CC BY
93
Ор и г и н а л ь н ы е иссле д о в а н и я
27. Mohan C., Adams S., Stanik V. et al. Nucleosome: a major immunogen for pathogenic autoantibody-inducing T cells of lupus. J Exs Med 1993;177:1367-81.
28. Rekvig O.P., Moens U., Sudsjord A. et al. Experimental expression in mice and spontaneous expression in human SLE of polyomavirus E-antigen. A molecular basis for induction of antibodies to DNA and eukaryotic cells. J Clin Invest 1997;99:2045-54.
29. Fleischhaker M., Schidt B. Circulating nucleic acids (CNAs). Biochim Biophys Acta 2007;1775:181-232.
30. Kalaaji M., Mortensen E., Jorgensen L. et al. Nephritogenic lupus antibodies recognize glomerular basement membrane-associated chromatin fragments released from apoptotic intraglomerular cells. Am J Pathol 2006;168:1779-92.
31. Takami N., Osawa K., Miura Y. et.al. Hypermethylated promoter region of DR3, the death receptor 3 gene, in rheumatoid arthritis
synovial cells. Arthr Rheum 2006;54:779-87.
32. Henault J., Robitaille G., Senecal J.L. et al. DNA topoisomerase I binding to fibroblasts induces monocyte adhesion and activation in the presence of anti-topoisomerase I autoantibodies from systemic sclerosis patients. Arthr Rheum 2006;54:963-73.
33. Hayakawa I., Hasegawa M., Takehara K., Sato S. Anti-DNA topoisomerase II autoantibodies in localized scleroderma. Arthr Rheum 2004;50:227-32.
34. Poscl A., Fidler A., Scmidt B. et al. DNA methylation is not likely to be responsible for aggrecan down regulation in aged or osteoarthtitic cartilage. Ann Rheum Dis 2005;64:477-80.
35. Gugliesi F., De Andrea M., Mondini M. et al. The proapoptotic activity of the Interferoh-inducible gene IFI16 provides new insights into its etiopathogenetic role in autoimmunity.
J Autoimmun 2010;31:114-23.
Прогнозирование течения остеоартроза по экспрессии гена mTOR (mammalian target of rapamycin)
Е.В. Четина, Е.А. Братыгина, Е.М. Зайцева, Е.П. Шарапова,
ЛА Семенова, НА Демин, Л.И. Алексеева, С.И. Глухова,
В.В. Коломацкий, М.А. Макаров, А.Л. Логунов, АА Роскидайло, С.А. Макаров
Лаборатория генетики, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт
ревматологии» РАМН, Москва
Laboratory of Genetics, Research Institute of Rheumatology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Контакты: Елена Васильевна Четина [email protected]
Contact: Elena Vasilyevna Chetina [email protected]
Поступила 19.01.2011
Цель — изучить возможность прогнозирования течения заболевания у больных остеоартрозом (ОА) посредством мониторинга экспрессии гена mTOR (Mammalian Target Of Rapamycin) в крови.
Материал и методы. Работа проведена на образцах периферической крови: 33 амбулаторных больных ОА (58,4+7,4 года); 10 больных ОА перед эндопротезированием коленного сустава (56,5+8,9 года) и 27 здоровых людей, составивших группу контроля (55,6+8,3 года). Общую РНК выделяли из крови и использовали для определения уровня экспрессии генов mTOR (мишени рапамицина у млекопитающих), ATG1 (аутофагально-го белка 1), p21 (ингибитора циклин-зависимых киназ 21), каспазы 3 и фактора некроза опухоли а (ФНО а) в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Результаты. При анализе экспрессии генов у амбулаторных больных ОА выделены две подгруппы: в одной подгруппе (13 человек) экспрессия mTOR была значительно ниже, чем в группе контроля, значения экспрессии ATG1 и р21 существенно не отличались от контроля, а экспрессия каспазы 3 и ФНО а была значительно выше. У остальных амбулаторных пациентов (20 человек), а также у всех исследованных больных, нуждающихся в эндопротезировании, отмечена повышенная экспрессия генов mTOR, ATG1, р21, каспазы 3 и ФНО а по сравнению с группой контроля. Тяжелая деструкция суставов у больных ОА перед эндопротезированием ассоциировалась с повышением экспрессии генов mTOR, ATG1, р21 и каспазы 3.
Заключение. Повышенные уровни экспрессии гена mTOR в крови больных ОА на ранней стадии заболевания могут служить прогностическим маркером тяжести заболевания и разрушения суставного хряща.
