CC BY
60
УДК 616:5;616.97
ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
ПЗ. Муталляпова Национальный научный медицинский центр, Астана, Казахстан
В последние годы отмечается существенный рост урогенитальных инфекций с значительным расширением спектра инфекционных агентов, инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), вызывающих как локальные, так и системные поражения организма [1].
Урогенитальная инфекция - многоочаговое заболевание. ИППП обычно обитают в канале шейки матки и мочеиспускательном канале. Гонококки, трихоманады, хламидии поражают парауретраль-ные протоки, преддверие влагалища, большую железу преддверия, матку, маточные трубы, иногда мочевой пузырь и мочеточники [2]. Кандида альбиканс, гарднерелла вагиналис и др. бактериальные инфекции обнаруживаются в отделяемом влагалища. В большинстве случаев, заболевания имеют стертую клиническую картину, что требует всестороннего лабораторного обследования пациентов для постановки точного диагноза и назначения адекватной терапии.
В этих условиях предъявляются высокие требования к методам лабораторной диагностики, а именно: высокая чувствительность и специфичность, что дает возможность комплексного обследования пациента за короткий отрезок времени. Этим требованиям в полной мере, отвечают методы ДНК диагностики.
Метод ПЦР считается одним из самых чувствительных и современных диагностических технологий [3]. Вместе с тем, наш практический опыт показывает целый ряд отрицательных моментов, влияющих как на качество лабораторной диагностики, так и на репутацию метода. Причинами некорректной лабораторной диагностики являются: некачественные наборы - реагенты ПЦР и несоблюдение температурного режима хранения при транспортировке; неправильный забор биоматериала; отсутствие диалога между врачом-лаборантом и лечащим врачом; некачественное техническое обслуживание приборов; несоблюдение температурного режима в помещениях ПЦР - лаборатории; отсутствие вспомогательных расходных материалов (урогенитальных зондов и т.д).
Кроме того, при исследовании биоматериала часто возникают проблемы связанные с наличием в них ингибирующих веществ: в моче - мочевина; соскобах эпителиальных клеток из уретры и церви-кального канала - гемоглобин, при наличии сгустков крови, слизи и лейкоцитов.
Эффективность проводимой терапии, сопряжена с присутствием ингибиторов в биоматериале, что создает некоторые трудности диагностики ИППП. В этой связи, целью настоящего исследования явилось выявление ингибиторов реакций, затрудняющих диагностику ИППП методом ПЦР и поиск путей решения этой проблемы.
Материалы и методы: Материалом исследования явились: мазки из уретры и цервикального канала; соскобы из уретры или цервикального канала; отделяемое влагалища; отделяемое из уретры; секрет предстательной железы; сперма; соскобы с эрозивно-язвенных элементов, а также клеточный осадок мочи.
Исследование наиболее часто встречающихся на уровне ДНК более 13 разновидностей ИППП проводили методом ПЦР на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Качественные, количественные, а также мультиплексные исследования проведены на анализаторе «iCycler iQ5» («Bio Rad», США). Выявление ДНК ИППП: Chlamydia trachomatis, Ureaplasma parvum\urealyticum, Ureaplasma species, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Niesseria gonorrhoeae, Cytomegalovirus, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Herpes symplex virus 1,2,Candida albicans, Treponema pallidum, Human papilloma virus 16,18; а также скрининг всех типов Human papilloma virus, проведены методом гибридиза-ционно-флуоресцентной детекции, амплификации и электрофореза с системой видео документации («Gel Doc», США).
Исследования проводились с использованием диагностических наборов и инструкций к ним с общими требованиями взятия биоматериала, разработанные Федеральным государственным учреждением науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» («Ампли Сенс», Россия).
