Профилактика аллергии к белкам коровьего молока путем индукции пищевой толерантности гипоаллергенными детскими смесями Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

п

03)

4 2

5 4

атаци-

орбен-анифе-и фор-а и га-

юкций у

: 48.

10 веде-ая и ан-

id with-

1ИЯ ост-46(10):

ntrolied

)

Профилактика аллергии к белкам коровьего молока путем индукции пищевой толерантности гипоаллергенными детскими смесями

Рудольф Фрицше

Научно-исследовательский центр Nestle, Лозанна, Швейцария

Показано, что в результате перорального приема антигена подавляется специфический иммунный ответ организма на этот антиген. Этот метод, носящий название индукции толерантности, был продемонстрирован на примере использования интактных белков у животных моделей с целью предупреждения развития аллергических и аутоиммунных заболеваний. Целью данного исследования являлось определение возможности индукции толерантности к белкам коровьего молока (БКМ) с помощью пептидов, содержащихся в детских смесях на основе частично или высокогидролизованного белка коровьего молока. Пятинедельных крыс Sprague-Dawley вскармливали различными смесями. После этого животным вводили БКМ парентерально и определяли изменения в концентрации специфических lgE-антител к БКМ и уровне стимуляции тучных клеток кишечника. Результаты исследования показали, что после вскармливания молочной смесью на основе частичных гидролизатов белков у крыс снижался уровень специфических lgE-антител к : БКМ, а также подавлялось lgE-опосредуемое освобождение медиатора из тучных клеток кишечника (протеазы тучных

клеток крыс, сокращенно ПТККИ). При вскармливании высокогидролизованными смесями эффекта приобретения толерантности не наблюдалось. Исследование показало, что отдельные пептиды БКМ способны индуцировать специфическую толерантность к БКМ.

Ключевые слова: пищевая толерантность, белки коровьего молока, частично/высокогидролизованные смеси, иммуноглобулин Е, тучные клетки

Prevention of allergy to cow’s milk proteins by means of inducing food tolerance with hypoallergenic baby mixtures

Rudolph Fritzche

Scientific Research Centre Nestle, Lausanne, Switzerland

Oral administration of an antigen has been shown to result in inhibition of the systemic specific immune response to this antigen. This method named «tolerance induction» was demonstrated by the example of using intact proteins in animal models with the purpose to prevent development of allergic and autoimmune diseases. The present study was aimed at determining a possibility of inducing tolerance to cow’s milk proteins (CMP) by means of peptides contained in baby mixtures based on partial-or high-hydrolysed protein of cow’s milk. Five-day-old Sprague-Dawely rats were fed with various mixtures. After that, the animals received parenteral CMP, to be followed by determining the alterations in the concentration of specific IgE-antibodies to CMP, and in the level of stimulation of the intestinal mast cells. The findings obtained in the study showed that after feeding with milk mixture based on partial hydrolysates of proteins, the rats showed decreased level of specific IgE-antibodies to CMP, as well as inhibition of IgE-mediated release of the mediator from the intestinal mast cells (murine mast cell protease, abbreviated MMCPII). No effect of acquisition of tolerance was observed in feeding with high-hydrolysed mixtures. The study showed that separate peptides of CMP are capafble of inducing specific tolerance to CMPs.

Key words: food tolerance, cow’s milk proteins, partially/highly hydrolysed mixtures, IgE, mast cells

Считается, что приобретение толерантности к пищевым антигенам в результате иммунной регуляции предупреждает развитие пищевой аллергии [1]. На животных моделях было показано, что приобретению специфической иммунологической пищевой толерантности способствует вскармливание интактными белками [2-4]. Важную

Для корреспонденции:

Dr.R.Fritsch6, Nestec Ltd. Research Center. Vers-chez-les-Blanc, P.O.Box 44, CH-1000 Lausanne 26, Switzerland Phone: +41/21 785 86 83, Fax: +41/21 785 85 49 e-mail: rodolphe.fritsche @ rdls.nestle.com

Статья поступила 17.01.2003 г., принята к печати 21.04.2003 г.

роль в этом процессе играет возраст организма хозяина и доза вводимого антигена [5]. В то же время возможность индукции толерантности с помощью фрагментов антиге-новили продуктов их переработки изучена крайне недостаточно [6, 7] .