Ключевые слова: остеоартроз, экспрессия генов, mTOR, кровь
PREDICTION OF THE COURSE OF OSTEOARTHROSIS FROM mTOR (MAMMALIAN TARGET OF RAPAMYCIN) GENE EXPRESSION E.V. Chetina, E.A. Bratygina, E.M. Zaitseva, E.P. Sharapova, L.A. Semenova, N.A. Demin,
L.I. Alekseyeva, S.I. Glukhova, V.V. Kolomatsky, M.A. Makarov, A.L. Logunov, A.A. Roskidailo, S.A. Makarov
Objective: To study whether the course of the disease can be predicted in patients with osteoarthrosis (OA), by monitoring mTOR (Mammalian Target Of Rapamycin) gene expression in their blood.
Material and methods. The investigation was conducted on the peripheral blood samples from 33 outpatients (58.4+7.4 years) with OA; 10 patients (56.5+8.9 years) before endoprosthetic knee joint replacement, и 27 healthy individuals (55.6+8.3 years) who formed a control group. Total RNA was isolated from the blood and used to estimate the gene expression of mTOR, autophagy-related protein 1 (ATG1), the cyclin-dependent kinase inhibitorp21, caspase
3, and tumor necrosis factor-а (TNF-а) by real-time polymerase chain reaction.
Results. Analysis of gene expression in the outpatients with OA identified two subgroups: in one subgroup (n = 13) mTOR expression was considerably much less than that in the control group; the expression of ATG1 andp21 did not differ greatly from the control and that of caspase 3 and TNF-а was significantly higher. The other outpatients (n = 20) and all the examined patients needing endoprosthetic replacement were ascertained to have a higher gene expression of mTOR, ATG1, p21, caspase 3, and TNF-а than in the control group. Before endoprosthetic replacement, severe joint destruction in patients with OA was associated with enhanced gene expression of mTOR, ATG1, p21, and caspase 3. Conclusion. In early-stage disease, increased mTOR gene expression may serve as a prognostic marker of the severity of the disease and articular cartilage destruction.
Key words: osteoarthrosis, gene expression, mTOR, blood
Ор
игинальные иссле
в а н и я
Остеоартроз (ОА) является распространенным заболеванием соединительной ткани, при котором происходит разрушение суставного хряща [1, 2]. Одной из гипотез развития патологического процесса в хрящевой ткани считается нарушение баланса анаболических и катаболических процессов с преобладанием последних. Кроме того, разрушению хряща способствуют также активация протеиназ матрикса вследствие усиленной продукции цитокинов интерлейкина (ИЛ) 1|3 и фактора некроза опухоли а (ФНО а) и нарушение баланса уровней протеаза/ингибитор, которые приводят к усилению активности матриксных метал-лопротеиназ (ММП) [3]. Вместе с тем при данной патологии происходит нарушение равновесия пролиферации и апоптоза хондроцитов [4—7].
Диагностика ранней стадии ОА в настоящее время затруднительна. Заболевание распознается только на стадии активного разрушения хряща с выраженным болевым синдромом и сопровождается появлением маркеров его деструкции в крови. При этом ранее нами было показано, что появлению клинических признаков заболевания предшествует фенотипическая модификация (гипертрофия) хондроцитов, сходная с таковой в хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном развитии [8, 9]. Это сопровождается изменением экспрессии нетканеспецифических регуляторных генов и синтезом соответствующих белков, например ростовых и транскрипционных факторов трансформирующего фактора роста в, фактора роста фибробла-стов 2, факторов транскрипции Sox9 и Runx2, а также индикаторов апоптозной активности [9—11].
Как подтверждение этого недавно посредством транскриптомного анализа с использованием биочипов в мононуклеарных клетках периферической крови (МНКПК) больных ОА были также выявлены различия по сравнению со здоровыми людьми в экспрессии ряда генов, связанных с апоптозной активностью, регуляцией цикла клеточного деления и дифференцировкой хондро-цитов в ростковой пластинке при эмбриональном развитии [12, 13].
Допуская, что может существовать корреляция между экспрессией генов, кодирующих нетканеспецифич-ные процессы у больных ОА [13], мы предполагаем, что уровни экспрессии генов, ассоциированных с пролиферацией клеток, апоптозом и аутофагией, измеренные в образцах крови, могут отражать особенности течения заболевания, что позволит прогнозировать характер прогрессирования ОА.
