CC BY
91
14.Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений - М.: Колос, 1985. - 241 с.
15. Сабинин Д.А. Физиологические основы питания растений - М.: Изд-во АН СССР, 1955. - 512 с.
16.Таран Н.Ю. Адаптацшний синдром рослин в умовах посухи : Автореф. дис... доктора бюл. наук: Спец. 03.00.12 «Ф1зюлопя рослин». -Кит, 2001. - 42 с.
17. Таран Н.Ю. Каротинощи фотосинтетичних тканин в умовах посухи / Н.Ю. Таран // Фiзiологiя та бiохiмiя культурних рослин. - 1999. - Т. 31. -№ 6. - С. 414-422.
18. Эфирно-масличные и пряно-ароматические растения / О.К. Либусь, В.Д. Работягов, С.П. Кутько, Л.А. Хлыпенко. - Херсон: Айлант, 2004. -162 с. 327.
19.Klan Z. Drogy vsech lekopisu v pfehledu. - Praha, 1948. - 271 p.
20.Hoppe H.A. Medical plants and their application. - Hamburg : Hamburg, 1958. - P. 132-153.
21.Chopra R.N., Nayar S.L., Chopra 1.С. Glossary of indian medicinal plants. - New Delhi, 1956. - 269 p.
ПРОБЛЕМА СИНТЕЗА ЛАВАНДИНА (LAVANDULA HYBRIDA REVERCHON.)
В.Д. РАБОТЯГОВ, доктор биологических наук Никитский ботанический сад - Национальный научный центр
Введение
Лавандины - межвидовые гибриды первого поколения (F1), возникающие путем естественной гибридизации на границе соприкосновения ареала лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) с лавандой широколистной (Lavandula latifolia Medic.) или в результате искусственного скрещивания разнообразных форм названных видов. Они отличаются от исходных видов проявлением гетерозиса, чем и обусловливается особый интерес к ним.
Основными районами возделывания лавандина являются Франция, Испания, Италия, Югославия, Марокко, Румыния [2-4, 8-10].
Селекция лавандина заключается только в получении гибридов F1, которые имеют низкую всхожесть семян, а сами растения всегда стерильны [2-4]. До настоящего времени фертильные лавандины неизвестны [5]. Неоднократные попытки получить семена от искусственного самоопыления, а также с открыто цветущих лавандинов, к положительным результатам не привели. Безрезультатно было и скрещивание гибридов F1 с исходными видами [3, 4, 10].
В связи с этим селекцию лавандина мы рассматриваем главным образом с точки зрения: преодоления стерильности у гибридов F1; изучения возможности использования полиплоидии в сочетании с межвидовой гибридизацией для синтетического создания новых гибридных генотипов; получения гетерозисных полиплоидных лавандинов, по качеству масла приближающихся к л. узколистной.
Объекты и методы исследования
Материалом для исследований служили сортоклоны дикорастущих и культивируемых видов и форм лаванды; экспериментально полученные полиплоидные формы видов Lavandula angustifolia: Рекорд, Прима, К34, К37, К67; L. latifolia: К2, К4, К5; амфидиплоиды F1 (А2, А4, А5, А9); межвидовые гибриды F1 и F2 от скрещивания диплоидных и полиплоидных форм лаванды в количестве 3092 генотипов по 45 комбинациям. Полиплоидные формы, межвидовые гибриды F1 и F2 от скрещивания ди- и полиплоидных форм лаванды созданы в процессе проведения экспериментальной работы. Для создания нового исходного материала использовали методы межвидовой гибридизации форм, отобранных по хозяйственно ценным признакам, беккроссные скрещивания, инбридинг. Для индуцирования полиплоидов применяли приемы колхицинирования в нашей модификации. Массовую долю эфирного масла в сырье определяли методом гидродистилляции на аппаратах Клевенджера [3-5]. Компонентний состав эфирного масла исследовали на хроматографе Agilent Technology 6890N с масс-спектрометрическим детектором 5973 N [26].
Индексы удерживания компонентов рассчитывали по результатам контрольных анализов эфирных масел с набором нормальных алканов [5]. Статистическая обработка экспериментальных данных проведена общепринятыми методами вариационной статистики
Результаты исследований
Установлено, что масло лавандина характеризуется наличием наследуемых от л.широколистной соединений, не представляющих ценности, что обедняет его букет в сравнении с маслом л. узколистной. Необходима серьезная селекционная работа по улучшению качества эфирного масла лавандина путем снижения до минимума содержания цинеола, борнеола и камфоры.
Цитогенетическое изучение межвидовых гибридов первого поколения (лавандинов) показало, что они однообразны по числу хромосом (2n=48), содержат 24 хромосомы л. узколистной и 24 хромосомы л. широколистной.
Изучение мейоза у лавандинов показало, что он характеризуется общей для них особенностью: различным колебанием числа бивалентов и
унивалентов, варьирующих в определенных пределах. Конъюгация хромосом относится к типу пойкилосинтеза [1]. Этому колебанию числа бивалентов мы придаем огромное значение.
