to enzyme degradation. J. Controlled Release 2013; 172: 22-9.
Поступила: 20.09.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
