CC BY
35
МИКРОБИОЛОГИЯ
and Protozoan Diseases. Collection of Articles and Conference Abstracts [Novoe v diagnostike i lechenii gribkovykh i protozoynykh zabolevaniy. Sbornik statey i tezisov konferentsii]. Tashkent; 1998: 37-44. (in Russian) 9. Dekhkan-Khodzhaeva N.A., Shamsiev S.Sh., Shakirova R.Yu., Makarova G.I., Migbaeva Sh.N. Role in Paecilomyces in the etiology of protracted and recurrent bronchopulmonary diseases in children. Pediatriya. 1982; 61 (9): 12-4. (in Russian)
10. Akhunov V.M. Features of Bronchial Asthma with Paecilomycosis. Saarbrücken: M.: LAPLambertAcademicPublishing; 2014.
11. de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J. Atlas of Clinical Fungi. 2nd ed. Reus, Spain: Universitet Rovire i Virgili; 2000.
12. Luangsa-Ard J., Houbraken J., van Doorn T., Hong S.B., Borman A.M., Hywel-Jones N.L. et al. Purpureocillium, a new genus for the
medicali important Paecilomyces lilacinus. FEMS Microbiol Lett. 2011; 321 (2): 141-9.
13. Samson R.A. Paecilomyces and some allied Hyphomycetes. Studies in Mycology. 1974; (6): 113.
14. Sigler L., Gibas C.F., Kokotovic В., Bertelsen M.F. Disseminated mycosis in veiled chameleons (chamaeleo calyptratus) caused by Chamaeleomyces granulomatis, a new fungus related to Paecilomyces viridis. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (9): 3182-92.
15. Uys C.J., Don P.A., Schrire V., Barnard C.N. Endocarditis following cardiac surgery due to the fungus Paecilomyces. S. Afr. Med. J. 1963; 37: 1276-80.
Поступила 24.10.16.
Принята к печати 29.11.16
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.852.11.083.1
Шаров Т.Н., Червакова М.П., Баркова И.А., Барков А.М., Викторов Д.В., Топорков А.В.
ПРОБЛЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ВЕГЕТАТИВНОЙ ФОРМЫ влаиш АПТИЙАСМ МЕТОДОМ MALDI-ToF MS
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград
Описан опыт применения масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией для быстрой и надежной идентификации Bacillus anthracis, а также гетерологичных видов микроорганизмов. Освещены некоторые интересные особенности и трудности, возникшие в ходе идентификации.
К л ю ч е в ы е с л о в а: масс-спектрометрия; Bacillus anthracis; идентификация; штамм.
Для цитирования: Шаров Т.Н., ЧерваковаМ.П., БарковаИ.А., Барков А.М., Викторов Д.В., Топорков А.В. Проблемы идентификации различных штаммов вегетативной формы Bacillusanthracis методом MALDI-ToFMS. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (3): 316-318. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-3-316-318 Sharov T.N., ChervakovaM.P., BarkovaI.A., BarkovA.M., ViktorovD.V., ToporkovA.V.
THE PROBLEMS OF IDENTIFICATION OF VARIOUS STRAINS OF VEGETATIVE FORM OF BACILLUS ANTHRACIS USING MALDI-ToF MS TECHNIQUE
The VolgogradskiP research anti-plague institute of the Rospotrebnadzor, 400131 Volgograd, Russia
The article considers experience of application of mass-spectrometry with matrix-activated laser desorption/ionization for fast and reliable identification of Bacillus anthracis and heterologous species of microorganisms. The particular interesting characteristics and difficulties occurred during identification are covered.
Keywords: mass-spectrometry; Bacillus anthracis; identification; .strain
For citation: Sharov T.N., Chervakova M.P., Barkova I.A., Barkov A.M., Viktorov D.V., Toporkov A.V The problems of identification of various strains of vegetative form of Bacillus anthracis using MALDI-ToF MS technique. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (3): 316-318. (in Russ.). DOI: 10.18821/0869-2084-2017-623-316-318
For correspondence: Sharov T.N., research worker of laboratory of most dangerous mycoses. e-mail: [email protected] Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support
Received 06.07.2016 Accepted 01.09.2016
Введение. B. anthracis - единственный облигатный патоген человека и травоядных млекопитающих в группе близкородственных бацилл, именуемой B. cereus sensu lato (в широком смысле) [1]. В данную группу входят B. cereus sensu stricto (в узком смысле), B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis. B. cereus - почвенный сапрофит, отдельные штаммы вызывают пищевые отравления с симптомами рвоты и диареи [2]. Многие штаммы B. thuringiensis содержат параспоральные кристаллические белки, токсичные для насе-
Для корреспонденции: Шаров Тимур Николаевич, науч. сотр. лаб. особо опасных микозов; е-таП: [email protected]
комых и некоторых видов беспозвоночных [3]. В. mycoides и В. pseudomycoides - непатогенные сапрофиты, образующие колонии у корней растений [4]. Быстрая индикация В. аnthracis осложняется высоким генетическим и фенотипическим сходством с другими видами группы В. сегет [5].