Колебания числа бивалентов происходят по следующим причинам: хромосомы л. узколистной и л. широколистной родственны частично, поэтому не всегда осуществляют конъюгацию друг с другом; аутосинтез хромосом л. узколистной не всегда осуществлялся также из-за того, что они конъюгируют в неродственной им цитоплазме л. широколистной.
Как показали наши исследования, гибель гамет и зигот у лавандинов - результат того, что конъюгируют и не совсем гомологичные хромосомы (отдельные их участки), которые не могут без ущерба замещать друг друга. Кроме того, клетки у гибридов имеют разное число хромосом - от 23 до 27 (а в ряде случаев встречаются клетки и с 48 хромосомами). Однако можно полагать, что многие сочетания хромосом совершенно нежизненны. В таких случаях нарушается общий баланс всей хромосомной системы; у гибридов дегенерируют яйцеклетки на ранних стадиях их развития; пыльцевые мешки, в которых формируется нежизнеспособная пыльца (на 80% стерильная), не получают полного развития и, как результат, -отсутствие потомства.
Для преодоления стерильности у лавандина использовали колхицин [10]. Амфидиплоидные лавандины создавались путем: гибридизации видов с последующим удвоением числа хромосом у стерильного гибрида; удвоения числа хромосом у исходных видов с дальнейшим скрещиванием индуцированных тетраплоидов.
При удвоении числа хромосом мейоз у лавандина протекает уже правильно. Конъюгация хромосом генома Ьа л.узколистной будет происходить с соответствующими хромосомами другого генома Ьа; так же конъюгируют между собой хромосомы геномов Ь1 л.широколистной. Вследствие этого амфидиплоидные лавандины образуют функциональные гаметы ЬаЬ1 и гибрид становится плодовитым. У синтезированных лавандинов с удвоенным числом хромосом завязываются крупные семена (масса 1000 семян 3,0-3,6 г, в то время как у F1 - всего 0,9-0,1 г).
При получении фертильных лавандинов путем скрещивания индуцированных тетраплоидов Ь. angustifolia п=48 х Ь. кй^оНа п=48 хромосомы angustifolia начинают конъюгировать с angustifolia, а latifolia с latifolia и гибриды становятся плодовитыми.
Получение фертильных лавандинов открыло возможности для создания путем экспериментальной полиплоидии и отдаленной гибридизации (решение второго этапа проблемы) качественно новых форм, ценных как новый исходный материал для решения проблемы синтеза лавандина (табл. 1).
Результаты исследований свидетельствуют, что межвидовые скрещивания более успешны в тех случаях, когда цветки материнских
растений опылялись отцовской пыльцой, имеющей одинаковое с материнской или меньшее число хромосом. В комбинациях скрещивания, где в качестве отцовского растения брались формы с большим числом хромосом, чем у материнских, завязываемость семян была значительно ниже. На основе полученных данных можно сделать вывод, что гибриды скрещиваются легче, чем «чистые» виды лаванды.
Таблица 1
Скрещивание диплоидных видов с ^ индуцированными полиплоидами
Комбинация скрещивания Число опыленных цветков, шт. Завязываемость семян, % Всхожесть, % Выращено растений, шт
L.angustifolia, п=24хЬ. 1аИ/оИа, п=24 643 14,2 44,0 40
Ь. 1аИ/оИа, п=24хЬ. angustifolia, п=24 798 10,8 41,8 36
L.angustifolia, п=48хЬ. Шг/оНа, п=24 592 20,6 54,8 67
Ь. 1аИ/оИа, п=48хЬ. ап^и^И/оИа, п=24 600 20,0 46,6 56
L.angustifolia, п=24хЬ. Шг/оНа, п=48 376 16,0 68,4 41
Ь. 1аИ/оИа, п=24х/„ ап^и^И/оИа, п=48 398 13,3 68,0 36
L.angustifolia, п=48х ЬауапсИп, п=24 490 0,4 0 0
ЬауапсИп, п=24хЬ. ал^и^И/оИа, п=24 500 0,4 50,0 1
Ь. 1аИ/оИа, п=24хЬ. ЬауапсИп, п=24 480 0,6 0 0
ЬауапсИп, п=24хЬ. Шг/оНа, п=24 460 0,6 33,3 1
L.angustifolia, п=48хЬ. Шг/оНа, п=48 403 21,8 45,5 40
Ь. 1аИ/оИа, п=48хL.angustifolia, п=48 400 18,0 48,5 35
ЬауапШп, п=48хЬ. angustifolia, п=24 574 23,6 89,4 118
Ь. angustifolia, п=24 хЬауапсИп, п=48 482 17,6 82,4 70
ЬауапсИп, п=48хЬ. Шг/оНа, п=24 588 16,0 69,1 65
Ь. 1аИ/оИа, п=24х ЬауапсИп, п=48 401 10,7 66,0 29
ЬауапсИп, п=48х Л, ¡/о/¡а, п=48 809 18,7 82,7 124
L.angustifolia, п=48х ЬауапсИп, п=48 538 14,4 34,6 27
ЬауапсИп, п=48х Ь. 1аИ/оИа, п=48 588 15,3 27,8 25
Ь. 1аИ/оИа, п=48х ЬауапсИп, п=48 592 14,8 26,1 23
ЬауапсИп, п=48х ЬауапсИп, п=48 796 23,6 95,0 179
Выявлено, что содержание эфирного масла у лавандинов имеет тенденцию приближения к виду с наибольшим показателем. По характеру
наследования этого признака они распределяются следующим образом (табл. 2).
