CC BY
60
Turczcminowia 19 (3): 120-122 (2016) ЩЯ1^ 1560-7259 (print edition)
DOI: 10.14258/tiirczaninow ia. 19.3.9 |||| TURCZANINOWIA
http://turczanin0wia.asu.ru ISSX 1560-7267 (online edition)
УДК 58.086:576.08
Проблемы стандартизации в проточной цитометрии растений
М. В. Скапцов, С. В. Смирнов, М. Г. Куцев, А. И. Шмаков
Алтайский государственный университет, Южно-Сибирский ботанический сад, пр. Ленина, 61, г. Барнаул, 656049, Россия. E-mail: [email protected]
Ключевые слова: проточная цитометрия, размер генома, ДНК, пропидий иодид, Ficus, Schefflera, Zamioculcas, Euryops.
Аннотация. В сообщении обсуждаются проблемы, возникающие при установлении стандартов в исследованиях по проточной цитометрии. Авторами предлагается к использованию ряд новых видов оранжерейных растений в качестве стандартов. Приводятся данные об относительном содержании их ДНК. Установлено, что
для Ficus benjamina 2С = 1,07 пг, Euryops chrysanthemoides 2С = 2,70 пг, Schefflera octophylla 2С = 4,65 пг, х Fatshedera lizei 2С = 6,34 пг, Davallia mariesii 2С = 15,37 пг, Zamioculcas zamiifolia 2С = 48,35 пг.
Problems of a standardization in plant flow cytometry
M. V. Skaptsov, S. V. Smimov, M. G. Kutsev, A. I. Shmakov
Altai State University, South-Siberian Botanical Garden, Lenina str., 61, Barnaul, 656049, Russia
Key words, flow cytometry, genome size, DNA, propidium iodide, Ficus, Schefflera, Zamioculcas, Euryops.
Summary. In this article problems of standardization in flow cytometry researches are discussed. Authors propose some new species of greenhouse plants to use as standards. Data of the relative nuclear DNA content of the species is presented. Nuclear genome sizes have been reported. Ficus benjamina 2C = 1.07 pg, Euryops chrysanthemoides 2C = 2.70 pg, Schefflera octophylla 2C = 4.65 pg, xFatshedera lizei 2C = 6.34 pg, Davallia mariesii 2C = 15.37 pg, Zamioculcas zamiifolia 2C = 48.35 pg.
Проблема стандартизации в проточной цитометрии растений особенно остро стояла в 90-х годах XX века. Ранее самыми распространенными стандартами являлись ядра эритроцитов кур (Gallus domesticus) и форели (Oncorhynchus mykiss) с размерами 2C = 2,5 пг и 2C = 3,746,60 пг соответственно (Pedersen, 1971; Ojima, Yamamoto, 1990; Animal genome ..., 2016), а также ядра лейкоцитов человека, 2С = 7,0 пг (Tiersch et al., 1989). Использование подобных стандартов позволяет работать только с красителем про-пидий иодидом (PI), но не с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), который используется в некоторых методах исследования генома. Од-
нако у этого метода окрашивания ядер есть особенность - зависимость от GC-состава ДНК, что зачастую вносит значительные погрешности, особенно при исследовании растений с крупным геномом. В связи с этими недостатками в исследовательских лабораториях мира рассчитывали содержание ДНК для нескольких «удобных» по тем или иным характеристикам растений относительно вышеуказанных стандартов Gallus domesticus, Oncorhynchus mykiss или Homo sapiens, которые в дальнейшем и использовали в качестве стандартов (Johnston et al., 1999; Dolezel, Bartos, 2005; Skaptsov et al., 2014). В настоящее время многие исследователи используют стан-
Поступило в редакцию 18.06.2016 Принято к публикации 29.08.2016
Submitted 18.06.2016 Accepted 29.08.2016
Turczaninowia 19 (3): 120-122 (2016)
121
дарты, приведенные в работах Dolezel et al. (1992, 1994, 1998), которые являются самыми распространенными в литературе, что в какой-то степени позволяет синхронизировать результаты, получаемые различными исследовательскими группами. Так, самыми распространенными из них являются Glycine max (2С = 2,50 пг), Pisum sativum (2C = 9,09 пг), Zea mays (2C = 5,43 пг), Allium cepa (2C = 34,89 пг). Тем не менее, приверженность к той или иной группе стандартов не позволяет получать абсолютные значения содержания ДНК. Кроме того, произошли корректировки размера генома человека, используемого в качестве стандарта. В результате полногеномного секвенирования был уточнен размер генома человека, и теперь точное содержание ДНК человека зафиксировали на уровне 6,294 миллиардов пар азотистых оснований или 6,43 пг; ранее использовался стандарт 2С = 7,0 пг (Initial sequencing..., 2001). В работе Dolezel et al. (2003) авторы рассуждают о новых сведениях по размеру генома человека, но, тем не менее, разработанные ранее системы стандартов растений используются до настоящего времени без корректировки. В свою очередь, все это влечет за собой проблему пересчета значений размеров генома видов растений, исследованных ранее, до корректировки стандарта человека. В этой связи наиболее значимыми являются данные о соотношении содержания ДНК между видами той или иной группы растений, а не их абсолютные значения.