Поскольку переход хондроцитов в состояние гипертрофии, которая ассоциируется с резорбцией хряща [9—11], сопровождается прекращением их пролиферативной активности, фенотипические изменения в клетках могут быть связаны с изменениями экспрессии ингибиторов циклинзависимых киназ, таких какр21 или р16, блокирующих процесс пролиферации. В настоящее время имеются данные об активности ингибиторов циклинзависимых киназ в хондроцитах больных ОА, однако они достаточно противоречивы. Так, ранее отмечалось подавление активности р21 при ОА, предполагающее усиление их пролиферативной активности [14], а также значительная активация р21 и р16 в хондроцитах больных ОА [15—17].
Кроме того, процесс развития ОА может регулироваться консервативной протеинкиназой mTOR (mammalian target of rapamycin — мишень рапамицина у млекопитающих). Она регулируется питательными веществами (ами-
нокислотами и глюкозой), а также ростовыми факторами [18] и служит главным регулятором клеточного роста и пролиферации клеток млекопитающих, а также процесса аутофагии. При этом активация тТОЯ приводит к ингибированию процесса аутофагии [19]. При аутофагии происходит обратимое переваривание собственных компонентов клетки по причине недостатка питательных веществ или при отсутствии критических трофических факторов [20]. Этот процесс происходит в лизосомах, мембраны которых построены из белков семейства ATG, и способствует выживанию клетки. Следует отметить, что признаки аутофагии наблюдали как в хондроцитах хряща при ОА [21], так и в клетках крови [22]. Однако длительное состояние аутофагии заканчивается гибелью клеток по механизму апоптоза с участием каспазы 3 [23].
Апоптоз является основной формой гибели эукариотических клеток, поскольку фрагментация клеток с образованием апоптозных тел, которые перевариваются макрофагами, позволяет избежать воспалительного процесса, который мог бы возникнуть при высвобождении больших количеств белковых компонентов клетки, как в случае некроза [24]. До сих пор активность апоптоза при ОА исследовали только в хондроцитах хряща. При этом в ряде исследований отмечалось, что разрушение хряща сопровождается значительным усилением апоптоза [1, 25], а в других были обнаружены только отдельные апоптозные клетки в хряще больных ОА [26].
Хотя ОА не считается классической воспалительной артропатией вследствие отсутствия нейтрофилов в синовиальной жидкости и системных проявлений воспаления, провоспалительные цитокины участвуют в резорбции хряща при ОА [27, 28]. Повышенная экспрессия провоспали-тельных медиаторов, таких как ИЛ 1 и ФНО а, отмечалась как при раннем, так и при позднем ОА [29, 30].
В связи с этим в данном исследовании на основании экспрессии генов, кодирующих основные фазы онтогенеза клетки: активность пролиферации (тТОЯ), ее подавление (ингибитор циклин-зависимых киназ р21), гибель клеток посредством апоптоза (каспаза 3) или аутофагии (аутофа-гальный белок ATG1), а также уровень воспаления ФНО а в крови больных ОА, имеющих разную степень разрушения суставов, мы определили, что эти гены, и прежде всего — тТОЯ, являются информативными маркерами для прогноза течения и тяжести ОА.
Материал и методы
В работе использовано 33 образца крови амбулаторных больных ОА в возрасте от 45 до 76 лет (средний возраст 58,4±7,4 года), имеющих нормальную минеральную плотность костной ткани (МПКТ), т. е. не имеющих остеопо-роза, а также 27 образцов крови здоровых людей (контроль) в возрасте от 42 до 74 лет (средний возраст 55,6±8,3 года). Кроме того, проанализировано 10 образцов крови, взятой перед эндопротезированием коленного сустава, у больных ОА в возрасте от 49 лет до 71 года (средний возраст 56,5±8,9 года; 3 мужчин и 7 женщин).
Фракционирование клеток крови. Фракционирование клеток периферической крови проводили в градиенте плотности верографина-фикола по стандартной методике. В результате были получены фракции МНКПК, тромбоцитов и гранулоцитов. Содержимое эритроцитов анализировали после их лизиса в присутствии N№01 в Трис-НС1 (рН=7,2) [31].
Ор игинальные иссле д о в а н и я
Выделение РНК, реакция обратной транскрипции (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. Из собранных образцов цельной крови, клеточных фракций и образцов сыворотки выделена общая РНК, которая переведена в комплементарную ДНК посредством реакции ОТ, как описано ранее [11].