Таблица 2
Характер наследования лавандинами признака «массовая доля
эфирного масла»
Комбинация скрещивания Тип наследования признака массовая доля эфирного масла
гетерозис равноценны лучшему родителю промежуточные равноценны худшему родителю
шт. % шт. % шт. шт. %
л. узколистная х л.широколистная 14 10,9 20 15,4 88 67,6 8 6,1
л.широколистная х л. узколистная 4 5,5 8, 11,1 48 66,7 12 16,7
Характер изменчивости эфирного масла в процессе онтогенеза лавандинов позволяет выявить некоторые закономерности. Анализ масел на второй год цветения показал по всем формам гибридов содержание сложных эфиров (в пересчете на линалилацетат) в объеме 15,3±0,8% -весьма близком к л. широколистной (11,2±0,1%), а для сорта Рекорд -49,5±0,1%. На третий год цветения, после окончательного формирования гибридных растений, содержание сложных эфиров повысилось почти в два раза, составив 28,2±0,4%, в то время как у л.широколистной процент сложных эфиров остался на прежнем уровне (10,8±0,1), у л.узколистной -50,1±0,1%. Характерно, что нарастание сложных эфиров от первого года до третьего идет равномерно по всем формам гибридов.
Данные по содержанию химических компонентов эфирного масла у лавандинов и родительских форм, участвующих в скрещиваниях приведены в табл.3.
Изучение закономерностей наследования химических веществ в лавандине показало, что у отдельных гибридов происходит значительное повышение содержания эфирного масла и отдельных его химических компонентов (линалоол) по сравнению с их наличием в растениях одного из родителей, и наоборот - снижение других составных компонентов эфирного масла (камфора).
Амплитуда варьирования содержания эфирного масла и его отдельных химических компонентов по некоторым формам лавандинов выглядит так: для эфирного масла - от 1,3 до 3,7%; для сложных эфиров от 10,1 до 31,8%; для камфоры - от 2,5 до 14% и для цинеола - 8,9-48,2%.
Познание генетики лавандина делает очевидным тот факт, что, синтезируя его высокопродуктивные формы, для скрещивания необходимо правильно подбирать исходных родителей. Не каждый генотип л.узколистной и не каждая форма л.широколистной при скрещивании
дадут гибриды с нужным качественным составом. При гибридизации л.узколистная должна (по возможности) иметь более высокое содержание эфирного масла с большим содержанием линалилацетата, а л.широколистная - характеризоваться низким содержанием камфоры, цинеола и максимально высоким - эфирного масла.
Таблица 3
Характеристика гибридов F1 и исходных форм по компонентному __составу эфирного масла_
Гибридные формы Содержание эфирного масла, % на Содержание, %
сырой материал сухое вещество сложные эфиры камфора цинеол
лаванда узколистная (сорт Рекорд) 2,1 ±0,1 4,7 ±0,1 49,5±0,1 2,0±0,1 2,8±0,2
Рекорд х клон №1 2,7 ±0,1 5,3±02 21,4±0,8 7,7±0,6 32,8±1,4
клон №1 х Рекорд 2,9±0,1 5,9±0,1 20,5±1,0 8,6±0,6 32,0±1,5
лаванда широколистная (клон №1) 3,3±0,1 7,7±0,1 10,08±0,1 17,0±0,1 38,8±0,1
Совершенно очевидно, что этим путем (получение гибридов Б1) мы не сможем избавиться от присутствия в масле лавандинов камфоры и цинеола [9]. Однако этот путь селекции позволяет довести их содержание до минимальных количеств.
Дальнейшее улучшение эфирного масла лавандинов может быть достигнуто путем: преодоления их стерильности и применения повторных скрещиваний л. узколистной; скрещивания тетраплоидов л. узколистной и л. широколистной; получения неполных амфидиплоидов лавандина.
Для решения проблемы синтеза высокопродуктивных форм лавандина нами в качестве компонентов скрещивания впервые включены экспериментально созданные тетраплоиды л.узколистной и л.широколистной, амфидиплоиды и аллотетраплоиды. Результаты скрещивания оправдали надежды: при изменении генотипа гибрида изменяется и качество эфирного масла.
