ПРОДУКЦИЯ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА β И ИНТЕРЛЕЙКИНА-10 В СЕЛЕЗЕНКЕ МЫШЕЙ НА РАННЕМ СРОКЕ БЕРЕМЕННОСТИ ПРИ СПОНТАННЫХ И МУРАМИЛПЕПТИД-ЗАВИСИМЫХ АБОРТАХ

Артемьева Ксения Александровна; Богданова Ирина Марковна; Степанова Ирина Ильдаровна; Степанов Александр Алексеевич; Тихонова Наталия Борисовна; Болтовская Марина Николаевна; Калюжин Олег Витальевич; Земляков Александр Евгеньевич

Артемьева К.А.1, Богданова И.М.1, Степанова И.И.1, Степанов А.А.1, Тихонова Н.Б.1, Болтовская М.Н.1, Калюжин О.В.2, Земляков А.Е.3

Продукция трансформирующего фактора роста ß и интерлейкина-10 в селезенке мышей на раннем сроке беременности при спонтанных и мурамилпептид-зависимых абортах

1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117418, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 119991, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 295007, г. Симферополь, Российская Федерация

Резюме

Введение. Материнский иммунный ответ является ключевой детерминантой успешного развития беременности. Среди множественных молекул-регуляторов локальных и системных механизмов формирования иммунной толерантности к фетоплацентарному «трансплантату» ведущую роль играют цитокины интерлейкин(ИЛ)-10 и трансформирующий фактор роста в (ТФРр). Взаимосвязь между уровнем продукции ИЛ-10 и ТФРр в периферических органах иммунной системы in vivo и частотой эмбриональных потерь при экспериментальном невынашивании беременности изучена недостаточно.

Цель исследования - на моделях спонтанных и мурамилпептид-зависимых абортов оценить уровень продукции ИЛ-10 и ТФРр в селезенке беременных мышей на раннем сроке гестации.

Материал и методы. Аллогенную физиологическую беременность воспроизводили спариванием самок CBA/lac (H-2k) с самцами Balb/c (H-2d), модель спонтанных абортов -спариванием самок CBA/lac с самцами DBA/2J (H-2d). Для моделирования индуцированных и потенцированных абортов самкам CBA/lac, оплодотворенным, соответственно, самцами Balb/c или DBA/2J, на 5-й и 7-й дни гестации (ДГ) внутрибрюшинно вводили Р-гептилгликозид мурамилдипептида (С7МДП) в дозе 20 мкг на 1 животное. Животных выводили из эксперимента на 8-й ДГ. Цитокин-продуцирующие клетки в срезах селезенки выявляли методом иммуногистохимического анализа с использованием кроличьих поликлональных антител к ТФРр и козьих поликлональных антител к ИЛ-10. Плотность распределения ТФРр+- и ИЛ-10+-клеток определяли методом морфометрии с помощью программы Image Scope M. Цифровые данные анализировали в программе Sigma Stat 3.5; различия считали значимыми приp < 0,05.

Результаты. Плотность ИЛ-10+- и ТФРр+-клеток в селезенке при спонтанных абортах была вдвое меньше, чем при физиологической беременности. В условиях исходно высокофертильного спаривания введение С7МДП беременным мышам (индуцирование абортов) приводило к повышению плотности распределения ИЛ-10+-клеток. Плотность ТФРр+-клеток при этом не изменялась. У беременных мышей с исходно высоким уровнем спонтанных репродуктивных потерь воздействие С7МДП (потенцирование абортов) вызывало увеличение плотности ИЛ-10+- и ТФРр+-клеток. Локализация ТФРр в функциональных структурах селезенки не различалась при физиологической беременности и при спонтанных абортах. Мурамилпептид-зависимые аборты характеризовались увеличением ТФРр-положительных структурно-функциональных зон.

Заключение. Увеличение частоты эмбриональных потерь по сравнению с физиологической беременностью происходило на фоне снижения плотности ИЛ-10- и ТФРр-продуцирующих клеток в селезенке при спонтанных абортах и увеличения плотности ИЛ-10+-клеток при индуцированных абортах. Продукция ТФРр усиливалась при потен-

Для корреспонденции

Артемьева Ксения Александровна -кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории патологии репродукции ФГБНУ НИИ морфологии человека Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1014-752X

цированных абортах по сравнению со спонтанными. Увеличение плотности распределения ИЛ-10+-клеток при индуцированных абортах и расширение локализации ТФРр+-зон в селезенке при индуцированных и потенцированных мурамилпептид-зависимых абортах не отменяло абортогенного действия С7МДП.