Посредством количественной ПЦР в режиме реального времени в образцах периферической крови и хряща проведена оценка уровней экспрессии ключевых генов, связанных с основными фазами онтогенеза клетки: пролиферацией, аутофагией и апоптозом больных ОА по сравнению со здоровыми лицами из контрольной группы, как описано ранее [11]. Использовали готовые праймеры и зонды для методики TaqMan (Applied Biosystems Int., США): mTOR (Hs00234522_m1), ATG1
(Hs00177504_m1), каспазы 3 (Hs00263337_m1), p21 (Hs00355782_m1), ФНО а (Hs00174128_m1). в-Actin использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Количественную оценку уровней мРНК проводили на приборе 7300 (Applied Biosystems Int., США), как описано ранее [11]. В системе ПЦР в реальном времени относительная экспрессия каждого гена рассчитывается по сравнению с контролем, который равен единице.
Результаты
Экспрессия генов в крови больных ОА, не нуждающихся в эндопротезировании. Анализ экспрессии генов в образцах крови амбулаторных больных ОА показал, что в целом у больных ОА статистически значимо (р<0,001) повышена экспрессия генов mTOR, ATG1, р21, каспазы 3 и ФНО а (данные не приведены).
Однако группа больных ОА оказалась неоднородной: у 13 из 33 человек экспрессия mTOR оказалась значительно (р=0,02) ниже, чем у здоровых доноров. Пациенты этой подгруппы имели сравнимые с нормальными значения экспрессии ATG1 ир21, хотя экспрессия каспазы 3 (p=0,01) была значительно выше (рис. 1, см. таблицу). Пониженная экспрессия mTOR при нормальной экспрессии маркера ау-тофагии ATG1 может свидетельствовать о недостатке критических трофических факторов, которые приводят к использованию механизма аутофагии для генерации дополнительной энергии. В то же время значительно более высокая экспрессия каспазы 3 может свидетельствовать о повышенной апоптозной активности в этих клетках. При этом апоптозная активность может быть опосредована независимым от р21 сигнальным путем, поскольку экспрессия р21 значительно ниже экспрессии каспазы 3 (р=0,03).
В подгруппе с повышенной экспрессией mTOR (20 пациентов) экспрессия ATG1, р21 и каспазы 3 также оказалась выше, чем у доноров (рис. 2, см. таблицу). При этом наблюдались сходные уровни относительной экспрессии mTOR и ATG1; это позволяет предположить, что у пациентов данной подгруппы отсутствуют изменения, связанные с аутофагией. В то же время значительное превышение уровня экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ р21 по сравнению с экспрессией mTOR (р=0,03) свидетельствует о блокировании активности цикла клеточного деления. А пропорциональное увеличение экспрессии р21 и каспазы 3 может свидетельствовать о повышенной апоп-тозной активности этих клеток, обусловленой активностью р21 сигнального пути. Вероятно, высокие уровни экспрессии mTOR обусловливают рост клеток, а не их пролиферацию у данных пациентов.
Следовательно, амбулаторные больные ОА представлены неоднородной группой, в которой присутствуют как пациенты с пониженной экспрессией гена тТОЯ, так и пациенты, имеющие значительно более высокие уровни его экспрессии. Однако общим признаком обеих групп является повышенная экспрессия индикатора апоптоза — каспазы 3.
Экспрессия генов в крови больных ОА перед эндопротезированием. У больных ОА перед эндопротезированием коленного сустава экспрессия генов тТОЯ, ЛТ01, р21 и каспазы 3 была выше по сравнению с донорами (рис. 3, см.
Относительная экспрессия генов в подгруппах больных ОА
Пациенты
Гены с пониженной с повышенной перед эндопроте-
экспрессией mTOR экспрессией mTOR зированием
mTOR 0,56 (p=0,02) 7,49 (p<0,001) 20,07 (p<0,001)
ATG1 1,2 (p=0,19) 4,68 (p<0,001) 4,2 (p<0,001)
p21 1,28 (p=0,48) 27,39 (p<0,001) 39,37 (p<0,001)
Каспаза З 3,75 (p=0,03) 21,38 (p<0,001) 4,21 (p<0,001)
ФНО а 6,05 (p<0,001) 41,27 (p<0,001) 164,1 (p<0,001)
Примечание. Контроль=1.