В настоящей работе в эксперименте на животных изучали возможность индукции пищевой толерантности к белкам коровьего молока путем вскармливания продуктами их ферментативного гидролиза. В качестве животной модели использовали крыс, которые получали питание без ограничения. В качестве репрезентативного белка был выбран р-лактоглобулин (|ЗЛГ), поскольку он обладает выраженной

Г

I

аллергенной активностью и является основным белком сыворотки коровьего молока.

Материалы и методы

Молочные смеси

Крыс кормили следующими смесями промышленного изготовления: стандартной смесью НАН на основе цельного коровьего молока; смесью НАН ГА (ВЕВА-НА) на основе частично гидролизованных (трипсин) сывороточных белков; смесью АЛФАРЕ на основе высокогидролизованных (панкреатин) сывороточных белков.

Протокол исследования

Разным группам крыс давали различные экспериментальные жидкие молочные смеси или воду (контрольная группа) без ограничения в бутылочках для питья и сухие питательные пилюли, не содержащие молока, на протяжении 19 дней. Животные получали следующие продукты: группа А - смесь НАН; группа В - смесь НАН ГА (ВЕВА-НА); группа С - смесь АЛФАРЕ; группа D - воду. Все смеси разводились до концентрации 120 г/л. На 5-й день все крысы были подвергнуты иммунизации путем подкожной инъекции раствора, содержащего 0,1 мг РЛГ + 0,1 мг яичного белка в 0,05 мл 0,15М NaCI в смеси с 0,2 мл 3% А1(ОН)3. Спустя 14 дней после иммунизации, все животные получили внутрь концентрат сывороточного белка (1 г / 2 мл) и через 2 часа были умерщвлены. Затем был произведен забор крови. Сыворотку хранили в замороженном виде при - 80°С.

Определение специфических 1дЕ-антител производилось с помощью стандартного набора реактивов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)

Для этого РЛГ (или яичный белок) наносили на пластины для микротитрования и выдерживали в течение 24 ч при 4°С, затем фиксировали желатином, полученным из рыб, выдерживали в течение 90 мин при комнатной температуре, промывали буфером PBS-Tween и добавляли исследуемую сыворотку в различном разведении [8]. После этого пластины инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, промывали и инкубировали с антителами овцы к иммуноглобулинам крыс в течение 1 ч при комнатной темНЬратуре. Пластины промывали еще раз, после чего инкубировали с антителами, мечеными пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. После завершающей промывки добавляли субстрат о-фениленадиамина и спустя 15 мин определяли оптическую плотность при 492 нм. Концентрации антител выражали в виде логарифмов (по основанию 5) титров максимальных разведений сыворотки в сравнении с нормальной сывороткой крыс в разведении 1 : 5, рассматриваемой в качестве отрицательного контроля. Специфичность антисыворотки к IgE крыс проверяли на IgE миеломы крыс IR-2 и поликлональных IgG крыс.

Определение количества освобождаемого эН-серотонина

Проводили с целью уточнения уровня аллергенности белка коровьего молока в молочных продуктах. Тучные клетки

брюшины от здоровых крыс пассивно сенсибилизировали IgE-антителами крыс к рЛГ, мечеными 3Н-серотонином, а затем инициировали освобождение медиатора самим РЛГ или смесями на основе коровьего молока в различных разведениях в соответствии с опубликованной методикой [8]. Перитонеальные лаважи получали с использованием среды Eagle, модифицированной по Dulbecco, содержащей 10% сыворотку телячьего эмбриона. Клетки промывали указанной средой, а затем выдерживали в течение ночи при 4°С. После двух промывок в фосфатно-НЕРЕв-желатиновом буфере (PHG) с pH 7,0 из клеток готовили суспензию в концентрации 500 000 / мл. Добавляли эН-серотонин (10 мк-Кюри/мл) и 1 мл сыворотки крыс, содержащей IgE-антитела к (ЗЛГ. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч, трижды промывали в PHG, после чего готовили суспензию в 2 мл PHG. Освобождение медиатора инициировалось путем смешивания на пластинах для микротитрования 0,1 мл суспензии сенсибилизированных тучных клеток с 0,05 мл рЛГ или разведенной смеси на основе коровьего молока. Полученную смесь инкубировали в течение 60 мин при 37°С, а затем центрифугировали. После этого с помощью счетчика р-частиц определяли радиоактивность аликвоты (0,05 мл) супернатанта.