Отбор, проведенный в искусственно созданных аллополиплоидных популяциях лавандина, приводит к выделению новых рекомбинантов с высоким качеством эфирного масла. Мы допускаем, что в гибридном потомстве с различным числом геномов и в разном их сочетании возможна более полная реализация наследственных возможностей родителей, что, по
нашему мнению, должно выражаться в появлении новых генотипических вариаций по химическому составу, не характерных для родителей.
Синтетическое создание фертильных гибридов лаванды
Удвоение диплоидных наборов хромосом F1, позволило получить фертильные амфидиплоиды, сочетающие признаки исходных видов лаванды и представляющие ценный исходный материал для селекции. Амфидиплоид, впервые созданный нами путем колхицирования стерильного аллогаплоидного гибрида F1 соединяет в себе признаки как Ь. angustifolia, так и Ь. latifolia. Полученный амфидиплоид имеет широколанцетные листья темно-зеленой окраски, плотные, толстые и ломкие, вогнутые по центральной жилке. Соцветие - густое, плотное, достигающее 10-сантиметровой длины, у основания прерывистое. Цветки в мутовках более или менее прижаты к стеблю, крупные (15,2 мг). Прицветные листья пленчатые, гладкие, с заметными жилками, буреющие, ромбовидные, кверху заостренные, короче чашечки, длиной 5-7 мм и шириной 3-4 мм, на ложной мутовке - шиловидные. Чашечка крупная (7 мм), обычно расширенная. Амфидиплоид завязывает до 43,8% семян (на завязь), в чашечке, как правило, образуется одно семя. Хорошо выполненные семена (масса в 2-3 раза больше, чем у исходных видов) прорастают на 80-100%. В отличие от мелкой, полностью стерильной пыльцы аллогаплоидного гибрида, пыльца амфидиплоида содержит до 82% фертильных пыльцевых зерен. Амфидиплоид образует новый тип пыльцы - экваториально-8-прямобороздную, в то время как у исходных видов лаванды она 6-бороздная. Это является надежным диагностическим признаком синтетически созданного гибрида.
Перечисленные признаки, а также склонность к образованию фасциированных цветков, более позднее (на 20 дней) цветение в сравнении с Ь. angustifolia, повышенное содержание эфирного масла и сложных эфиров, а также более высокая зимостойкость в сравнении с Ь. latifolia, делают эту форму ценной для селекции. Нами впервые получено два семенных поколения этого амфидиплоида, характеризующихся высокой фертильностью, которые воспроизводят исходную форму, в то время как аллогаплоиды обладают полной мужской и женской стерильностью. Исследования показали, что в основе нормализации процессов спорогенеза и, по-видимому, гаметогенеза у амфидиплоидов лежит бивалентный тип конъюгации за счет аутосинтеза хромосом родительских видов и включения в гамету полных геномов обоих родителей. Мейоциты с нерегулярным мейозом у амфидиплоидов составляют не более 10-13%. Амфидиплоиды формируют семяпочки с нормальными 8-ядерными зародышевыми мешками, способные к оплодотворению. Впервые получено гибридное потомство F2, синтезированы новые полиплоидные формы от скрещивания с исходными родительскими видами и с индуцированными автотетрплоидами (табл.1).
Генетическая система амфидиплоидных форм лаванды характеризуется высокой устойчивостью и воспроизводится семенным путем. Как показали исследования, это можно объяснить тем, что развиваются только зиготы, образовавшиеся в результате слияния 48-хромосомных гамет с полными геномами родительских видов, что ограничивает рекомбинацию генетического материала. С целью получения амфидиплоидных форм в роде Lavandula L. нами использовано два способа: первый - удвоение числа хромосом в клетках соматической ткани стерильных межвидовых гибридов, второй - предварительное удвоение числа хромосом у скрещиваемых видов с последующей гибридизацией на тетраплоидном уровне.
Получение аллотриплоидов и их использование Синтез признаков разных видов может быть достигнут добавлением к диплоидному набору хромосом одного вида гаплоидного набора другого вида при получении аллотриплоидных форм (табл. 4). Так, добавление одного 24-хромосомного гаплоидного набора L. latifolia к диплоидному 48-хромосомному набору L. angustifolia позволило сочетать в аллотриплоиде типа лаванды узколистной (2п=3х=72, геномный состав AAL) высокую зимостойкость с большим урожаем соцветий и более крупными цветками (табл. 5), присущих L. angustifolia с высоким содержанием эфирного масла, свойственных L. latifolia. Аллотриплоид типа L. latifolia (2п=3х=72, геномный состав ALL) характеризуется высоким гетерозисом по урожаю и содержанию эфирного масла, более поздним цветением (на 20-30 дней в сравнении с L. angustifolia), что представляет интерес для использования его в селекционной работе. Изучение плодовитости аллотриплоидов показало, что они обладают очень низкой фертильностью. При формировании мужских жизнеспособных гамет у аллотриплоида происходит либо полная элиминация гаплоидного генома вида, участвующего в его создании (образуются 24-хромосомные гаметы), либо включение в гамету полных геномов обоих видов (образуются 48-хромосомные гаметы). При создании межвидовых гибридов с участием форм дикорастущего вида L. latifolia включение ее полных геномов в генотип гибридов вносит, наряду с положительными признаками (гетерозис по содержанию масла, урожаю), ряд отрицательных качеств, из которых главное - высокая степень стерильности отдаленных гибридов. В связи с этим особо актуальной проблемой является разработка селекционных схем, позволяющих ослабить силу наследственной передачи нежелательных признаков (цинеол, камфора) L. latifolia. Этого можно достигнуть минимальным перенесением генетического материала дикого вида культурным формам L. angustifolia.
