CC BY
39
64
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
experimental gastroenterology
ПРОДУКЦИЯ ОКСИДА АЗОТА ТРОМБОЦИТАМИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ
Петросян Э. А., Боташев А. А., Терещенко О. А., Лайпанов А. М., Иванов В. В.
Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар
Петросян Эдуард Арутюнович Краснодар, ул. Седина, д. 4 Тел.: 8 (903) 410 1188 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Цель исследования — оценить роль оксид азота в формировании нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза при желчном перитоните. Работа выполнена на 31 беспородной собаке, которые были разбиты две группы: контрольную и опытную. У животных с 24-часовым желчным перитонитом обнаружено достоверное повышение количества тромбоцитов, содержания NO в сыворотке крови и уровня генерации NO тромбоцитами. Полученный результат указывает на развитие эндотелиальной дисфункции на фоне эндотоксикоза, который запускает механизм синдрома системной воспалительной реакции, повреждения и нарушения функции тромбоцитов и может быть одной из основных предпосылок развития коагулопатии. Полученные данные позволяют использовать тромбоцит в качестве клетки, отражающей процессы, происходящие в очаге воспаления и в эндотелии сосудов.
Ключевые слова: тромбоцит; оксид азота; эндотоксикоз; коагулопатия.
SUMMARY
The goal of research is to mark the role of the nitrogen oxide in formation of the violations of the vascular thrombocyte link of homeostasis in case of bilius peritonitis. The work was made on 31 mongrel dogs, which were divided into two groups: control and experimental. It's found that the animals with 24-hours bilious peritonitis have reliable increase of the thrombocytes'quantity, the content of nitrogen oxide in serum and the level of generation nitrogen oxide by the thrombocytes relatively the animals from the control group. Received result shows the development of endothelial dysfunction against the background of en-dotoxicosis, which runs the mechanism of the system inflammatory reaction; damage and the violation of thrombocytes'function, and can be one of the basic premise to development of coagulopathy. Received findings allow to use the thrombocyte as the cell shows the processes in the focus of inflammation and in the endothelium of vessels.
Keywords: thrombocyte; nitrogen oxide; endotoxicosis; coagulopathy.
Несмотря на внимание, уделяемое перитонитам, проблема желчного перитонита продолжает оставаться практически вне поля зрения исследователей, хотя смертность при этом заболевании, по данным различных авторов, колеблется от 10 до 34% [5; 6].
Одной из важнейших функций макрофагов и лейкоцитов при окислительном стрессе является респираторный взрыв, сопровождающийся
гиперпродукцией активных форм кислорода, в том числе и оксида азота [13; 14]. Взаимодействие оксида азота с супероксид-анион-радикалом образует высокотоксичный пероксинитрит (ONOO”), во многом определяющий интенсивность эндотоксикоза при окислительном стрессе [9]. В то же время роль тромбоцитов в биосинтезе оксида азота изучена крайне недостаточно. Интерес к изучению генерации оксида азота тромбоцитами появился после
обнаружения в тромбоцитах синтазы оксида азота [11]. Данные о том, что оксид азота, продуцируемый синтазой оксида азота тромбоцитов, ингибирует агрегацию тромбоцитов и проявляет антитромбо-генное действие в сосудистом эндотелии, могут иметь определенное клиническое значение.
В последние годы внимание исследователей при перитоните уделяется изучению механизмов возникновения эндотелиальной дисфункции в результате нарушения продукции оксида азота. Известно, что оксид азота синтезируется не только в эндотелиоцитах, но и в самих тромбоцитах. Оксид азота обладает мощным антиагрегационным эффектом, сдерживая проагрегационное действие тромбоксана А2, осуществляя тем самым саморегуляцию тромбоцитами собственной активности [10].
В процессе воспаления ведущая роль отводится реакции со стороны микроциркуляторного русла, повышенная проницаемость которого приводит к экссудации, обеспечивающей транспорт гистамина, кининов, лейкотриенов, тромбоксана, простациклина и оксида азота в очаг воспаления для его локализации, что свидетельствует о тесном взаимодействии эндотелия сосудов и тромбоцитов [7; 12]. С точки зрения микроциркуляции, кроме сосудистых реакций, оксид азота регулирует процессы агрегации и адгезии тромбоцитов к сосудистой стенке, то есть тромбоцитарный оксид азота является мощным медиатором воспаления, влияющим на интенсивность и качество этого процесса.