Ранее (2009г) выделение ДНК из урогенитального мазка нами проводились набором «ДНК -Сорб А» (Россия), которые в последующем заменены на наборы реагентов «ДНК - Сорб АМ» (Россия) с транспортной средой для взятия мазков фирмы «Ампли Сенс» (Россия). Способ выделения ДНК зависит как от вида выявляемого возбудителя, так и от вида биоматериала. При работе с мазками плоских эпителиальных клеток из трех точек: цервикального канала, заднего свода и уретры, а также при исследовании клеточного осадка мочи (урогенитальные инфекции) схема выделения ДНК проводились следующим образом: введение лизирующего агента; сорбция ДНК на сорбенте; многократная отмывка; резорбция ДНК.
Использовали простой прием для получения максимальной специфичности и чувствительности
ПЦР, как «горячий старт ПЦР», который заключается в предварительном (до добавления Taq-ДНК-полимеразы или ионов Мд) прогревании пробирок с ПЦР-амлификационной смесью при температуре 95°С в течение 3-5 минут. Такой прием помогает обнаружить неспецифичные ДНК-фрагменты, свидетельствует о наличии ингибиторов вследствие низкотемпературного, неспецифического спаривания праймеров.
Начиная с 2010 года, для хорошего контроля качества взятия соскобов со слизистой влагалища, уретры и т.д. биоматериал центрифугировали перед добавлением лизирующего раствора на этапе выделения ДНК в течение 15 минут при 12000-15000 об/мин. При присутствии в пробирках с транспортной средой биоматериала и ингибиторов реакций (слизь, лейкоциты, кровь), содержащих «балластный» белок, нами использован новый экспресс - метод нагревания образца в реагенте. Затем проводили центрифугирование, в результате которого часть примесей оседали на дно пробирки, а вышедшая из клеток ДНК становилось доступна для ПЦР исследования на наличие инфекций. По данной методике обрабатывали биоматериал, содержащий примесь мочи. Некоторое количество мочевины попадая в пробирку для ПЦР повышали фоновую флуоресценцию пробы. Кроме того, при использовании сорбентной методики избегали попадания сорбента в реакционную пробирку, которая также приводила к повышению фоновой флуоресценции.
Результаты: Для достижения поставленной цели нами был проведен анализ работы за период с 2009 по 2010 годы. Из урогенитального тракта на ИППП методом ПЦР проведено исследование биоматериала 622 и 405 пациентов, соответственно, где в первом случае проводились исследования на 5236 инфекций (15,28%, из них 800 случаев положительные), тогда как во втором случае - на 3330 инфекций (8,43%, из них выявлено 281 случаев на степень инфицированности ИППП).
Нами проведен анализ наиболее часто встречающихся инфекций. В 2009 году материалом для исследования были мазки, взятые из 3-х точек плоского эпителия и отделяемого урогенитального тракта; в 2010 году - соскобы из цилиндрического и переходного эпителия, а также отделяемое из урогенитального тракта. Результаты выявленных урогенитальных инфекций у пациентов были распределены на 2 группы - 2009г (первая группа) и 2010г (вторая группа) (табл. 1).
N Наименование 2009 (1-я г руппа) 2010 (2-я группа) p
все абс. % все абс. %
1 Хламидия трахоматис 614 64 10,42% 405 9 2,22% p<0,001
2 Уреаплазма спейшес 622 229 36,82% 430 104 24,19% p<0,001
3 Уреаплазма парвум/ уреалитикум 120 15 12,50% 84 3 3,57% p=0,0498
4 Микоплазма гениталиум1) 319 0 0,00% 142 1 0,70% p=0,3080
5 Микоплазма хоминис 509 122 23,97% 342 13 3,80% p<0,001
6 Трихомонас вагиналис 566 16 2,83% 320 2 0,63% p=0,0473
7 Гарднерелла вагиналис 555 209 37,66% 318 100 31,45% p=0,0762
8 Нейссерия гонорея 1,21) 383 5 1,31% 199 1 0,50% p=0,6333
9 Кандида альбиканс1) 232 12 5,17% 131 0 0,00% p=0,0051
10 Вирус простого герпеса тип 1,2 352 7 1,99% 298 8 2,68% p=0,0192
11 Цитомегаловирус 577 24 4,16% 430 31 7,21% p=0,7439
12 Папиломавирус 16;18 267 97 36,33% 160 9 5,63% p=0,0492
13 Сифилис 120 0 0,00% 71 0 0,00% p<0,001
Всего: 5236 800 3330 281
Примечание: 1) в качестве статистического теста использован точный критерий Фишера
Таблица 1. Выявляемость урогенитальных инфекций.