Наши исследования показали, что у гибридов лаванды уменьшение генетического материала Ь. latifolia до отдельных локусов (участков) хромосом может быть осуществлено использованием в селекционном процессе аллотриплоидов в качестве отцовских форм, в генотипе которых Ь. 1а^оИа представлена унивалентным геномом.
Таблица 4
Характеристика полиплоидов лаванды и их исходных видов по __морфологическим признакам_
Признак, единица измерения Вид, гибрид
лаванда узколистная, (АА) лаванда широколистная, (ЬЬ) аллогаплоиды, (АЬ) аллотриплоиды, (ААЬ) и (АЬЬ) амфидиплоиды, Со(АЬАЬ) аллотетраплоиды, (ААЬЬ)
высота растения, см 49,5±0,7 85,5±0,9 79,8±1,0 85,7±1,1 63,4±0,8 68,5±0,6
диаметр растения, см 77±1 79±2 101±2 111±2 84±1 95±1
число соцветий, шт. 289±12 256±18 359±23 403±35 239±27 319±15
длина листа, мм 39,1±0,1 64,0±0,6 62,0±0,6 72,6±0,8 65,8±0,6 69,0±0,5
ширина листа, мм 4,9±0,1 11,0±0,2 8,9±0,4 10,6±0,7 13,9±0,8 10,2±0,4
площадь листа, 2 см 1,9±0,4 4,98±0,6 5,4±0,4 5,6±0,5 5,9±0,6 5,6±0,6
длина цветоноса, см 14,1±0,6 75,3±0,8 43,0±0,9 49,1±0,9 38,0±0,9 39,5±1,0
длина соцветия, см 4,0±0,3 5,5±0,4 7,1±0,4 6,1±0,5 4,8±0,3 5,3±0,4
число мутовок в соцветии, шт. 5,5±0,1 12,1±0,6 9,4±0,6 8,5±0,4 8,2±0,2 8,6±0,4
число цветков в мутовке, шт. 14,4±0,2 16,1±0,3 26,2±0,6 22,2±0,8 20,1±0,6 22,4±0,4
число цветков в соцветии, шт. 69±0,1 108±1 183±1 181±2 115±1 165±2
масса 100 соцветий, 131 г 73±2 70±2 142±4 191±4 167±3 181±4
масса цветков 100 соцветий, г 66±2 60±2 128±4 171±5 131±3 154±4
при Р<0,05; Р<0,01
Установлено, что в потомстве аллотриплоида, полученного от скрещивания Ь. angustifolia (4х) х Ь. latifolia (2х),ААЬ,2п=72, наблюдается выщепление диплоидных сеянцев (2п=48), обладающих основным комплексом признаков Ь. angustifolia и лишь отдельными признаками Ь. latifolia. Слияние подобных гамет с гаметами амфидиплоида дает аллотриплоидные сеянцы, которые воспроизводят тип Ь. angustifolia, однако им свойственны отдельные признаки Ь. latifolia - увеличенное число эфирно-масличных железок в межреберьях чашечки (табл. 5), повышенное число цветков в мутовках и соцветий на концах побегов, а также большее количество цветоносов на растении, что обусловливает больший урожай цветочной массы и увеличивает продуктивность растения лаванды.