Ключевые слова: иммунная толерантность; цитокины; мурамилпептид; р-гептилгликозид мурамилдипеп-тида; селезенка; модели невынашивания беременности на мышах

Статья получена 16.02.2021. Принята в печать 18.03.2021.

Для цитирования: Артемьева К. А., Богданова И.М., Степанова И.И., Степанов А. А., Тихонова Н.Б., Болтов-ская М.Н., Калюжин О.В., Земляков А.Е. Продукция трансформирующего фактора роста р и интерлейкина-10 в селезенке мышей на раннем сроке беременности при спонтанных и мурамилпептид-зависимых абортах. Иммунология. 2021, 42 (2): 131-139. Б01: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-2-131-139

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Минобрнауки России (№ АААА-А17-117013050049-3).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Artemieva K.A.1, Bogdanova I.M.1, Stepanova I.I.1, Stepanov A.A.1, Tikhonova N.B.1, Boltovskaya M.N.1, Kalyuzhin O.V.2, Zemlyakov A.E.3

Production of transforming growth factor p and interleukin-10 in the mouse spleen at early stage of gestation in models of spontaneous and muramylpeptide-dependent abortions

1 Research Institute of Human Morphology, Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 117418, Moscow, Russian Federation

2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation

3 V.I. Vernadsky Crimean Federal University, Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 295007, Simferopol, Russian Federation

Abstract

Introduction. The maternal immune response is a key determinant of successful pregnancy development. Among the multiple local and systemic mechanisms of immune tolerance formation to the fetoplacental «graft», the regulatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor p (TGFp) play the leading role. However, the relationship between the production levels of IL-10 and TGFp in peripheral organs of the immune system in vivo and the frequency of fetal losses in experimental pregnancy failure has not been sufficiently studied.

The aim of the study was to evaluate the production levels of IL-10 and TGFp in the spleen of pregnant mice in models of spontaneous and muramylpeptide-dependent abortions at early gestational age.

Material and methods. Allogeneic physiological pregnancy was reproduced by crossing CBA/lac females (H-2k) with Balb/c males (H-2d) and the model of spontaneous abortion by mating females with DBA/2J males (H-2d). To model induced and potentiated abortions, CBA/ lac females fertilized by Balb/c or DBA/2J males, respectively, were intraperitoneally injected with muramyl dipeptide p-heptylglycoside (C7MDP) at the dose of 20 ^g per 1 animal on days 5 and 7 of gestation (DG). Animals were removed from the experiment at the 8th DG. Cytokine-producing cells in spleen sections were detected by immunohistochemical analysis using rabbit polyclonal antibodies to TGFp and goat polyclonal antibodies to IL-10. The density of TGFp+-and IL-10+-cells was determined by morphometry using Image Scope M software. The digital data were analyzed using Sigma Stat 3.5 software, the differences were considered significant atp < 0.05.

Results. The density of IL-10+- and TGFp+-cells in the spleen in spontaneous abortions was half that in physiological pregnancy. Under the conditions of baseline high-fertility crosses, injection of C7MDP into pregnant mice (induction of abortion) resulted in an increase in the density of IL-10+-cells, while the density of TGFp+-cells did not change. In pregnant mice with

For correspondence

Ksenia A. Artemieva - PhD, Researcher, Laboratory of Reproduction pathology, Research Institute of Human Morphology, Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1014-752X

initially high levels of spontaneous reproductive losses, exposure to C7MDP (abortion potentiation) caused an increase in the density of IL-10+- and TGFp+-cells. Localization of TGF-p in spleen functional structures did not differ between physiological pregnancy and spontaneous abortions; muramylpeptide-dependent abortions were characterized by an increase in TGFp-positive structural and functional areas.

Conclusion. The increased incidence of fetal losses compared with physiological pregnancy occurred against the background of decreased IL-10- and TGFp-producing cell density in the spleen in spontaneous abortions and increased IL-10+-cell density in induced abortions. TGFp-production was increased in potentiated abortions compared to spontaneous abortions. The increased density of IL-10+-cell distribution in induced abortions and the increased localization of TGF-p+-zones in the spleen in induced and potentiated muramylpeptide-dependent abortions did not abolish the abortogenic effect of C7MDP.

Keywords: immune tolerance; cytokines; muramylpeptide; muramyl dipeptide p-heptylglycoside; spleen; mouse models of pregnancy failure

Received: 16.02.2021. Accepted: 18.03.2021.