В последние 2 десятилетия масс-спектрометрия стала важным аналитическим инструментом, который обеспечивает высокую пропускную способность, чувствительность и специфичность анализа в микробиологии, клинической лабораторной диагностике, экологических исследованиях. Белковое профилирование на основе МАЬВ1-ТоР М5 может быть использовано как альтернатива или дополнение гено-
Russian clinical laboratory diagnostics. 2017; 62(5)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-316-318
типических или фенотипических методов для быстрой и эффективной идентификации микроорганизмов [6].
Цель работы - идентификация вегетативной формы B. anthracis методом масс-спектрометрии MALDI-ToF (Matrix-Assisrted Laser Desorption/Ionization Time оf Flight Mass-Spectrometry).
Материал и методы. Штаммы. Использованы 10 вирулентных штаммов B. anthracis (81/1, 575/122, 614/1, 298/2, 591/2, 12/16, 619/42, 44/1СО, 248/22, 3-БК-2 II группы пато-генности, вакцинный штамм B. anthracis Sterne 34F2 III группы патогенности, штаммы 11 близкородственных бацилл: B. cereus (ÜHA, 1, 8035, VRRL569, ATCC 6464), B. thuringiensis var. Pasteur, B. megaterium (5, 216, 1), B. subtilis (6051, 6633), B. stearothermophilus ВКМВ718, B. mycoides 2, B. mesentericus 6 IV группы патогенности (коллекция живых культур ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора). Использованы клинические изоляты от больных: 6 штаммов Staphylococcus aureus, 6 штаммов Escherichia coli (IV группа патогенности).
Подготовка образцов. В соответствии с требованиями биобезопасности (Biosafety Level 3) и для эффективной экстракции клеточных белков штаммы B. anthracis готовили по методике инактивации высоковирулентных микроорганизмов и спор с использованием трифторуксусной кислоты (ТФК) [7], а также муравьиной кислоты (МК) [11, 12].
Штаммы культивировали на кровяном агаре: 300 мл ГРМ-агара (ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск) + 20 мл донорской крови, затем дважды пассировали в аэробных условиях на питательном агаре («Fluka/Sigma-Aldrich») в течение 24 ч при 37oC. Материал с каждой чашки переносили в объеме, эквивалентном полной проволочной петле диаметром 3 мм в 20 мкл деионизированной воды (ДВ) (НПФ «Абрис»), инактивирова-ли добавлением 80 мкл ТФК («panReac/Applichem»), после этого суспендировали на приборе МЬ-1 (Польша) в течение 30 мин, добавляли 300 мкл ДВ, проверяли на стерильность.
Подготовка проб с использованием МК (Реахим; ЗАО «Мосреактив») включала следующие этапы: в микропробирки вносили по 300 мкл ДВ, две полные проволочные петли бактерий, по 900 мкл 96° этанола, встряхивали на вортексе, центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 2 мин. Удаляли из пробирок супернатант, осадок высушивали для полного удаления остатков этанола. К осадку добавляли 50 мкл 70% МК и 50 мкл ацетонитрила («PanReac/AppliChem»), тщательно перемешивали на вортексе, центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 2 мин. Специфическую стерильность проверяли высевом на питательный агар.
Готовили пробы из микроорганизмов IV группы патогенности - S. aureus с ТФК, E. coli с МК [11, 12].
Согласно общепринятым протоколам пробоподготовки использовали супернатант, содержащий белки. Для сравнения результатов использовали и материал осадка. Для MALDI-ToF MS 2 мкл микробной взвеси смешивали с 2 мкл раствора а-циано-4-гидроксикоричной кислоты 12 мг/мл («Bruker Daltonics», Бремен, Германия). Раствор гидроксикоричной кислоты готовили предварительно, растворив навеску в смеси 100% ацетонитрила и 0,3% ТФК в соотношении 2:1 (объем/ объем). Один микролитр смеси образца и гидроксикоричной кислоты помещали на металлическую мишень для образцов. После кристаллизации проб мишень с образцами помещали в камеру анализатора. В соответствии с инструкцией производителя программного обеспечения SARAMIS™ (Spectral Archive And Microbia Identification System, «SHIMADZÜ») на 2 лунки каждой мишени также наносили суспензии рефе-ренсного штамма E. coli CCÜG для калибровки прибора без предварительной пробоподготовки.