Исследования мазков урогенитального тракта показали, что наиболее часто встречались такие инфекций как, Ureaplasma species, которая выявлена в 229 случаях из 622 (36,82%); Gardnerella vaginalis отмечена в 209 случаях из 555 (37,66%); HPV 16,18 - выявлена в 97 случаях из 267 (36,33%), что согласуется с данными В.В. Делекторского (1985) [4].
Во второй группе наиболее часто встречались Gardnerella vaginalis (БВ), которая была определена из отделяемого влагалища, уретры и/или секрета предстательной железы в 100 случаях из 318 (31,45%). В ряде работ показано [5], что частота обнаружения БВ во многом зависит от контингента обследуемых женщин. Так, в группе планирования семьи БВ отмечена у 17-19%; 24-37% встречается у лиц, находящихся на стационарном лечении по поводу венерических заболеваний; в 15-37% - у беременных женщин и у 61-87% среди пациенток с патологическими белями. Наиболее часто БВ нами выявлялась среди лиц, не состоящих в браке и среди женщин, планирующие беременность. На втором месте среди возбудителей ИППП оказалась Ureaplasma species в 104 случаях из 430 (24,19%). Данные литературы свидетельствуют, что U.urealyticum может встречаться примерно с одинаковой частотой
у фертильных и бесплодных мужчин (до 40%), а M. hominis чаще у бесплодных[6]. По нашим исследованиям, наиболее часто (78%) данная инфекция была выявлена у бесплодных мужчин и женщин.
Распространение Cytomegalovirus нами была выявлена в 31 случаях из 430 (7,21%) и является достаточно хорошим показателем, так как известно [7], что у 60-100% взрослых людей присутствуют антитела к цитомегаловирусу. Исследования на ЦМВИ с детекцией ДНК, антигена вируса и оценкой специфического иммунного ответа подтверждают у 22% больных первичную инфекцию, у 43% - реактивацию, у остальных персистирующую инфекцию [7].
Исследование показало, что в первой группе Mycoplasma hominis выявлен в 122 случаях из 509 (23,97%); Ureaplasma parvum\urealyticum была обнаружена в 15 случаях из 120 (12,50%).
Мазок со слизистой влагалища имеет эктодермальное происхождение, имеет плоский эпителий, что является некачественным и не информативным материалом для выявления Chlamydia trachomatis, так как вместе с материалом присутствовали сгустки крови, слизь и лейкоциты (ингибиторы реакций). Chlamydia trachomatis нами выявлен в 64 случаях из 614 (10,42%).
Сокращение сроков между первичным и повторным анализом (менее 30 дней), приводило к отсутствию достаточного количества эпителиальных клеток в цервикальном канале для ПЦР исследования на Chlamydia trachomatis, и соответственно, к ложноотрицательному результату. В связи с тем, что распад ДНК микроорганизмов составляет 35-45 дней после окончания приема антибактериальных препаратов, первое контрольное ПЦР исследование проводили не ранее чем через 45 дней.
В соскобе урогенитального тракта второй группы исследования, Mycoplasma hominis выявлен в 13 случаях из 342 (3,8%).
Качественным и количественным мультиплексным методом скрининга определялись все типы Human papilloma virus, которые выявлены в 9 случаях из 160 (5,63%). Ureaplasma parvum\urealyticum выявлена в 3-х случаях из 84 (3,57%).