For citation: Artemieva K.A., Bogdanova I.M., Stepanova I.I., Stepanov A.A., Tikhonova N.B., Boltovskaya M.N., Kalyuzhin O.V., Zemlyakov A.E. Production of transforming growth factor p and interleukin-10 in the mouse spleen at early stage of gestation in models of spontaneous and muramylpeptide-dependent abortions. Immunologiya. 2021; 42 (2): 131-9. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-2-131-139 (in Russian)

Funding. The work was performed in the framework of the state task of Research Institute of Human Morphology of MSHE of Russia (No. AAAA-A17-117013050049-3).

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Введение

Иммунная система матери играет важную роль в репродуктивном процессе. Беременность - физиологическая ситуация, при которой ключевым фактором, позволяющим избежать иммунного отторжения полуаллогеного плода при контакте с иммунной системой матери, является индукция иммунной толерантности к фетальным антигенам. В настоящее время очевидно, что иммунная система матери способна распознавать отцовские антигены в тканях эмбриона и формирующейся плаценты и индуцировать состояние транзиторной физиологической толерантности к полуаллогенному плоду. Уже в ранние сроки беременности в периферической крови у человека и грызунов обнаруживают Т-клетки и антитела, реагирующие с отцовскими антигенами. Наряду с защитой репродуктивного тракта от инфекционных агентов иммунная система должна быть адаптирована к ряду физиологических событий репродуктивного цикла. В создании благоприятного микроокружения в сайте взаимодействия «мать-плод» принимают участие различные типы клеток, включая Т-регуляторные клетки (T regulatory cells, Treg), естественные киллерные клетки, децидуальные стромальные клетки, дендритные клетки, альтернативно активированные супрессорные М2-макрофаги (МФ) и иммуномодулирующие мультипотентные мезенхималь-ные стромальные клетки [1-3]. Кроме того, существуют многочисленные локальные и системные механизмы, которые действуют в течение всего срока беременности, предупреждая материнскую иммунную атаку на плод.

Регуляторые цитокины интерлейкин(ИЛ)-10 и трансформирующий фактор роста Р (ТФРР) являются ключевыми участниками врожденного и адаптивного им-

мунного ответа [4, 5]. Первым идентифицированным источником ИЛ-10 стали ТЫ-клетки. Позже была продемонстрирована продукция этого цитокина клетками миелоидной и лимфоидной линий системы врожденного и адаптивного иммунитета (дендритные клетки, МФ, лимфоидные клетки врожденного иммунитета, эози-нофилы, нейтрофилы, В-клетки, Treg, СБ8+- и СБ4+-Т-клетки, ТЫ- и ТЫ7-клетки), а также тучными клетками [6, 7]. В последнее десятилетие активно изучается роль ИЛ-10-продуцирующих В-регуляторных клеток (Breg) в становлении и развитии беременности [8].

ТФРр играет существенную роль в поддержании иммунного гомеостаза, формировании толерантности и регуляции иммунного ответа, определяя развитие и дифференцировку Т-клеток. ТФРр направляет диффе-ренцировку Т-клеток тимуса в естественные Т-клетки-киллеры (НКТ), естественные регуляторные Т-клетки (пТ^) и СБ8+-Т-клетки. Цитокин модулирует иммунную толерантность, подавляя пролиферацию высокоаффинных СБ4+- и СБ8+-Т-клеток и дифференцировку в ТЫ-, ТЫ- и цитотоксические Т-лимфоциты. ТФРр ингибирует пролиферацию пТ^, но обеспечивает их поддержание в периферических лимфоидных органах. В сочетании с другими цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-23) он способствует дифференцировке периферических индуцированных клеток (ГТ^), определяет функциональный статус ТЫ7-клеток. Помимо воздействия на Т-клетки, ТФРр снижает уровень пролиферации В-клеток, уменьшает активность макрофагов, дендритных клеток и естественных киллеров [9, 10].

ИЛ-10 и ТФРр являются основными эффекторными молекулами Treg, обеспечивающими формирование гес-тационной иммунотолерантности. ТФРр играет крити-

ческую роль в развитии Treg, поскольку СБ4+-Т-клетки, дефицитные по передаче сигналов ТФРß, не могут дифференцироваться в Treg in vitro или in vivo [11, 12].