Определение протеазы тучных клеток крыс (ПТККИ)

ПТККН поступает в кровь в результате IgE-опосредуемой стимуляции тучных клеток кишечника. По количеству ПТККН, освобождаемому в ответ на пероральную провокацию, можно судить о степени IgE-сенсибилизации или толерантности на уровне тучных клеток кишечника. Концентрации ПТККП измеряли с использованием стандартного набора реактивов для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (производитель Moredun Animal Health Ltd., Эдинбург, Шотландия). При подготовке образцов использовали принцип «сэндвича»: пластину покрывали слоем моноклональных антител к ПТККП, затем добавляли исследуемую сыворотку, после чего наносили слой поликлональных антител овцы к ПТККН, сцепленных с пероксидазой хрена.

Результаты исследования и их обсуждение

Остаточная аллергенность смесей, приготовленных на основе коровьего молока

Степень аллергенности смесей НАН, НАН ГА (ВЕВА-НА) и АЛФАРЕ, опосредуемой IgE-антителами к рЛГ, определяли по уровню освобождения эН-серотонина. На рис. 1 представлены кривые освобождения серотонина в зависимости от дозы для каждой из исследуемых смесей. На рисунке хорошо видно, что для того, чтобы инициировать освобождение одного и того же количества эН-серотонина, смеси НАН ГА (ВЕВА-НА) требуется в 1000 раз больше, чем смеси НАН (в пересчете на белковый эквивалент). Расчетные значения степени рлГ-специфической аллергенности смесей НАН, НАН ГА (ВЕВА-НА) и АЛФАРЕ составили, соответственно, 100; 0,1 и 0,0002 мг рЛГ/г белкового эквивалента.

Подавление специфических антител у крыс вследствие приобретения толерантности

Три смеси на основе коровьего молока сравнивали по их способности индуцировать антиген-специфическую толе-

ровали и, а за-ЛГ или !3веде-1ерито-Eagle, 1ворот-'й сре-После уфере ■рации и 1 мл ‘СЬ ин-1ЭЛИ в юбож-а пла-шизи-^ сме-’биро->вали.

|и ра-

I)

емой

5СТВу

зока-

голе-

нтра-

<або-

ана-

»дин-

вали

'КЛО-

‘мую

1НТИ-

А) и ял и :та-I от »ро-ние ГА АН ния \Н, но,

их

ie-

35000 г

30000

' 25000 -

° 20000

15000

10000

5000

' ALFARE

’ ВЕВА-НА

мкг белкового эквивапента/мл □ NAN

' BLG

Рис. 1. Остаточная рЛГ-специфическая аллергенность детских смесей, определенная по количеству 3Н-серотонина, освобождаемого из тучных клеток крыс, пассивно сенсибилизированных IgE-антителами крыс к рЛГ.

Показаны кривые зависимости освобождения 3Н-серотонина от дозы, полученные при стимулировании сенсибилизированных тучных клеток (ЗЛГ или смесями на основе коровьего молока

рантность. Несмотря на то что НАН ГА (ВЕВА-НА) оказалась в 1000 раз менее аллергенной смесью, чем НАН (согласно результатам, приведенным выше), обе смеси были эффективны с точки зрения индукции толерантности и в одинаковой степени подавляли специфический lgE-ответ на (3-лак-тоглобулин. Титр lgE-антител к (ЗЛГ у крыс, вскармливаемых указанными смесями, был более чем в 1000 раз ниже, чем у контрольных животных (рис. 2). Что касается смеси АЛФАРЕ на основе высокогидролизованного белка, то ее способность индуцировать толерантность оказалась практически нулевой: у животных, получавших АЛФАРЕ, не было отмечено снижения (ЗЛГ-специфических IgE. У животных, которых кормили НАН или НАН ГА (ВЕВА-НА), IgE-ответ к (ЗЛГ достоверно отличался от IgE-ответа у крыс, получавших АЛФАРЕ или воду (р < 0,00001). Титры IgE-антител к яичному белку не претерпели изменений ни в одной группе. Это позволяет предположить, что у выбранной нами животной модели приобретенная толерантность является антиген-специфиче-ской. Нами также было показано, что подавление специфических IgE в результате приобретения толерантности зависит от получаемой дозы питания: максимально! снижение титра антител отмечено при высоких дозах (120 г/л), при низких дозах (1,2 г/л) IgE-ответ подавлялся в меньшей степени [9]. Стимулирования выработки IgE у подопытных животных в результате вскармливания исследуемыми смесями не наблюдалось.