Регистрацию масс-спектров осуществляли на приборе Axima Performance с азотным лазером. Диапазон регистра-
microbiology
MALDI-ToF MS-идентификация бактерий рода Bacillus
Штамм Достоверность идентификации, %
супернатант осадок
B .anthracis Sterne 34F2 B. anthracis 99,9 B. anthracis 91,2
B. anthracis 619/42 - -
B. anthracis 3-БК-2 - -
B. anthracis 44/2СО Arthrodermataceae, 77 S. aureus 88,4
B. anthracis 2 98/2 - -
B. anthracis 12/16 - -
B. anthracis 81/1 - -
B. anthracis 575/122 - B. anthracis 99,9
B. anthracis 575/122 R01 B. cereus 77 -
B. anthracis 614/1 Actinomyces turicensis 94,5 B. anthracis 82,7
B. subtilis 6021 Staphylococcus haemolyticus 81,9/B. subtilis 86,9 -
B. subtilis 6633 B. subtilis 93,8 -
B. mycoides 2 - -
B. megaterium 5 - -
B. mesenterius 4 - -
B. thuringiensis - -
B. pseudoanthracis 104 - -
B. cereus 1 - -
B. cereus 8035 B. anthracis 82 -
B. cereus 569VRRL B. cereus 82,5 B. anthracis 77,8
B. cereus 87,5
Bacillus spp. 1-13* B. anthracis 93,8 B. cereus 77
Bacillus spp. 1-14* - -
Примечание. * - штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицированные не как B.
ции составлял 2-12 000 m/z, фиксировались только положительные ионы, суммарный спектр каждого образца составляли на основе 100 единичных выстрелов. При анализе результатов учитывали следующие характеристики масс-спектра: количество пиков, их интенсивность, общую величину шумового компонента. Результирующий спектр каждого штамма экспортировали в базу данных SARAMIS™ («Anagnostisc Gmbh», v. 3.62) для последующего анализа.
Результаты и обсуждение. Новая технология влечет за собой необходимость оценки эффективности используемого метода на различных объектах. Критериями оценки диагностической ценности иммуносерологических, молекулярно-генетических методов являются чувствительность, специфичность, специфическая активность, воспроизводимость. MALDI-ToF MS не является исключением. Появился ряд работ, посвященных оценке диагностической эффективности MALDI в сравнении с биохимическими и молекулярно-генетическими методами, основанными на секвенировании. Требовалось определить точность, надежность, воспроизводимость MALDI-ToF-масс-спектрометрии при использовании системы Axima Performance и программного обеспечения SARAMIS 3.62 и отработать методику пробоподготовки для B. anthracis (см. таблицу).
Оптимальным методом пробоподготовки для грамполо-
МИКРОБИОЛОГИЯ
жительных (S. aureus, Streptococcus agalactiae, Listeria spp., Corynebacterium spp.) и грамотрицательных (Enterobacter spp., Proteus mirabilis, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Escherichia spp.) бактерий III-IV группы патогенности является обработка МК [11, 12].
Подготовка образцов из высокопатогенных спорообразу-ющих микроорганизмов (к которым относится B. anthracis) с использованием ТФК позволяет воспроизводить масс-спектры бактерий с большим количеством сигналов масс с низким уровнем шума. Большое количество сигналов масс и высокий уровень воспроизводимости необходимы для успешного применения техники масс-спектрометрии в микробиологической диагностике [7]. Мы использовали оба метода. Каждый образец контролировали высевом на специфическую стерильность, во всех случаях рост отсутствовал при контроле в течение 3-5 дней.
Только 4 из 10 штаммов B. anthraci.m и 4 из 10 штаммов близкородственных бацилл идентифицированы достоверно. Корректная идентификация происходила только при использовании для пробоподготовки ТФК. При применении МК и ацетонитрила достоверность определения составляла менее 70%. Согласно критериям программы, такой результат считается неудовлетворительным и в рабочем поле программы отображается как отсутствие совпадений с базой данных. При точности идентификации свыше 80% результат является приемлемым, от 90% и более - высоким.
Высокий показатель достоверности (более 90%) среди B. anthracis отмечен у штаммов Sterne 34F^ 575/122, причем вне зависимости от того, проводили ли пробоподготовку с ТФК или МК либо ацетонитрилом. Во всех случаях, помимо супернатанта, анализировали осадок, что иногда давало различающиеся результаты. В литературе аналогичных результатов нет. Необходимым условием успешной идентификации является наличие того или иного штамма микроорганизма в базе данных масс-спектров. Штамм B. anthracis Sterne 34F2 широко распространен в коллекциях микроорганизмов в исследовательских центрах разных стран. Масс-спектры именно этого штамма представлены в подразделе Bacillus spp. в базе данных SARAMIS.