В ряде экспериментальных исследований на различных моделях невынашивания аллогенной и сингенной беременности (спонтанные аборты, инфицирование самок Toxoplasma gondii, ИЛ-10-дефицитные мыши) продемонстрирована роль ИЛ-10 и ТФРß1 в поддержании беременности. Так, уменьшение частоты резорбции эмбрионов достигалось адоптивным переносом Treg, индуцированных ТФРß ex vivo, что приводило к увеличению сывороточных концентраций ИЛ-10 и ТФРß1 [13], введением рекомбинантного ИЛ-10 мыши, снижающим уровень апоптоза децидуальных Treg [14], воздействием рекомбинантного ТФРß человека, увеличивающим абсолютное количество Treg в плаценте, матке и селезенке самок, уменьшающим выраженность воспалительной реакции на границе «мать-плод», корригирующим плацентарный дисбаланс ИЛ-10/ФН0а [15, 16].

Нарушения в системе иммунорегуляции, ассоциированной с физиологической адаптацией к беременности, могут приводить к таким осложнениям, как самопроизвольные аборты. Иммунные механизмы невынашивания активно исследуют в моделях на мышах с разной частотой резорбции эмбрионов [17]. Так, хорошо изучена модель спонтанных абортов ÇCBA/Jx^DBA/2. Исследования на этой модели показали, что у самок со спонтанными абортами на 7-й день гестации (ДГ) в некоторых сайтах имплантации отсутствуют контакты между децидуальными клетками и клетками эктопла-центарного конуса, а также отмечается инфильтрация НК-, Т- и В-клетками [18], тучными клетками и МФ, обнаружен дефицит Th2-цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в фето-плацентарной единице и выраженный TM-тип иммунного ответа материнских Т-лимфоцитов. Th1-цитокины усиливают прокоагулянтную активность эндотелия сосудов, стимулируя продукцию протромбиназы fg12, что, в свою очередь, приводит к массивному отложению фибрина, тромбозам и ишемии плаценты [19]. В отличие от физиологической беременности, при спонтанных абортах не происходит увеличения популяции Treg в периферической крови, лимфоузлах, селезенке, а в тимусе и в децидуальной оболочке количество Treg падает [20].

Ранее нами было исследовано распределение клеток, продуцирующих ИЛ-10 и ТФРß, в маточно-плацентарных единицах (МПЕ) самок мышей CBA с физиологической беременностью, спонтанными и мурамилпеп-тид-индуцированными и потенцированными абортами, различающимися уровнем эмбриональных потерь на 8-й ДГ (12,5; 34,8; 46,7 и 50,0 % соответственно) [21]. Однако связь между продукцией ИЛ-10 и ТФРß в периферических органах иммунной системы и повышением частоты резорбции эмбрионов при мурамилпептид-за-висимых абортах не исследована.

Цель работы - оценить уровень продукции ИЛ-10 и ТФРß в селезенке беременных мышей на моделях спонтанных, индуцированных и потенцированных абортов.

Материал и методы

Моделирование физиологической беременности, спонтанных и иммунозависимых абортов. В исследовании использовали самок линии CBA/lac (H-2k) и самцов линий DBA/2J (H-2d), Balb/c (H-2d) с массой тела 20-25 г, полученных из филиала «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России. Эксперименты осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). На проведение эксперимента было получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека (протокол № 6А от 19 октября 2009 г.).

Модель аллогенной физиологической беременности воспроизводили спариванием самок CBA/lac с самцами Balb/c, модель спонтанных абортов - спариванием самок CBA/lac с самцами DBA/2J. День появления копуля-тивной пробки обозначали как 1-й ДГ. Моделирование индуцированных и потенцированных абортов осуществляли путем двукратного внутрибрюшинного введения иммуномодулятора ß-гептилгликозида мурамилдипеп-тида (С7МДП) в дозе 20 мкг на 1 животное (~ 1 мг/кг) самкам CBA/lac, оплодотворенным, соответственно, самцами Balb/c или DBA/2, в период между завершением имплантации (5-й ДГ) и началом формирования плаценты (7-й ДГ) [21]. Для проведения исследования были сформированы экспериментальные группы самок с физиологической беременностью и вариантами невынашивания (спонтанные, индуцированные и потенцированные аборты) по 6 особей в каждой. Мышей выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом на 8-й ДГ.