Таблица 5
Характеристика аллополиплоидов и исходных видов по _ признакам продуктивности __
Масса, мг CÖ @ CÖ @
Наименование цветка чашечки венчика Содержание мас в цветках, % ш сырую массу Количество мас. в 1 цветке, мг Число железок I 1 цветок, мг Количество масл в 1000 железок
лаванда 11,2±0,9 4,8±0,1 6,3±0,1 5,4±0,2 0,28 680±13 0,43
узколистная (АА)
лаванда широко- 8,7±0,1 4,2±0,1 4,5±0,1 8,1±0,2 0,39 1197±19 0,31
листная(ЬЬ)
аллогаплоиды 9,1±0,1 4,0±0,1 5,1±0,1 8,1±0,2 0,33 853±18 0,34
(AL)
сесквидиплоиды 13,6±1,3 5,8±0,1 7,8±0,1 13,1±0,2 0,62 960±15 0,67
(AAL)
сесквидиплоиды 14,1±1,7 6,2±0,9 7,8±0,1 12,7±0,2 0,61 978±14 0,63
(ALL)
амфидиплоиды 17,0±0,23 7,1±1,0 10302 11,5±0,3 0,66 883±17 0,79
Со (ALAL)
аллотетраплоиды F2 (AALL) 15,7±0,2 6,7±0,1 8,9±0,2 12,1±0,3 0,62 897±18 0,70
аллотетраплоиды (ALLL) 13,6±0,1 5,8±0,1 7,8±0,1 9,1±0,2 0,54 932±15 0,55
У аллотриплоидных растений наблюдаются новые признаки -образование соцветий типа щитка, зонтиков и кисте-зонтиков (вместо монохазии и дихазии), а также сложных соцветий типа колоса и метелки со
спиральным расположением пучков (вместо супротивного - мутовок). Такие формы соцветия произошли от срастания более мелких и сближенных между собой парциальных соцветий. Естественный характер рекомбинации позволил выделить среди аллотриплоидов формы с повышенным содержанием эфирного масла и сложных эфиров в нем, с более высокой продуктивностью и снижением синтеза в 5 раз цинеола и камфоры, что намного превышает эффективность межвидовой гибридизации на диплоидном уровне в пределах рода Lavandula L. [14, 15]. Таким образом, аллотриплоидная форма явилась тем промежуточным звеном, с помощью которого оказалось возможным осуществить перенесение признаков вида L. latifolia в комплекс признаков L. angustifolia. Нами предлагается следующая схема создания полиплоидных рекомбинантных форм. Первый этап -создание аллотриплоидной формы, второй этап - скрещивание аллотриплоидов с диплоидом и тетраплоидом лаванды узколистной и отбором в их потомстве сеянцев с нужным сочетанием признаков L. angustifolia и L. latifolia. Создание аллотриплоидов может быть осуществлено либо путем валентного скрещивания тетраплоида L. angustifolia и диплоида L. latifolia и наоборот, либо с использованием нередуцированных гамет (п=48), а также путем скрещивания индуцированного аллогаплоида с диплоидом L. angustifolia. Установлено, что хромосомные наборы видов, выбранных для скрещивания, должны обладать частичной гомологией, т.к. только в этом случае мы можем рассчитывать на рекомбинацию генетического материала за счет образования тривалентных хромосомных ассоциаций в мейозе аллотриплоида и, следовательно, на появление в его потомстве растений с хозяйственно полезными признаками L. latifolia. С этой целью произвели возвратные скрещивания амфидиплоидных форм с автотетраплоидными растениями лаванды узколистной и лаванды широколистной (табл. 1).
Влияние соотношения и числа геномов на проявление признаков у аллополиплоидов показано на примере изменчивости соцветия лаванды (рис. 1). Итак, морфологические особенности аллополиплоидных гибридов определяются в полной мере соотношением числа хромосом L. angustifolia и L. latifolia у них и общим числом хромосом.
Неполные амфидиплоиды и их значение В результате исследований показана эффективность метода насыщающих скрещиваний амфидиплоидных форм. С целью усиления признаков лаванды узколистной у аллотетраплоидного гибрида осуществили скрещивание его с автотетраплоидной формой L. angustifolia 4x. Такой геномный состав (AAAL) обусловливает большое число нарушений в мейозе: отставание и расщепление унивалентов, а в A-I -выброс за пределы веретена хромосом, расщепление веретена в М-II, микроядра в T-I и Т-II, полиады из 5-II микроспор. Метафаза первого деления имеет следующий состав: 42,6П+8,31+1,1Ш+0,217. Однако мы наблюдаем образование небольшого числа правильных тетрад (около 2%)
и 48-хромосомных микроспор, которые составляют 0,4%. Анализ микроспорогенеза позволил нам установить закономерность развития микроспор и выявить связь между числом хромосом в гамете и развитием числа борозд на пыльцевом зерне (г = 0,8)
число хромосом 6-12; 18; 21-27; 26-36; 42-54; 84-86 число борозд 2-3 4-5 6 7 8 16.
Рис. 1. Соцветия и хромосомные наборы L. angustifolia, L. latifolia
и их гибридов:
1- L. angustifolia; 2 - L. latifolia; 3 - стерильный гибрид F1; 4 -фертильный гибрид (амфидиплоид); 5 - аллотриплоид типа лаванды узколистной; 6 - аллотриплоид типа лаванды широколистной.
На основании полученных данных, нами разработан способ отбора полиплоидов по числу борозд в пыльце для рода Lavandula L. По морфологическим признакам аллотетраплоиды (АААЬ) представляют собой растения промежуточного типа, обнаруживая большее или меньшее сходство с L. angustifolia. Они обладают пониженным содержанием эфирного масла (рис. 2) и более высоким содержанием сложных эфиров в нем по сравнению с амфидиплоидами. Высокая продуктивность, зимостойкость, улучшенное качество эфирного масла, гетерозисный тип
развития делают синтетически созданные формы очень ценным исходным материалом в селекции.