Для объективных расчетов относительного содержания ДНК многие исследователи дополнительно используют в качестве стандартов культурные сорта растений, например, Vicia faba сорта 'Innovec', Secale cereale 'Dankovske',
Hordeum vulgare 'Sultan' и многие другие. Это связано с относительной однородностью генома этих сортов, а также с возможностью круглогодичного выращивания свежего материала из семян. Кроме того, при поддержке должной чистоты линий в сортах практически исключены изменения генома, связанные с гибридогенны-ми процессами. В некоторых случаях культурные сорта, размножаемые семенами, не всегда могут быть доступны для исследований в связи с коротким сроком вегетации/хранения семян или недоступностью сорта для исследователя. Столкнувшись с подобными проблемами, мы считаем целесообразным использовать, помимо быстро прорастающих однолетних видов, также оранжерейные и/или комнатные многолетние виды растений со стабильным геномом. Для этого мы подобрали неприхотливые широко распространенные комнатные и оранжерейные многолетние растения, из листьев которых легко выделялись интактные ядра. При этом мы учитывали, что рекомендуемые стандарты между собой должны быть отличающимися в разы по размеру генома, чтобы их можно было использовать для широкого спектра определяемых растений (табл. 1). В качестве внутреннего стандарта были использованы Pisum sativum сорт 'Ctirad' (2С = 9,09 пг), Vicia faba 'Innovec' (2С = 26,90 пг), Glycine max 'Polanka' (2С = 2,50 пг) и Bel-lis perennis (2С = 3,45 пг) (Dolezel, Bartos, 2005; Kubesovâ et al., 2010).
Изучаемые виды отличаются стабильностью генома; их можно использовать для исследования растений с широким диапазоном относительного содержания ДНК. Однако мы не рекомендуем использовать вариегатные и пестроокрашенные сортоформы и спорты исследуемых образцов.
Таблица 1
Относительное содержание ДНК и размер генома исследованных видов растений
Вид 2С (содержание 1С (размер гено- Стандарт
ДНК), пг ма), Мбп
Ficus benjamina L. 523,23 B. perennis,
дикий тип 1,07 G. max
'Barok' 1,06
'Natasja' 1,08
Euryops chrysanthemoides (DC.) B. Nord. 2,70 1320,30 P sativum
Schefflera octophylla Harms 4,65 2273,85 P. sativum
x Fatshedera lizei 6,34 3100,26 P. sativum
Davallia mariesii H. J. Veitch 15,37 7515,93 P. sativum,
V. faba
Zamioculcas zamiifolia (Lodd.) Engl. 48,35 23643,15 V. faba
Примечание: 1 пг ДНК = 978 Мбп (Dolezel et al., 2003)
Скапцов М. В. и др.