Иммуногистохимическое исследование. Селезенку фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, подвергали стандартной гистологической проводке через спирты восходящей концентрации (70°, 80°, 96°, 100°) и хлороформ в аппарате «Tissue-Tek» (Sakura, США), заливали в гистомикс и получали срезы толщиной 5-8 мкм на микротоме «Microm HM340E» (Thermo Scientific, США), которые монтировали на стекла с адгезивным покрытием «Superfrost Plus» (Menzel/Thermo Fisher Scientific, США). При проведении иммуногис-тохимической (ИГХ) реакции в качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные анти-ТФРß-антитела (ab 66043, 1 : 100, Abcam, Великобритания) и козьи поликлональные анти-ИЛ-10-антитела (sc-1783, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology, США). Вторичными антителами служили кроличьи поликло-нальные антитела к IgG козы, меченные пероксидазой хрена (ab 6741, Abcam, Великобритания). Использовали систему детекции «Lab Vision™ Ultra Vision™ LP Detection System: HRPPolymer/DABPlus Chromogen» (TL-015-HD) (Thermo Scientific, Великобритания). Негативным контролем служили срезы селезенки, инкубированные без первичных антител. По окончании ИГХ-реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Морфометрические методы. Морфометрическое исследование проводили на микроскопе «Leica DM 2500» с цифровой фотокамерой при помощи графического планшета и программы Image Scope M (Leica Microsystems GmbH, Германия). В 10 полях зрения при 200-кратном увеличении оценивали плотность распределения ТФРß+- и ИЛ-10+-клеток на 100 клеток селезенки (индекс плотности, ИП), а также локализацию и интенсивность ИГХ-реакции с антителами к ТФРß. Интенсивность окрашивания определяли полуколичественно, по формуле HScore = X P(i) х i, где i -интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (0 - отсутствие окрашивания, 1 - слабое, 2 - умеренное, 3 - сильное), r(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью (от 0 до 100 %) [22].

Статистическая обработка. Данные анализировали с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США). Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали по критерию Колмо-

горова-Смирнова, для сравнения двух выборок использовали непараметрический [/-критерий Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы и квартилей. Различия считали значимыми прир < 0,05.

Результаты

После проведения ИГХ-реакции с использованием антител к ИЛ-10 во всех структурно-функциональных зонах селезенки выявляли изолированные ИЛ-10+-клетки. При физиологической беременности индекс плотности ИЛ-10+-клеток в селезенке составил 18, что почти в 2 раза превысило показатель плотности распределения этих клеток в селезенке самок со спонтанными абортами (9,5). После введения С7МДП в ранние сроки беременности ИП ИЛ-10+-клеток в селезенке значимо увеличился в группах индуцированных и потенцированных абортов по сравнению с группами физиологической беременности и спонтанных абортов -31 против 18 и 20 против 9,5 соответственно (табл. 1).

Распределение ТОГ-Р+-клеток в селезенке

Ув. х100. А — физиологическая беременность; Б — спонтанные аборты; В — индуцированные аборты; Г — потенцированные аборты.

Таблица 1. Плотность распределения ИЛ-10-продуцирующих клеток

Группа Индекс плотности (ИЛ-10+-клетки/100 клеток селезенки), Ме Q3)

Физиологическая беременность (1) 18,0 (14,25; 24,75)

Спонтанные аборты (2) 9,5 (5,5; 10,0)

Индуцированные аборты (3) 31,0 (24,75; 40,25)

Потенцированные аборты (4) 20,0 (11,25; 24,0)

Достоверность различий Р12 = 0,006 Р13 < 0,001 < 0,001 Рз-4 < 0,001

При ИГХ-исследовании экспрессии ТФРр в селезенке отмечали положительную реакцию с анти-ТФРр-антителами как в клетках, так и в окружающем внеклеточном матриксе. Анализ плотности распределения ТФРр+-клеток в селезенке показал, что при физиологической беременности ИП составил 30, этот же показатель в группе спонтанных абортов был вдвое меньше (15). При введении С7МДП плотность распределения ТФРр+-клеток в селезенке значимо увеличилась в группе потенцированных абортов по сравнению с группой спонтанных абортов - 21 против 15 соответственно (см. рисунок, табл. 2).

Оценка интенсивности ИГХ-реакции с анти-ТФРр-антителами по шкале Жсоге показала, что при физиологической беременности и индуцированных абортах интенсивность ТФРр-окрашивания клеток селезенки достоверно не различалась, при спонтанных абортах была выше, чем при физиологической беременности, а при потенцированных абортах - меньше, чем при

спонтанных. Интенсивность окрашивания ТФРР+-клеток при абортах, индуцированных и потенцированных мурамилдипептидом, значимо не различалась.