Как видно из таблицы 1, в первой группе наименьший удельный вес составил Candida albicans, который выявлен в 12 случаях из 232 (5,17%) из отделяемого влагалища, цервикального канала, уретры со слизью, лейкоцитами и т.д. По данным различных авторов, почти у 75% женщин в течение жизни наблюдается как минимум эпизод урогенитального кандидоза [8]. Cytomegalovirus выявлен в 24 случаях из 577 (4,16%). На этапе электрофоретической детекции появлялись дополнительные полосы в 16 случаях из 566 (2,83%), что происходило за счет ингибирования Trichomonas vaginalis и свидетельствовало о наличии ложноположительного результата.
В 7 случаях из 352 (1,99%) и в 5 случаях из 383 (1,31%) выявлялись Herpes symplex virus 1,2 и Niesseria gonorrhoeae. Исследования на наличие Mycoplasma genitalium и Treponema pallidum показали отрицательный результат.
В случае, когда регистрируется положительная реакция при ПЦР-анализе, детектируются два фрагмента: специфичный и контрольный. Отсутствие последнего фрагмента означает подавление ПЦР либо ингибиторами Таq-полимеразы в тестируемых образцах, либо высокой концентрацией ДНК. Для выявления Chlamydia trachomatis в образце, определяют ДНК путем сравнения с амплификацией стандартного ДНК внутреннего контроля. В биообразцах из переходного и цилиндрического эпителия во второй группе Chlamydia trachomatis выявлен нами в 9 случаях из 405 случаев (2,22%) параллельно с Herpes symplex virus 1,2, который выявлен в 8 случаях из 298 (2,68%). Известно, что до 30% случаев первого эпизода генитального герпеса обусловлено ВПГ-1, но рецидивирующее течение герпетической инфекции чаще обусловлено ВПГ-2 [9].
Mycoplasma genitalium нами выявлен в единственном случае из 142 (0,7%) инфекций. Trichomonas vaginalis - в 2 случаях из 320 (0,63%). Niesseria gonorrhoeae выявлен в одном случае из 199 (0,5%). Candida albicans и Treponema pallidum во второй группе методом ПЦР нами не выявлены.
Таким образом, в урогинекологической практике наиболее рационально и экономически обоснованно использование метода ПЦР для выявления C. trachomatis, N.gonorrhoeae, T.vaginalis, G.vaginalis, представителей семейства Mycoplasma и вирусных инфекций (герпеса, цитомегаловируса, вируса папилломы человека). Вместе с тем, обследование только одного инфекционного агента в мазке не даёт полной информации о микробиоценозе ИППП. Результаты однократного исследования биоматериала у пациентов может быть неточным. В этой связи, исследование должно быть комплексным (с применением разных методов диагностики, по возможности с использованием высококачественных тест-систем на современном оборудовании в сертифицированных лабораториях). Кроме того, недостатком молекулярно-биологических методов является высокая вероятность контаминации ДНК, в результате которого, возможны как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты из-за присутствия в пробах различных ингибиторов ПЦР. На сегодняшний день не существует лабораторного метода, позволяющего избежать некорректных результатов. Однако, диагностические возможности ПЦР равно как и информативность существенно возрастают, когда забор проводят с соблюдением топики и из излюбленных мест локализации возбудителя, а также забранного из максимально большего участка уретры, канала и поверхности шейки матки, а также заднего свода влагалища. Немаловажное значение при этом имеет отсутствие в пробирках с транспортной средой веществ, ингибирующих проведение реакции (кровь, слизь и т.д). Следует отметить, что количество
полученных в мазках и соскобах эпителиальных клеток значительно сказывается на качестве и результате проводимого исследования.