е ре 4
X
C
mTOR
ATG1
p21
Каспаза 3
Рис. 1. Относительная экспрессия генов цикла клеточного деления в периферической крови амбулаторных больных ОА с пониженной экспрессией тТОН по сравнению со здоровыми донорами. С - уровень экспрессии генов у здоровых доноров (здесь и на рис. 2-5)
30-
20-
10-
mTOR
ATG1
p21
Каспаза З
Рис. 2. Относительная экспрессия генов цикла клеточного деления в периферической крови амбулаторных больных ОА с повышенной экспрессией тТОН по сравнению со здоровыми донорами
6
5
З
2
0
0
C
Ор игинальные иссле д о в а н и я
таблицу). При этом относительная экспрессия тТОЯ значительно превышала экспрессию ЛТ01 (р=0,03), а экспрессия р21 — экспрессию тТОЯ (р=0,03) и каспазы 3 (р<0,001). Эти результаты могут указывать на то, что, несмотря на высокую экспрессию тТОЯ, пролиферативный потенциал клеток больных ОА, нуждающихся в эндопротезировании, ограничен высокой экспрессией р21. Вместе с тем развитие аутофагии маловероятно, а гибель клеток, по-видимому, происходит посредством апоптоза.
Поскольку у всех обследованных пациентов с ОА перед эндопротезированием суставы были полностью разрушены, более высокая экспрессия тТОЯ, а также остальных исследованных в данной работе генов по сравнению с донорами свидетельствует о более агрессивном течении заболевания, что приводит к интенсивной деструкции сустава.
Экспрессия провоспалительного цитокина ФНО а в крови больных ОА. Экспрессия провоспалительного цитокина ФНО а была значительно повышена у всех больных ОА по сравнению с донорами (рис. 4, см. таблицу). Вместе с тем группы обследуемых больных значительно различались по экспрессии этого цитокина. При этом наиболее высокой экспрессия ФНО а оказалась у больных ОА, нуждающихся в эндопротезировании, а наименее — у амбулаторных больных ОА, имеющих пониженную экспрессию тТОЯ. Эти результаты дополнительно свидетельствуют
50'
30'
20'
° 10'
0
С
тТОН
ЛТв1
р21
Каспаза 3
Рис. 3. Относительная экспрессия генов цикла клеточного деления в периферической крови больных ОА перед эндопротезированием, по сравнению со здоровыми донорами. *- р=0,03, **- р<0,001
Рис. 4. Относительная экспрессия гена, кодирующего провоспа-лительный цитокин ФНО а, в периферической крови больных ОА по сравнению со здоровыми донорами. Амбулаторные больные ОА с пониженной (ФНО-Н), повышенной (ФНО-В) экспрессией тТОЙ и больные ОА перед эндопротезированием (ФНО-П)
о более тяжелом состоянии больных ОА с повышенной экспрессией тТОЯ.
Экспрессия исследуемых генов в крови обусловлена активностью МНКПК. Анализ различных фракций крови пациентов показал полное отсутствие экспрессии исследуемых генов в сыворотке крови, а также в безъядерных клетках — эритроцитах и тромбоцитах. За экспрессию исследуемых генов в образце цельной крови оказались ответственны преимущественно МНКПК и частично гранулоциты (рис. 5). При этом экспрессия всех исследованных генов в МНКПК была значительно выше, чем во фракции грану-лоцитов. Кроме того, уровень экспрессии исследуемых генов в изолированных МНКПК был выше, чем в образце цельной крови, вследствие активации клеток, происходящей в процессе фракционирования, которая также отмечалась ранее в исследованиях других авторов [32].
Обсуждение
Сложность и гетерогенность процессов, происходящих в организме больного при развитии ОА, не позволяют в настоящее время идентифицировать причины возникающих изменений [33]. Однако используя современные методы, можно оценить степень отклонения состояния больного от состояния здорового человека. Для этого обычно используются специфические белковые маркеры хрящевой ткани, тестируемые в крови больных ОА. Однако белковые маркеры, такие как фрагменты коллагена 2-го типа, выявляются в крови как следствие нарушения целостности хряща.
Поскольку известно, что репарационный потенциал хрящевой ткани очень ограничен [34], для прогноза развития заболевания и тяжести его течения на ранних этапах, предшествующих разрушению хрящевой ткани, необходимы новые, более информативные маркеры.
Таким индикатором может служить экспрессия не-тканеспецифичных регуляторных генов, измеренная в крови. В настоящее время известно, что число генов, одновременно экспрессирующихся в различных типах клеток, тем выше, чем более близкородственны ткани. Поскольку иммунные клетки и хондроциты происходят из мезодермы, а развитие суставного хряща, костной ткани и адаптивной иммунной системы филогенетически тесно связано, эти системы используют идентичные регуляторные цитокины и ростовые факторы [4]. Поэтому экспрессия регуляторных генов в крови и хрящевой ткани пациента может изменяться координированно при развитии заболевания.