Цель исследования — оценить роль оксид азота в формировании нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза при желчном перитоните.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы 31 половозрелая собака-самец, весом 15 ± 2 кг, которые были разделены на две группы: в I контрольную группу для определения лабораторных показателей нормы были включены 31 животное; во II опытную группу вошли 26 животных с моделью 24-часового ЖП [3]. Для изучение генерации NO тромбоцитами в кровь в качестве антикоагулянта добавляли гепарин в концентрации 20 ед /мл. Для разделения эритроцитов от лейкоцитов и тромбоцитов к 6 мл крови добавляли равный объем 4%-ной суспензии декстрана-70 и полученную разбавленную кровь оставляли на 40 минут при комнатной температуре для осаждения эритроцитов. Верхний слой, богатый лейкоцитами и тромбоцитами, отбирали и разводили (1:1) фосфатным буфером (20 мМ, рН 7,4), содержащим 20 мМ ЭДТА, центрифугировали при 200 g в течение 10 минут. К верхнему слою, содержащему тромбоциты, добавляли ACD-буфер (лимонная кислота 0,8%, цитрат натрия 2,2 %, глюкоза 2,4%) в соотношении 8:1 и центрифугировали 10 минут при 200 g для удаления из тромбоцитар-ной суспензии контаминированных эритроцитов
и лейкоцитов. Надосадочную жидкость центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут [11]. Чистота выделения тромбоцитов составила 98%. Выделенные из крови тромбоциты разводили смесью, состоящей из среды RPMI 1640 (без фенолового красного) [13], эмбриональной телячьей сыворотки (5%), L-глутамина (2 мМ), гентами-цина (80 мкг/ мл), пенициллина (100 Ш мл), стрептомицина (100 мкг/ мл) [2; 4]. Этой смесью доводили концентрацию тромбоцитов до 0,5 х 108 в 0,5 мл и в таком объеме суспензию тромбоцитов вносили в лунки плашки для культуры тканей с 24 ячейками диаметром 16 мм (фирма Со$^т, США). «Холостая» проба (0,5 мл) не содержала тромбоцитов. Плашку закрывали крышкой и помещали в термостат (37 °С) на 15 часов.
После инкубации пробы центрифугировали 10 минут при 1500 g.
Для определения концентрации NO использовали реакцию Грисса [8]. К пробам добавляли равный объем реактива Грисса (1%-ный сульфаниламид, 0,1% N (1-нафтил) этилендиамин, 2,5 % Н3Рв4). Пробы инкубировали 10 минут при 37 °С. Оптическую плотность хромогенов проб определяли против «холостой» пробы при длине волны 546 нм. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия [1]. Исследование сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза проводили путем подсчета количества тромбоцитов в цельной крови на гематологическом анализаторе Ыейотс 620 и изучения их агрегационной активности с использованием гемолизат-агрегационного теста (агрескрин-тест). Исследования проводились до и после создания у животных экспериментального 24-часового желчного перитонита. Результаты исследований подвергались статистической обработке.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что сосудисто-тромбоцитарное звено представляет собой один из этапов свертывающей системы крови, для объективной оценки которого было исследовано количество тромбоцитов и его агрегационные свойства. Так, у животных с 24-часовым желчным перитонитом обнаружено достоверное повышение количества тромбоцитов до (317,04 ± 36,93) х 109/ л против (199,74 ± 19,40) х 109/л в контрольной группе (р < 0,05), что отражает экстенсивный механизм активации сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза за счет перераспределения тромбоцитов в сосудистом русле и их участие в процессах воспаления и репарации в качестве источника тромбоцитарных факторов роста, стимулирующих пролиферацию эндотелия и ингибирующих коллагеназы.