а
в
40-
35-
%
« 30-
и
н 25-
е
т 20-
с
а
р
о
л 10-
с
и 5-
!=Г
и 200 400 600 800 1000 1200 1400
Урожай цветочного сырья
б
\0 45
%
40
,й
и 35
н е 30
т 25
с
а
р 20
о 15
л 10
с
и
!=Г 5
1 2 3 4 5 6 7
9 10 11 12 13 14 15
Содержание эфирного масла в % на
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (мг)
Продуктивность 1 растения, мг г
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Количество масла с 1 растения, г
Рис. 2. Изменчивость хозяйственно ценных признаков у исходных видов лаванды и их гибридов (1 - Ь. а^^И/оИа; 2 -ШаИ/оНа; 3 - амфигаплоиды F1, 4 - амфидиплоиды С1? 5 -аллотриплоиды 6 -аллотетраплоиды Р2, 7 - неполные
амфидиплоиды.
Впервые осуществлено повторное скрещивание этих форм с индуцированными автотетраплоидами Ь. ап^шИ/оИа (АААЬ х АААА) для еще большего усиления химических признаков (компонентного состава эфирного масла) последней и получены семена.
С этого этапа должна начаться замена отдельных хромосом вида Ь. latifolia хромосомами Ь. angustifolia, в результате чего мы предполагаем получить высокопродуктивные сеянцы с химическими признаками лаванды узколистной. Хорошая скрещиваемость алло- и автополиплоидных форм позволяет получать гибридные формы лаванды с различным соотношением геномов исходных видов, что дает возможность
ослабить или усилить комплекс признаков того или иного компонента скрещивания. На примере ряда разнохромосомных форм одной комбинации скрещивания L. angustifolia х L. latifolia, а именно: (AL,2n=48); (AALL,2n=96); (AAL, 2n =72); (AAAL, 2n=96) со следующим соотношением чисел геномов исходных видов 1:1, 1:2, 1:3, 2:2 показано, что по мере увеличения числа геномов L. angustifolia увеличивается степень проявления признаков этого вида как количественных (рис. 2), так и качественных. В этих же скрещиваниях, но для усиления признаков L. latifolia необходимо произвести численное преобладание ее хромосом в генотипе гибридов (ALL, 2n=72; ALLL, 2n=96).
Комплексное использование методов межвидовой гибридизации и полиплоидии позволило создать и рекомендовать формы, перспективные для селекционной работы с L. angustifolia и L. latifolia. Амфидиплоид А-2 (2n=96) обладает высоким содержанием эфирного масла (14,6%), отличается большим числом цветков в сравнении с лавандой узколистной. Аллотетраплоид А-8 (2n=96) отличается высокой урожайностью, хорошим биохимическим составом эфирного масла (урожайность соцветий - 136,0 ц/га, содержание линалилацетата 39,9%). Аллотриплоид №11.82 (А^,2п=72) ценен тем, что дает в потомстве мейотические аллотетраплоиды с интересным сочетанием хозяйственно ценных признаков исходных видов [14,15].
Закономерности изменчивости содержания и состава эфирного масла у лавандина и перспективы его регулирования.
Разработанные нами принципы подбора родительских пар по содержанию и компонентному составу эфирного масла обеспечивают максимальный выход высокопродуктивных гибридов с высоким уровнем содержания линалоола и линалилацетата. Это позволяет в широких масштабах привлекать в межвидовые скрещивания с диплоидными видами индуцированные авто- и аллополиплоиды, среди которых созданы генотипы, обладающие высоким биосинтезом эфирного масла, высоким содержанием линалоола, устойчивостью к высоким и низким температурам и поздним сроком технической зрелости.
Анализ перспективных комбинаций межвидовых скрещиваний на диплоидном и полиплоидном уровнях выявил, что изученные биохимические признаки: эфиромасличность и содержание линалоола, линалилацетата, борнеола и камфары имеют высокую степень наследуемости (Н2 = 0,67-0,82), что указывает, на высокую эффективность отбора по этим признакам в F1. Корреляционный анализ показал отсутствие прямой или обратной коррелятивной связи между содержанием эфирного масла и его основными компонентами у гибридов F1 (r=0,08-0,21), что свидетельствует о независимом наследовании этих признаков и
возможности получения генотипов, сочетающих высокую эфиромасличность с высоким содержанием ценных компонентов.
Установлено, что признаки имеют различную генетическую детерминацию, в связи с чем проявляют различный характер наследования в F1. Признаки содержания эфирного масла и его компонентов: линалоол, линалилацетат, борнеол, камфара и цинеол в потомстве F1 имеют непрерывную изменчивость и наследуются по промежуточному типу, поскольку имеют полигенную природу (рис. 3).