При определении локализации ТФРр в функциональных структурах селезенки не наблюдали различий между физиологической беременностью и спонтанными абортами - цитокин был визуализирован в красной пульпе и зоне периартериолярных лимфо-идных муфт (ПАЛМ-зона). Группы иммунозависимых абортов характеризовало увеличение числа структур с локализацией ТФРр. Так, при индуцированных абортах ТФРр-позитивными оказались клетки и внеклеточный матрикс красной пульпы, ПАЛМ-зоны и маргинальной зоны лимфоидных фолликулов, а при потенцированных абортах ТФРр+-реакция была обнаружена в красной пульпе, ПАЛМ-зоне, маргинальной зоне и в светлых центрах лимфоидных фолликулов (см. рисунок, табл. 2).

Таким образом, увеличение частоты эмбриональных потерь по сравнению с физиологической беременностью происходило на фоне снижения плотности ИЛ-10+-клеток в селезенке при спонтанных абортах и увеличения - при мурамилдипептид-зависимых индуцированных и потенцированных абортах. Иммунозависимые аборты характеризовались увеличением ТФРр-положительных структурно-функциональных зон селезенки.

Обсуждение

Ранее при изучении иммунного микроокружения в МПЕ мышей с различными вариантами течения беременности мы обнаружили, что при физиологической гестации плотность клеток, продуцирующих ТФРр и ИЛ-10, в МПЕ была значимо больше, чем у животных с высокой частотой спонтанных абортов [21]. В настоящей работе установлены сходные различия в плотности распределения ИЛ-10+- и ТФРр+-клеток в селезенках мышей: при физиологической беременности плотность этих клеток была вдвое выше, чем в группе спонтанных

Таблица 2. Плотность распределения и интенсивность окрашивания ТФРР-продуцирующих клеток, локализация ТФРр+-клеток и внеклеточного матрикса в функциональных зонах селезенки

Группа Индекс плотности (ТФРр+-клетки / 100 клеток селезенки), Ме ^1; Q3) Интенсивность окрашивания, Ш^ге, Ме ^1^3) Локализация

Физиологическая беременность (1) 30 (18; 42) 195,83 (157,29; 231,88) Красная пульпа, ПАЛМ-зона

Спонтанные аборты (2) 15 (14; 17) 234,03 (229,17; 236,46) Красная пульпа, ПАЛМ-зона

Индуцированные аборты (3) 36,5 (33; 44) 203,86 (186,25; 221,15) Красная пульпа, ПАЛМ-зона, маргинальная зона лимфоидных узелков

Потенцированные аборты (4) 21 (21; 26) 207,08 (198,96; 213,75) Красная пульпа, ПАЛМ-зона, маргинальная зона и светлый центр лимфоидных узелков

Достоверность различий Р12 = 0,002 Р13 = 0,494 Рм < 0,001 Р3-4 < 0,001 Р12 = 0,003 Р^з = 0,371 Р2-4 = 0,032 Р3-4 = 0,277

абортов. Это позволяет предположить общность или по крайней мере взаимосвязь локальных и системных регуляторных механизмов, направленных на сохранение беременности, и участие в них ИЛ-10- и ТФРр-продуцирующих клеток.

Введение С7МДП беременным мышам, приводящее к росту репродуктивных потерь, изменяло (усложняло) характер связи частоты резорбции эмбрионов с плотностью ИЛ-10+- и ТФРр+-клеток в селезенке. У беременных мышей с исходно высоким уровнем спонтанных репродуктивных потерь воздействие С7МДП (потенцирование абортов) вызывало увеличение плотности ИЛ-10+- и ТФРр+-клеток в селезенке, что ранее было продемонстрировано и в МПЕ [21]. Указанные изменения можно трактовать как проявление не только и не столько действия С7МДП, но и компенсаторных реакций, выраженность которых недостаточна для блокировки аборто-генного эффекта этого иммуностимулятора.

В условиях исходно высокофертильного спаривания введение С7МДП беременным мышам (индуцирование абортов) приводило к повышению плотности распределения ИЛ-10+-клеток в селезенке, тогда как в МПЕ этот показатель имел тенденцию к снижению на фоне статистически значимого падения тканевого содержания этого цитокина [21]. Плотность ТФРр+-клеток при этом не изменялась ни в селезенке, ни в МПЕ.

Очевидно, С7МДП усиливает иммунный ответ матери на аллоантигены плода, нарушая цитокиновый баланс на системном и локальном уровнях в неблагоприятном для прогрессирования беременности направлении [23]. В группе самок с потенцированными абортами С7МДП оказывает аддитивный эффект, усиливая нарушения иммунорегуляции, изначально существующие при спонтанных абортах.