Б >
а
5 О
I- 2
О £
Я--
Щ а
Н1Ё £Е 2 ^ н ч
и
га
I.
Б
га
х
<
га
I-
х
ш
2
а
ш
с
и
V
т
1-Л
~о
№10/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
При исследовании содержания NO в сыворотке крови у животных с 24-часовым желчным перитонитом наблюдалось достоверное его повышение до 5,22 ± 0,22 мкмоль/л против 4,32 ± 0,16 мкмоль/л в контрольной группе (р < 0,05). При исследовании уровня генерации NO тромбоцитами в опытной группе животных также отмечалось достоверное его повышение до (1,52 ± 0,11 нмоль/0,5) х 108 тромбозу цитов против (1,07 ± 0,07 нмоль/0,5) х 108 тромбо-
§ цитов в контрольной группе (р < 0,05). Полученный
s результат указывает на развитие эндотелиальной
г дисфункции на фоне развития эндотоксикоза, ко° торый запускает механизм синдрома системного
| воспалительной реакции, повреждения и наруше-
* ния функции тромбоцитов и может быть одной
| ЛИТЕРАТУРА
S 1. Голиков П. П., Николаева Н. Ю., Гавриленко И. А. и др. // Пат.
физиол. — 2000. — № 2. — C. 6 - 9.
2. Луста И. В., Ситожевский А. В., Суслова Т. Е. Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. — М., 2000. — С. 193 - 194.
3. Патент РФ № 2175784, 10.11.2001. Петросян Э. А., Сергиенко В. И., Каде А.Х. Петровский А. Н. и др. Способ моделирования желчного перитонита // Бюл. 2001, № 31.
4. Шебзухов Ю. В., Вайсбурд М. Ю., Артюшкин К. В. и др. // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1998. — Т. 125. — С. 48 - 50.
5. Шуркалин Б. К., Кригер А. Ф., Филлер А. П. Осложнения при лапароскопической холецистэктомии // Эндоск. хир. — 1998. — № 4. — С. 12 - 16.
6. Amorotti C, Mosca D., Di Blasio P. Spontaneous and postoperative bile peritonitis. Surgical technique // Minerva Chir. — 2002. — Vol. 57, № 1. — P. 41 - 49.
7. Camilletti A., Moretti N., Giacchetti G. // Amer. J. Hypertension. — 2001. — Vol. 14. — P. 382 - 386.
из основных предпосылок развития коагулопатии. При изучении агрегационной активности тромбоцитов у животных с 24-часовым желчным перитонитом было выявлено усиление их агрегационных свойств на 31,8% (p < 0,01), что может являться фактором активации внутрисосудистого тромбо-образования.
Таким образом, у животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом наблюдаются тромбоцитоз и усиление агрегационных свойств тромбоцитов. Г иперпродукцию оксида азота в тромбоцитах можно объяснить его антитромбогенным действием и способностью ингибировать экспрессию адгезивных молекул эндотелия, что необходимо учитывать в клинической практике.
8. Green L. C., Wagner D. A., Glogowski J. G. Analysis of nitrate, nitrite and 15-Nnitrate in biological fluids // Anal. Biochem. — 1982. — Vol. 126, № 1. — P. 131 - 138.
9. Johnson M. L, Billiar Т. К. // World J. Surg. — 1998. — Vol. 22. — P. 187 - 196.
10. Knowels P., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // Biochem J. — 1994. — Vol. 298. — P. 819 - 820.
11. Mazzanti L., Mutus B. // Clin. Biochem. — 1997. — Vol. 30. —
P. 509 - 515.
12. Noris M. et al. Increased nitric oxide formation in reccurent
thrombotic microangiopathies: a possible mediator of microvascular injury // Am. J. Kidney Dis. — 1996. — Vol. 27, № 6. — P. 790 - 796.
13. Stolarek R., Kulf P., KurmanowskaZ. // Int. Clin. Lab. Res., — 1998. — Vol. 28. — P. 104 - 109.
14. Weinberg J. B., Musuconis M. A, Shami P.J. // Blood. — 1995. — Vol. 86. — P. 1184 - 1195.