При создании референсных масс-спектров пики на них соответствуют рибосомальным белкам, которые присутствуют в клетке в наибольшем количестве. В каждой серии определений даже при соблюдении всех условий культивирования и пробоподготовки в качественном и количественном составе белков и пептидов, а соответственно в картине распределения масс-пиков наблюдаются различия. С учетом этого для повышения эффективности идентификации и дифференциации B. anthracis методом MALDI-ToF MS исследования направлены на поиск уникальных биомаркеров спор и вегетативных клеток [8-10].
Клинические штаммы S. aureus и E. coli идентифицировались со средним показателем достоверности 85%, при этом не было ни одного неидентифицированного образца. Это свидетельствует о том, что микроорганизмы, наиболее изученные и широко встречающиеся в клинической практике, демонстрируют высокие показатели достоверности и воспроизводимости при идентификации в MALDI-ToF, а также о необходимости непрерывно пополнять коллекцию эталонных спектров видов, которые отсутствуют или недостаточно представлены в коммерческих базах данных [13].
Заключение. Применение MALDI-ToF-масс-спектромет-рии для идентификации некоторых возбудителей II группы патогенности не всегда гарантирует приемлемую точность и достоверность результата. При анализе экстрагируемых белков, находящихся в надосадочной жидкости, и клеточного осадка в одних измерениях получали разные результаты, в
других - практически идентичные. Пока не удалось выявить причины этого, работа в данном направлении продолжается.
Правильно подобранный метод пробоподготовки в значительной степени гарантирует успешную и достоверную идентификацию микроорганизмов. Коммерческие программы, интегрированные с базами данных масс-спектров, демонстрируют эффективность, их постоянное совершенствование и дополнение референсными масс-спектрами необходимо для решения научно-исследовательских задач и в практике клинической лабораторной диагностики.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Yu G.X. Pathogenic Bacillus anthracis in the progressive gene losses and gains in adaptive evolution. BMC Bioinformatics. 2009; 10 (Suppl. 1): S3.
2. Stenfors ArnesenL.,FagerlundA.,GranumP.From soil to gut: Bacillus cereusand its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 2008; 32 (4): 579-606.
3. Roh J., Choi J., Li M., Jin B., Je Y. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J. Microbiol. Biotechnol. 2007; 17 (4): 547-59.
4. Nakamura L., Jackson M. Clarification of the Taxonomy of Bacillus mycoides. Int. J. Syst. Bacteriol. 1995; 45 (1): 46-9.
5. Pilo P., Frey J. Bacillus anthracis: Molecular taxonomy, population genetics, phylogeny and patho-evolution (Review). Infect. Genet. Evol. 2011; 11 (6): 1218-24.
6. Sauer S., Kliem М. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8 (1): 74-82.
7. Lasch P., Nattermann N., Erhard M., StEammler M., Grunow R., Bannert N., Appel B., Naumann D. MALDI-ToF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal. Chem. 2008; 80 (6): 2026-34.
8. Lasch P., Beyer W., Nattermann H., Stammler M., Siegbrecht E., Grunow R. et al. Identification of Bacillus anthracis by доФ^ matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and artificial neural networks. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75 (22): 7229-42.
9. Hotta Y., Sato J., Sato H., Hosoda A., Tamura H. Classification of the genus Bacillus based on MALDI-ToF MS analysis of ribosomal proteins coded in S10 and spc operons. J. Agric. Food Chem. 2011; 59 (10): 5222-30.
10. Dybwad М., van der Laaken А., Blatny М., Paauwc А. Rapid Identification of Bacillus anthracis Spores in Suspicious Powder Samples by Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79 (17): 5372-83.
11. TeKippe M.E., Shuey S., Winkler D.W., Butler M.A., Burnham C.A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J. Clin. Micro-biol. 2013; 51 (5): 1421-7.
12. Ford B.A., Burnham C.A. Optimization of routine identification of clinically relevant Gram-negative bacteria by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and the Bruker Biotyper. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (5): 1412-20.
13. Christensen J., Rimtas D., Hammer M., Justesen U. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry analysis of Gram-positive, catalase-negative cocci not belonging to the Streptococcus or Enterococcus genus and benefits of database extension. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (5): 1787-91.
Поступила 06.07.16 Принята к печати 01.09.16