Подавление in vivo IgE-опосредуемого ответа тучных клеток кишечника

Диаграмма на рис. 3 показывает, что специфическое освобождение протеазы из тучных клеток слизистой кишечника (ПТККН) сенсибилизированных крыс можно подавить путем вскармливания смесями на основе цельных (НАН) или частично гидролизованных (НАН ГА, ВЕВА-НА) белков коровьего молока. Вскармливание высокогидролизованной смесью (АЛФАРЕ) не позволяет подавить сенсибилизацию тучных клеток кишечника, в результате чего при провокации

IgE-антитела к ВЛГ

NAN

ВЕВА-НА

IgE-антитела к яичному белку

ALFARE

Н20

Рис. 2. Подавление антител вследствие приобретения пищевой толерантности после вскармливания смесями. Логарифмы (log5) титров IgE-антител к рЛГ или яичному белку в сыворотке крови крыс, вскармливаемых НАН, НАН ГА (ВЕВА-НА), АЛФАРЕ или водой с целью индукции пищевой толерантности (определенные методом ELISA).

сывороточными белками происходит освобождение ПТККН точно так же, как это имеет место у крыс контрольной группы (получавших только воду). Уровни ПТККН, освобождаемой тучными клетками кишечника у крыс, приобретших толерантность в результате вскармливания НАН или НАН ГА (ВЕВА-НА), достоверно отличались от аналогичных показателей животных, получавших АЛФАРЕ или только воду (р < 0,00001).

В экспериментах на крысах было показано, что вскармливание смесью на основе частично гидролизованных белков коровьего молока с низкой аллергенностью (в 1000 раз меньшей, чем у смеси, приготовленной из цельного молока)

8000

-?7000

2

1-6000 £ 5000 1 4000

с[

S зооо

о

ш

О 2000 1000 о

Опыт 1

NAN

Опыт 2

Опыт 3

ВЕВА-НА

ALFARE

НоО

Рис. 3. Подавление in vivo ответа тучных клеток. Количество ПТККН, освобождаемой из тучных клеток кишечника крыс, вскармливаемых смесями НАН, НАН ГА (ВЕВА-НА), АЛФАРЕ или водой с целью индукции пищевой толерантности. Показаны сывороточные концентрации ПТККМ после провокации сывороточными белками, измеренные в трех опытах, проводившихся по одному и тому же протоколу.

i

1

способствует приобретению специфической толерантности к белкам коровьего молока. Смесь, содержащая высокогидролизованные белки коровьего молока, не обладает такой способностью.

В исследовании показано, что у крыс с приобретенной толерантностью в результате вскармливания смесью на основе частичных гидролизатов белков коровьего молока отмечается подавление специфических lgE-антител к коровьему молоку (снижение титра специфических IgE более чем в 100 раз). Подавление является антиген-специ-фическим, поскольку титр IgE-антител к яичному белку не меняется.

Результаты исследования показывают, что у крыс с приобретенной толерантностью в результате вскармливания смесью на основе частичных гидролизатов белков коровьего молока подавление аллергической реакции происходит также и на уровне кишечника. Показатель освобождения специфической ПТККИ из тучных клеток кишечника является верным индикатором сенсибилизации и активации тучных клеток in vivo [10]. Изменение этого показателя в результате приобретения толерантности показывает, что пептиды, содержащиеся в частично гидролизованной смеси, оказывают свое специфическое действие также и на уровне кишечника, который является органом-мишенью при аллергической реакции на белки коровьего молока. Показано, что способностью подавлять освобождение ПТККН обладает смесь на основе частично гидролизованных белков, чего нельзя сказать о высокогидролизованной смеси.

В исследовании было продемонстрировано, что отдельные пептиды белков коровьего молока, содержащиеся в частично гидролизованной смеси и отсутствующие в высокогидролизованной смеси, способствуют приобретению толерантности к белкам коровьего молока, подавляя образование специфических IgE-антител и ответ тучных клеток кишечника. В настоящее время мы занимаемся изучением характеристик толерогенной пептидной фракции, которая, как может быть показано, не содержит цельных белков и имеет молекулярную массу в диапазоне от 2 до 5 кД.