В данном исследовании мы предлагаем оценивать состояние больных ОА по степени отклонения экспрессии генов, связанных с регуляцией пролиферации, аутофагии и апоптоза, по сравнению со здоровыми людьми.
Наши исследования показали, что экспрессия гена тТОЯ в образцах крови больных ОА является информативным прогностическим маркером тяжести заболевания и риска поражения суставов. Экспрессия тТОЯ у больных ОА может варьировать от пониженной до значительно превышающей контрольный уровень экспрессии. При этом высокая экспрессия этого гена у больных ОА ассоциируется с большей вероятностью разрушения сустава, поскольку все обследованные больные, нуждающиеся в эндопротезировании коленного сустава, имели повышенные уровни экспрессии этого гена. Это согласуется с более высокими уровнями экспрессии у таких больных провоспалительно-го цитокина ФНО а, способного активировать ММП, разрушающие хрящ [27].
О р игинальные иссле д о в а н и я
30 —.
20-
те10
|~Т~|—*—I—*— I
тТОЯ
ЛТв1
р21
1 2 Каспаза 3
Рис. 5. Относительная экспрессия генов цикла клеточного деления в изолированных в градиенте фикола фракциях клеток периферической крови больных ОА по сравнению со здоровыми донорами. 1 - МНКПК, 2 - гранулоциты
0
2
2
С
Кроме того, анализ соотношения экспрессии генов, ассоциированных с пролиферацией клеток, аутофагией и апоптозом, у больных ОА позволяет судить о физиологическом состоянии клеток крови. В частности, несмотря на недостаточную или повышенную экспрессию гена тТОЯ у разных групп больных ОА, пролиферативный потенциал клеток их крови ограничен. Так, в подгруппе с пониженной экспрессией тТОЯ пролиферация ингибируется низкой активностью соответствующего сигнального пути, а в подгруппе с высокой его экспрессией пролиферативный потенциал лимитируется значительно более высоким уровнем экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ р21.
Хотя прямых исследований активности ингибитора циклин-зависимых киназ р21 в крови при ОА до сих пор не проводилось, наши данные о высокой экспрессии р21 у больных ОА со значительным разрушением суставного хряща согласуются с сообщениями о положительной корреляции содержания в МНКПК супрессора опухолевого роста р53, который является индуктором р21, с рентгенологической стадией ОА [35]. Кроме того, ранее сообщалось также о значительной активации р21 и р16 в хондроцитах больных ОА [15—17].
Следует отметить, что наши данные также согласуются с результатами других авторов, отмечавших более слабую способность к пролиферации клеток крови больных ОА по сравнению со здоровыми людьми [36], хотя ранее в ряде случаев также отмечалась активация Т- и В-лимфо-цитов у 50% больных ОА [37]. Кроме того, ингибирование пролиферативной активности в клетках крови обследованных больных ОА согласуется с нашими прежними наблюдениями об остановке клеточного деления суставных хон-дроцитов при ОА, в сочетании с развитием процесса, сходного с их гипертрофией, которая происходит при резорбции хряща [1, 8, 9]. Это может свидетельствовать о том, что изменения в крови и хряще происходят согласованно.
Высокая экспрессия маркера апоптоза — каспазы 3 — у амбулаторных больных ОА по сравнению с группой контроля свидетельствует о повышенной апоптозной активности клеток крови и косвенно подтверждает данные о значительном усилении апоптозной активности также в хондроцитах хряща при ОА [1, 19]. Однако в группе больных ОА, нуждающихся в эндопротезировании и имеющих зна-
чительные разрушения хряща, гибель клеток, вероятно, замедляется вследствие диспропорции экспрессии р21 и кас-пазы 3. Это может быть причиной низкой активности апоптоза, отмеченной при позднем ОА в ряде других исследований [21].
Кроме того, нельзя исключить развитие аутофагии в клетках крови при ОА у больных с пониженной экспрессией гена тТОЯ. На это указывает относительное превышение экспрессии гена ЛТ01 по сравнению с тТОЯ.