В целом, для более качественного проведения исследования, с учетом не только выявления вида возбудителя, но и определения стадии заболевания, обоснованного назначения антибактериальной терапии необходима комплексная лабораторная диагностика (ПИФ, ИФА, микробиологический метод, ПЦР). Комплексное исследование, включая исследование иммунного статуса, позволит проводить и адекватную иммунокорригирующую терапию, что крайне важно при хронических урогени-тальных инфекциях (хронический патологический стресс), сопровождающиеся как местными, так и системными поражениями организма.
Литература:
1. Гинцбург А.Л. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии // Микробиология, иммунология и вирусология. - 1999. - №5. - С.22-26.
2. Момыналиев К .Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 1. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - №4. - С.25-33.
3. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. - Санкт-Петербург: «0льга».-2000. - 573 с.
4. Овчинников Н.М., Беднева В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М.: Медицина 1987г. 202с.(1985)
5. Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г., Ахунов Э.Д.и др., Бактериальный вагиноз -принципиальные вопросы этиологии, диагностики и лечения; Методические рекомендации,УФА: Башкирский гос. мед. университет 2001 ;16
6. Божедомов В.А., Файзуллин Л.З., Николаева М.А. и др, Тезисы Российского Конгресса «Генитальные инфекции и патология шейки матки», 5-9.04.2004, с.31
7. Младенческая смертность и внутриутробные инфекции в г. Омске / Т.И. Долгих, Н.И. Косых, Ф.В. Носкова и др. // Инфекционные болезни человека: Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ОГМА. - Омск, 2001. - С. 20-24
8. Лопухов Л.В., Эйдельштейн Н.В. ПЦР в клинической микробиологической практике // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т.2. - №3. - С.96-106.
9. Генитальный герпес /А.П.Никонов, О.Р.Асцатурова //Клиника акушерства и гинекологии ММА им. И.М.Сеченова. - Том 05/N 3/2003 Consilium medicum
УДК 616-074:616.12
ОПЫТ ЛАБОРАТОРНОГО СКРИНИНГА БИОМАРКЕРОВ НЕКРОЗА МИОКАРДА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ
В УРГЕНТНОЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ ГККП «ГОРОДСКАЯ БОЛЬНИЦА №2»
Абдрахманова Б.Е.
ГККП «Городская больница №2», Астана, Казахстан
На сегодняшний день острый коронарный синдром (ОКС) и сердечная недостаточность остаются проблемами республиканского масштаба, так как острые формы ишемической болезни сердца ассоциируются большой частотой развития жизнеугрожающих фатальных осложнений. Необратимое повреждение миокарда - некроз - распознается по выявлению биомаркеров повреждения миокарда, которые оценивают вероятность того, что симптомы больного имеют отношение к острой коронарной ишемии и оценивают риск рецидивов сердечных эпизодов, в том числе смерти и повторной ишемии [1].
На практике термины «подозрение на ОКС» или «возможный ОКС» из-за повышенного риска сердечной смерти или повышенного риска ишемических осложнений больных с ОКС используются в медицине на ранних стадиях обследования пациентов, у которых симптомокомплекс соответствует ОКС, но диагноз еще не поставлен [2].
Некроз миокарда сопровождается высвобождением структурных белков и внутриклеточных макромолекул в интерстициальное пространство в результате нарушения целостности клеточных мембран. Ценность стратегии обследования пациентов - более раннее определение тропонина, кре-атинкиназа МВ (КК-МВ), особенно в сочетании с миоглобином - рассматривается как подход к раннему выявлению инфаркт миокарда (ИМ) и его лечению, а также возможности ускоренного исключения ИМ [3].
Предпочтительным биомаркером повреждения миокарда являются сердечный тропонин (массовая концентрация 4-6 часов после появления болей), миоглобин (время первого повышения составляет 1-3 часа), при массовых анализах креатинкиназа типа МВ (КК-МВ) (массовая концентрация 3-4 часа) как приемлемая альтернатива, когда возможность определения сердечного тропонина отсутствует [4].