Общепризнанно, что с точки зрения предупреждения аллергии к коровьему молоку у грудных детей с наследственной атопической отягощенностью нет ничего лучше, чем грудное вскармливание. В то же время в случаях, когда грудное вскармливание таких детей из группы риска по каким-либо причинам невозможно, то, в соответствии с полученными нами результатами, при выборе смеси для искусственного вскармливания следует предпочесть смесь на основе частичных гидролизатов, а не высокогидролизованных белков, которая активно способствует приобретению долгосрочной толерантности к белкам коровьего молока.

Литература

1. Mowat A.M. The regulation of immune responses to dietary protein antigens. Immunol Today 1987; 8: 93-8.

2. Wells H.G., Osborne T.B. The biological reactions ot the vegetable proteins. J Infect Dis 1911; 8: 66-124.

3. Thomas H.C., Parrot D.M.V. The induction of tolerance to a soluble protein antigen by oral administration. Immunology 1974; 27: 631-9.

4. Hanson D.G., Vaz N.M., Maia L. et al. Inhibition of specific immune responses by feeding protein antigens. Int Arch Allergy Appl Immunol 1977; 55: 526-32.

5. Strobel S., Ferguson S. Immune responses to fed protein antigens in mice. Pediatr Res 1984; 18: 588-94.

6. Michael J.G. The role of digestive enzymes in orally induced immune tolerance. Immunol Invest 1989; 18:1049-54.

7. Hachimura S., Takahashi Y„ Fujikawa Y. Suppression of the systemic immune response to casein by oral administration of a tryptic digest of casein. Biosci Biotech Biochem 1993; 57' 1674-77.

8. Fritsche R. Bonzon M. Determination of cow milk formula allergenicity in the rat model by in vitro mast cell triggering and in vivo IgE induction. Int Arch Allergy Appl Immunol 1990; 93: 289-93.

9. Fritsche R. Pahud J.J. Pecquet S. Induction of systemic immunologic tolerance to [3-lactoglobulin by oral administration of a whey protein hydrolysate.J Allergy Clin Immunol 1997; 100: 266-73.

10. Turner M.W. Barnett G.E. Strobel S. Mucosal mast cell activation patterns in the rat following repeated feeding of antigen. Clin Exp Allergy 1990; 20: 421-7.

МЕЖДУНАРОДНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПЕЧАТЬ

£

Клиническое течение непереносимости белка коровьего молока и атопические заболевания у детей

Риск развития аллергии/непереносимости белка коровьего молока (А/НБКМ) в течение первого года жизни изучался у 1749 новорожденных, родившихся в 1995 г. в университетском госпитале г. Одене (Дания). Когда диагноз подтверждался, детям назначалась безмолочная диета до тех пор, пока провокационная проба с молоком не становилась отрицательной. Все дети с А/НБКМ были повторно осмотрены через 12 мес, и если клинические симптомы чувствительности к белку коровьего молока сохранялись, то им проводились повторные осмотры каждые 6 мес до 3-летнего возраста и затем каждые 12 мес до 15 лет. В целом прогноз А/НБКМ был благоприятным, с полным выздоровлением у 56% к 1 году, 77% - к 2 годам, 87% - к 3 годам, 92% - к 5 и 10 годам и 97% - к 15 годам жизни. Среди детей младше 10 лет у 41 % развилась бронхиальная астма и у 31 % - риноконъюнктивит. Дети с не-1дЕ-опосредованной НБКМ имели хороший прогноз, в то время как дети с 1дЕ-опосредованной АБКМ имели значительно больший риск развития аллергии к другим продуктам, астмы и риноконъюнктивита. До 18-месячного возраста наиболее распространенными диагнозами были: обструктивный бронхит - 20%, атопический дерматит - 14%, пищевая аллергия - 7%. Заболеваемость астмой возрастала с 2% у 1,5- летних детей до 9% у 10-летних, риноконъюнктивитом с <1% у 1,5-летних детей до 9% у 10-летних. В целом, текущая распространенность любого атопического заболевания составляла 20% в возрасте 1,5 лет, снижаясь до 14% к 5 годами и возрастая до 25% к 10 годам.

Источник: Host A., Halken S., Jacobsen Н.Р., et al. Pediatr Allergy Immunol 2002;13 Suppl 15:23-8.