Наконец, повышенная экспрессия провоспалитель-ного цитокина ФНО а у всех обследованных больных ОА по сравнению с контрольной группой свидетельствует об участии воспалительного процесса в прогрессировании заболевания [33]. Повышенная экспрессия провоспалитель-ных цитокинов ранее также отмечалась в синовиальной жидкости и хряще больных с ранним и поздним ОА и сопровождалась повышением содержания в крови маркеров воспаления, например С-реактивного белка [38, 39]. В наших исследованиях наиболее высокие уровни экспрессии ФНО а у больных ОА со значительным разрушением суставного хряща и повышенной экспрессией гена тТОЯ дополнительно свидетельствуют о вкладе цитокинов в разрушение суставного хряща.
Заключение
В данной работе впервые проведена комплексная оценка экспрессии генов — индикаторов состояния клеток крови больных ОА в плане их способности к пролиферации и разным формам гибели (посредством аутофагии и апоптоза) с целью выявления нетканеспецифических маркеров, с помощью которых можно судить о начальных признаках и прогрессировании заболевания. При этом впервые обнаружено, что экспрессия гена тТОЯ может служить маркером тяжести заболевания и прогноза его течения, а именно у больных ОА с высокой экспрессией гена тТОЯ более вероятна обширная площадь разрушения хряща, что может быть основанием для эндопротезирования сустава. Поэтому больные ОА, имеющие повышенную экспрессию гена тТОЯ, вероятно, нуждаются в более агрессивной терапии, начиная с ранних этапов заболевания.
Работа осуществлена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 09-04-01158-а).
OP
игинальные иссле
в а н и я
ЛИТЕРАТУРА
1. Четина Е.В. Механизмы эмбриогенеза при остеоартрозе: роль дифференцировки хондроцитов в резорбции суставного хряща. Науч-практич ревматол 2010;3:65-77.
2. Buckwalter J.A., Saltzman C., Brown T. et al. The impact of osteoarthritis: implications for research. Clin Orthop 2004;427:S6-S15.
3. Dean D.D., Azzo W., Martel-Pelletier J. et al. Evidence for metal-loproteinase and metalloproteinase inhibitor imbalance in human osteoarthritic cartilage. J Clin Invest 1989;84:678-85.
4. Muller B. Cytokine imbalance in non-immunological chronic disease. Cytokine 2002;18:334-9.
5. Aigner T., Rose J., Martin J. et al. Aging theories of primary osteoarthritis: from epidemiology to molecular biology. Rejuvenation Res 2004;7:134-45.
6. Lorenzo P., Bayliss M.T., Heinegard D. Altered patterns and synthesis of extracellular matrix macromolecules in early osteoarthritis. Matrix Biol 2004;23:381-91.
7. Sharif M., Whitehouse A., Sharman P. et al. Increased apoptosis in human osteoarthritic cartilage corresponds to reduced cell density and expression of caspase 3. Arthr Rheum 2004;50:507-15.
8. Четина Е.В., Пул А.Р. Способность фрагмента коллагена 2 типа индуцировать расщепление коллагена и гипертрофию суставных хондроцитов. Bестн РАМН 2008;9:40-5.
9. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased type II collagen degradation and very early focal cartilage degeneration is associated with upregulation of chondrocyte differentiation related genes in early human articular cartilage lesions. J Rheumatol 2005;32:876-86.
10. Четина Е.В., Пул А.Р. Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена и дифференциации хондроцитов при остеоартрозе. Bестн РАМН 2008;5:15-21.
11. Четина Е.В., ДиБатиста Д., Пул А.Р. Роль простагландина E2 в ингибировании разрушения коллагена суставного хряща больных остеоартрозом. Науч-практич ревматол 2009;3:18-23.
12. Mahr S., Burmester G.-R., Hilke D. et al. Cis and Trans-acting gene regulation is associated with osteoarthritis. Am J Hum Genet 2006;78:793-803.
13. Grcevic D., Jajic Z., Kovacic N. et al. Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins, tumor necrosis factor-superfamily molecules, and transcription factor Runx2 could be used as markers of the form of arthritis, disease activity, and therapeutic responsiveness. J Rheumatol 2010;37:246-56.
14. Sesselmann S., Soder S., Voigt R. et al. DNA methylation is not responsible for p21WAF1/CIP1 down-regulation in osteoarthritic chondrocytes. Osteoarthr Cartilage 2009;17:507-12.
15. Fukuda K. Progress of research for osteoarthritis. Involvement of reactive oxygen species in the pathogenesis of osteoarthritis. Clin Calcium 2009;19:1602-6.