При ИГХ-исследовании в селезенке отмечали положительную реакцию с анти-ТФРр-антителами как в клетках, так и во внеклеточном матриксе. Подобную картину наблюдали при выявлении ТФРр в селезенке мутантных Оа!а11о*-мышей на модели миелофиброза [24]. В ряде работ было показано, что в клетках ТФРр продуцируется и секретируется в неактивной форме в виде комплекса с LAP (ассоциированным с латентно-

■ Литература

1. Renaud S.J., Graham C.H. The role of macrophages in utero/placental interaction during normal and pathological pregnancy. Immunol. Invest. 2008; 37 (5): 535-64. DOI: https://doi. org/10.1080/088201130802191375

2. Minoz-Suano A., Hamilton A.B., Betz A.G. Gimme shelter: the immune system during pregnancy. Immunol. Rev. 2011; 241 (1): 2038. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2011.01002.x

3. Ning F., Liu H., Lash G.E. The role of decidual macrophages during normal and pathological pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2016; 75 (3): 298-309. DOI: https://doi.org/10.1111/aji.12477

4. Maloy K. J., Salaun L., Cahill R., Dougan G., Saunders N. J., Powrie F. CD4+CD25+TR cells suppress innate immune pathology through cytokine-dependent mechanism. J. Exp. Med. 2003; 197: 111-9. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20021345

5. Connor R.A., Anderton S.M. Inflammation-associated genes: risks and benefits to Foxp3+ regulatory T-cell function. Immunology. 2015; 146: 194-205. DOI: https://doi.org/10.1111/imm.12507

стью пептидом) и гликопротеином LTBP (латентным ТФРр-связывающим белком). Последний опосредует отложение комплекса во внеклеточном матриксе. Мат-рикс служит резервуаром и источником цитокина, который после воздействия активирующих факторов (ретиноевая кислота, фактор роста фибробластов, тромбоспондин-1, эндотоксин, активные формы кислорода, плазмин, матриксные металлопротеазы MMP-2 и MMP-9) высвобождается из комплекса, связывается с рецепторами и активирует сигнальные пути [9, 25]. Расширение ТФРр+-зон, очевидно, связано с тем, что при индуцированных и потенцированных абортах происходит увеличение объемных долей белой пульпы и Т-зависимой зоны периартериолярных лимфоидных муфт под воздействием С7МДП [26].

Заключение

Таким образом, в моделях спонтанных и С7МДП-зависимых абортов на мышах охарактеризованы особенности продукции ТФРр и ИЛ-10 в селезенке in vivo. Результаты, полученные на модели спонтанных абортов, дают основания полагать, что формирование иммунного микроокружения в зоне МПЕ и иммунные реакции в периферических лимфоидных органах взаимосвязаны. Не вызывает сомнения участие ТФРр и ИЛ-10 в регуляции не только системного, но и локального иммунного ответа на аллогенный эмбрион на раннем сроке беременности. В то же время выявленное увеличение плотности распределения ИЛ-10+-клеток и расширение локализации ТФРр+-зон в селезенке при иммунозависимых абортах, очевидно, имеющее компенсаторный характер, не способно обеспечить отмену абортогенного действия С7МДП.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования - Артемьева К.А., Богданова И.М., Земляков А.Е.; сбор и обработка материала - Артемьева К. А., Степанова И.И., Степанов А.А., Тихонова Н.Б.; статистическая обработка -Артемьева К. А.; написание текста - Артемьева К. А., Богданова И.М., редактирование - Болтовская М.Н., Калюжин О.В.

6. Ng T.H., Britton G.J., Hill E.V., Verhagen J., Burton B.R., Wraith D.C. Regulation of adaptive immunity: role of interleukin-10. Front. Immunol. 2013; 4: 129. DOI: https://doi.org/10.3389/fim-mu.2013.00129

7. Saraiva M., Vieira P., O'Garra A. Biology and therapeutic potential of interleukin-10. J. Exp. Med. 2020; 217 (1): e20190418. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20190418

8. Guzman-Genuino R.M., Diener K.R. Regulatory B cells in pregnancy: lessons from autoimmunity, graft tolerance, and cancer. Front. Immunol. 2017; 8: 172. DOI: https://doi.org/10.3389/fim-mu.2017.00172

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

9. Li M.O., Flavell R.A. TGF-beta: a master of all T cell trades. Cell. 2008; 134: 392-404. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.cell.2008.07.025

10. Yoshimura A., Wakabayashi Y., Mori T. Cellular and molecular basis for the regulation of inflammation by TGF-beta. J. Bio-chem. 2010; 147 (6): 781-92. DOI: https://doi.org/10.1093/jb/mvq043