Проблемы стандартизации в проточной цитометрии растений
В то же время у Ficus benjamina было исследовано две сортоформы 'Barok' (имеет деформированные скрученные листья) и 'Natasja' (густо и мелкооблиственная форма) с нормальными и равномерно окрашенными зелеными листьями, а также дикий тип. Для всех трех образцов получены одинаковые значения по содержанию ДНК. На наш взгляд, использование сортоформ имеет некоторые преимущества. Обычно они получены однократно в процессе случайного или направленного мутагенеза и размножаются исключительно вегетативно. Поэтому исследователи всего мира будут иметь абсолютно одинаковый сравнительный стандарт, к тому же легко размножаемый вегетативно и произрастающий в
комнатных условиях. Особо с этой целью стоит отметить межродовой гибрид х Fatshedera lizei, полученный однократно в 1912 г. во Франции и представленный во всем мире одним клоном (мы не берем во внимание вариегатную и пестролистную сортоформы, полученные позже/ Также интересен и практичен в культивировании Zamioculcas zamiifolia (некарликовая форма), ко -торый относится к монотипному роду, а высокое содержание его ДНК позволяет исследовать виды растений с размером генома более 100 пг.
Благодарности. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант НШ-1417.2014.4.
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Animal genome size database (2016) URL: http://www.genomesize.com/result_species.php?id=906 (Accessed 02.09.2016).
Dolezel, J., Bartos, J. (2005) Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann. Bot. 95(1): 99-110. DOI: 10.1093/aob/mci005
Dolezel, J., Bartos, J., Voglmayr, H., Greilhuber, J. (2003) Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry Part A 51(2): 127-128. DOI: 10.1002/cyto.a.10013
Dolezel, J., Dolezelova, M., Novak, F. J. (1994) Flow cytometric estimation of nuclear DNA amount in diploid bananas (Musa acuminata and M. balbisiana). Biol. Plant. 36: 351 - 357. DOI: 10.1007/BF02920930
Dolezel, J., Greilhuber, J., Lucretti, S., Meister, A., Lysak, M., Nardi, L., Obermayer, R. (1998) Plant genome size estimation by flow cytometry: inter-laboratory comparison. Ann. Bot. 82: 17-26.
Dolezel, J., Sgorbati, S., Lucretti, S. (1992) Comparison of three DNA fluorochromes for flow cytometric estimation of nuclear DNA content in plants. Physiol. Plant. 85: 625-631. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1992.tb04764.x Johnston, J. S., Bennett, M. D., Rayburn, A. L., Galbraith, D. W., Price, H. J. (1999) Reference standards for determination of DNA content of plant nuclei. Am. J. Bot. 86(5): 609-613.
Kubesova, M., Moravcova, L., Suda, J., Jarosik, V., Pysek, P. (2010) Naturalized plants have smaller genomes than their non-invading relatives: a flow cytometric analysis of the Czech alien flora. Preslia 82: 81-96.
Initial sequencing and analysis of the human genome. International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Nature 409: 860-921. DOI: 10.1038/35057062
Ojima, Y., Yamamoto, K. (1990) Cellular DNA contents of fishes determined by flow cytometry. La Kromosomo 57: 1871-1888.
Pedersen, R. A. (1971) DNA content, ribosomal gene multiplicity, and cell size in fish. J. Exp. Zoology 177: 65-79. DOI: 10.1002/jez.1401770108
Skaptsov, M. V., Smirnov, S. V., Kutsev, M. G. (2014) Nuclear DNA content in some plant kinds used as an external standard in flow cytometry. Turczaninowia 17(3): 72-78 [In Russian]. (Скапцов М. В., Смирнов С. В., Куцев М. Г. Содержание ядерной ДНК в некоторых сортах растений, используемых в качестве внешних стандартов в проточной цитометрии // Turczaninowia, 2014. Т. 17, вып. 3. С. 72-78). DOI: 10.14258/turczaninowia.17.3.8
Tiersch, T. R., Chandler, R. W., Wachtel, S. S. M., Ellias, S. (1989) Reference standards for flow cytometry and application in comparative studies of nuclear DNA content. Cytometry 10: 706-710. DOI: 10.1002/cyto.990100606