16. Dai S.M., Shan Z.Z., Nakamura H. et al. Catabolic stress induces features of chondrocyte senescence through overexpression of caveolin 1: possible involvement of caveolin 1-induced down-regu-lation of articular chondrocytes in the pathogenesis of osteoarthritis. Arthr Rheum 2006;54:818-31.
17. Zhou H.W., Lou S.Q., Zhang K. Recovery of function in osteoarthritic chondrocytes induced by p16INK4a-specific siRNA in vitro. Rheumatology (Oxford) 2004;43:555-68.
18. Hay N., Sonnenberg N. Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 2004;18:1926-45.
19. Raught B., Gingras A.C., Sonenberg N. The target of rapamycin (TOR) proteins. Proc Natl Аcad Sci USA 2005;98:7037-44."
20. Lum J.J., DeBerardinis R.J., Thompson C.B. Autophagy in meta-zoans: cell survival in the land of plenty. Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:439-48.
21. Roach H.I., Aigner T., Kouri J.B. Chondroptosis: a variant of apoptotic cell death in chondrocytes? Apoptosis 2004;9:265-77.
22. Lu B., Capan E., Li C. Autophagy induction and autophagic cell death in effector T cells. Autophagy 2007;3:158-9.
23. Wei Y., Sinha S., Levine B. Dual role of JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 in autophagy and apoptosis regulation.
Autophagy 2008;4:949-51.
24. Patel V.A., Lee D.J., Longacre-Antoni A. et al. Apoptotic and necrotic cells as sentinels of local tissue stress and inflammation: Response pathways initiated in nearby viable cells. Autoimmunity 2009;42:317-21
25. Zhu M., Chen M., Zuscik M. et al. Inhibition of beta-catenin signaling in articular chondrocytes results in articular cartilage destruction. Arthr Rheum 2008;58:2053-64.
26. Aigner T., Hemmel M., Neureiter D. et al. Apoptotic cell death is not a widespread phenomenon in normal aging and osteoarthritis human articular knee cartilage: a study of proliferation, programmed cell death (apoptosis), and viability of chondrocytes in normal and osteoarthritic human knee cartilage. Arthr Rheum 2001;44:1304-12.
27. Goldring S.R., Goldring M.B. The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis. Clin Orthopaed 2004;427(Suppl.):S27-S36.
28. Goldring S.R., Berenbaum F. The regulation of chondrocyte function by proinflammatory mediators: prostaglandins and nitric oxide. Clin Orthopaed 2004;427(Suppl.):S37-S46.
29. Benito M.J., Veale D.J., FitzGerald O. et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals Rheum Dis 2005;64:1263-7.
30. Fernandes J.C., Martel-Pelletier J., Pelletier J.P. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology. Biorheology 2002;39:237-46.
31. Лимфоциты - методы. Под. ред. Д. Клауса М., 1990.
32. Batliwalla F.M., Baechler E.C., Xiao X. et al. Peripheral blood gene expression profiling in rheumatoid arthritis. Genes Immun 2005;6:388-97.
33. Bonnet C.S., Walsh D.A. Osteoarthritis, angiogenesis and inflammation. Rheumatology 2005;44:7-16.
34. Poole A.R. Cartilage in health and disease. In: Arthritis and allied conditions: A textbook of rheumatology. Ed. 15. Ed. by
W. Koopman. Philadelphia: Lippincott, Williams, and Wilkins, 2005;223-69.
35. Abou-Shousha S.A., Salah E., Wagby E. Study of P53 in peripheral blood and synovial mononuclear cells of rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients and its relation to the degree of disease activity. Egypt J Immunol 2005;12:61-70.
36. Sigal L.H., Johnston S.L., Phillips P.E. Cellular immune responses to cartilage components in rheumatoid arthritis and osteoarthritis: a review and report of a study. Clin Exp Rheumatol 1988;6:59-66.
37. Бененсон Е.В., Тсай Е.Г., Табушалиева А.С. Иммунорегуля-торные нарушения и пролиферативная активность Т- и В-лимфоцитов при остеоартрозе. Ревматология 1989;2:45-9.
38. Conrozier T., Chappuis-Cellier C., Richard M. et al. Increased serum C-reactive protein levels by immunonephelometry in patients with rapidly destructive hip osteoarthritis. Rev Rhum Engl Ed 1998;65:759-65.
39. Spector T.D., Hart D.J., Nandra D. et al. Low-level increases in serum C-reactive protein are present in early osteoarthritis of the knee and predict progressive disease. Arthr Rheum 1997;40:723-7.