11. Liu Y.Z., Zhang P., Li J., Kulkarni A.B., Perruche S., Chen W.J. A critical function for TGF-beta signaling in the development of natural CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Nat. Immunol. 2008. Vol. 9. P. 632-40. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.1607

12. Pyzik M., Piccirillo C.A. TGF-ß modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4 T cell subsets. J. Leukoc. Biol. 2007; 82: 335-46. DOI: https://doi.org/10.1189/jlb.1006644

13. Qiu T., Teng Y., Wang Y., Xu L. Adoptive transfer of transforming growth factor-ß1-induced CD4+CD25+ regulatory T cells prevents immune response-mediated spontaneous abortion. Re-prod. Fertil. Dev. 2015 May 14. DOI: https://doi.org/10.1071/ RD14503

14. Lao K., Zhao M., Li Zh., Liu X., Zhang H., Jiang Y., Wang Y., Hu X. IL-10 regulate decidual Tregs apoptosis contributing to the abnormal pregnancy with Toxoplasma gondii infection. Microb. Pathog. 2015; 89: 210-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.micpath. 2015.10.002

15. Zhao M., Zhang R., Xu X., Liu Y., Zhang H., Zhai X., Hu X. IL-10 reduces levels of apoptosis in Toxoplasma gondii-infected trophoblasts. PLoS One. 2013; 8 (2): e56455. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0056455

16. Zhao M., Zhang H., Liu X., Jiang Y., Ren L., Hu X. The effect of TGF-ß on Treg cells in adverse pregnancy outcome upon Toxoplasma gondii infection Front. Microbiol. 2017; 8: 901. DOI: https:// doi.org/10.3389/fmicb.2017.00901

17. Clark D.A. On use of animal models. Emerg. Top. Life Sci. 2020; 4 (2): 207-27. DOI: https://doi.org/10.1042/ETLS20200042

18. Gendron R.L., Baines M.G. Morphometric analysis of the histology of spontaneous fetal resorption in a murine pregnancy. Placenta. 1989; 10 (3): 309-18. DOI: https://doi.org/10.1016/0143-4004(89)90031-3

19. Kwak-Kim J., Park J.C., Ahn H.K., Kim J.W., Gilman-Sachs A. Immunological modes of pregnancy loss. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (6): 611-23. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-0897.2010.00847.x

20. Thuere C., Zenclussen M.L., Schumacher A., Langwisch S., Schulte-Wrede U., Teles A., Paeschke S., Volk H.D., Zenclussen A.C. Kinetics of regulatory T cells during murine pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2007; 58 (6): 514-23. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-0897.2007.00538.x

21. Артемьева К.А., Богданова И.М., Степанова И.И., Болтовская М.Н., Калюжин О.В., Степанов А.А., Земляков А.Е. Особенности иммунного микроокружения в плаценте и гравидарном эндометрии у мышей со спонтанными, индуцированными и потенцированными абортами. Иммунология. 2019; 40 (6): 26-33. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16004

22. Aeffner F., Wilson K., Martin N.T., Black J.C., Luengo Hendriks C.L., Bolon B., Rudmann D.G., Gianani R., Koegler S.R., Krueger J., Young G.D. The gold standard paradox in digital image analysis: manual versus automated scoring as ground truth. Arch. Pathol. Lab. Med. 2017; 141 (9): 1267-75. DOI: https://doi. org/10.5858/arpa.2016-0386-RA

23. Sykes L., MacIntyre D., Yap Xiao J., Teoh T.G., Bennett Ph.P. The Th1:Th2 dichotomy of pregnancy and preterm labour. Mediators Inflamm. 2012; 2012: 967629. DOI: https://doi. org/10.1155/2012/967629

24. Zingariello M., Ruggeri A., Martelli F., Marra M., Sancillo L., Ceglia I., Rana R.A., Migliaccio A.R. A novel interaction between megakaryocytes and activated fibrocytes increases TGF-ß bioavail-ability in the Gata1(low) mouse model of myelofibrosis. Am. J. Blood Res. 2015; 5 (2): 34-61.

25. Kubiczkova L., Sedlarikova L., Hajek R., Sevcikova S. TGF-ß - an excellent servant but a bad master. J. Transl. Med. 2012; 10: 183. DOI: https://doi.org/10.1186/1479-5876-10-183

26. Артемьева К.А., Калюжин О.В., Степанова И.И., Назимова С.В., Болтовская М.Н. Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы и плаценты при аллогенной беременности у мышей с высокой фертильностью и мурамилдипептид-индуцированными абортами. Клиническая и экспериментальная морфология. 2013; (4): 34-40.

■ References