Рис. 3. Хроматограмма эфирного масла лавандина №1186
1. 9.09 0,495% 1-октен-3-ол 17. 16.85 1,558% а-терпинеол
2. 9.27 0,628% октанон-3 18. 17.82 0,299% нерол
3. 9.40 0,129% мирцен 19. 18.69 28,733% линалилацетат
4. 9.66 0,146% октанол-3 20. 19.53 1,549% лавандулилацетат
5. 10.15 0,317% гексилацетат 21. 19.64 0,171% борнилацетат
6. 10.66 0,095% пара-цимен 22. 19.75 0,105% тимол
7. 10.97 0,411% 1,8-цинеол 23. 20.71 0,045% гексилтиглат
8. 12.32 0,489% транс-линалоолоксид 24. 21.38 0,987% нерилацетат
9. 12.90 0,246% цис-линалоолоксид 25. 21.83 1,433% геранилацетат
10. 13.59 48,853% линалоол 26 21.98 0,068%
11. 13.63 0,878% 1-октен-3-ол ацетат 27. 22.77 0,066%
12. 15.16 0,547% камфора 28. 22.85 0,613% Р-кариофиллен
13. 15.67 0,687% лавандулол 29. 23.36 0,956% Р-фарнезен
14. 16.07 1,173% борнеол 30. 24.03 0,158%
15. 16.39 6,634% терпинен-4-ол 31. 25.84 0,705% кариофилленоксид
16. 16.60 0,694% пара-цимен-8-ол 32. 26.74 0,134% а-кадинол
Выраженность этих признаков в сильной степени зависит от их уровня у родительских форм, что указывает на аддитивный характер действия генов. Установлено, что в потомстве F1 межвидовых гибридов возможно выделение до 15% особей с повышенными показателями линалоола и линалилацетата и пониженными - цинеола, борнеола и камфары.
Для создания высокопродуктивных гибридов с повышенными показателями компонентного состава перспективно использование высокомасличных форм Ь. latifolia К9, К1 и К2, полученных от самоопыления, а также полиплоидов Ь. angustifolia Т34, КЗО (37) и амфидиплоидов 11.87, 11.82. Признак «число мутовок в соцветии» на основании наших данных, имеет моногенную природу и доминирует в потомстве F1 при межвидовых скрещиваниях с высоким числом мутовок родительских форм.
На рис. 4 представлена обобщенная схема создания исходного материала для селекции лаванды с использованием комплекса генетических методов: полиплоидии, межвидовой гибридизации, инбридинга, включая возможные комбинации межвидовых скрещиваний, обеспечивающие получение исходного материала в указанных направлениях.
При сочетании межвидовой гибридизации и полиплоидии с привлечением в скрещиваниях высокоурожайных форм, содержащих большое количество соцветий на растении с высоким числом мутовок (10 шт.) и цветков в мутовке (30 шт.) уже в первом гибридном поколении удалось реализовать высокий эффект гетерозиса по урожаю цветочного сырья. Впервые в СССР удалось создать константные высоколиналоольные (до 73,1%) гибриды с одним геномом Ь. angustifolia и двумя - Ь. latifolia. Лучшие из них - №11.11 и №12.8 - позволяют получать до 256-312 кг эфирного масла с гектара, что на 180-195% превышает показатели районированного лавандина сорта Темп. Программа создания межвидовых гибридов, сочетающих высокую урожайность и масличность с заданными компонентами эфирного масла, включает в качестве родителей диплоидные и индуцированные полиплоидные формы двух видов лаванды - Ь. angustifolia и Ь. latifolia. Создание впервые в мировой практике фертильного амфидиплоида А5 и вовлечение его в скрещивания обеспечивает в гибридном потомстве F1 проявления значительного гетерозисного эффекта по продуктивности, а особенность генетической структуры по генам, контролирующим синтез основных компонентов эфирного масла (гомозиготность по доминантному аллелю - линалоол, и двойная доза гена), позволяют получать гибридное потомство с достаточным количеством (до 30%) высоколиналоольных генотипов при скрещивании с линалоольной формой Ь. latifolia К9.
Ь.аngustifolia (АА) х Ь.latifolia (ЬЬ) 2п(2х)=48 2п(2х)=48
Аллогаплоид (ЛЬ,2п=48) F1 Стерильный гибрид
Колхицинирование
Амфидиплоид фертильный гибрид (AALL)=(2n=96)
Скрещивание ситешчежого амфдиптвда
Биологический метод скрещивания индуцированных полиплоидов
AAхL
L=AA
ЬЬ=
1(2П=96) J
LLxAA=
LLAA=
(2п=96)
( ALxAA=^ ГALxAL=^ Г ALxLL= ^
ALAA= ALAL= ALLL=
(2п=96) (2п=96) (2п=96)
V у1 V У
ALxA= ALA= (2П=72)
ALxL= ALL= (2П=72)
Рис. 4. Схема создания нового исходного материала для селекции лаванды методами полиплоидии и межвидовой гибридизации
Высокий уровень масличности в гибридном потомстве (в среднем до 11%), верхний предел - 16%) обеспечивается генотипом высокомасличной (до 13%) отцовской формы А11.82. Материнская форма Ь. angustifolia К21.02, обладающая высокой продуктивностью и высоким качеством эфирного масла, обусловленное наличием у нее доминантных генов, контролирующих синтез линалилацетата, нерола и гераниола, обеспечивают высокое качество эфирного масла гибридного потомства F1. При скрещивании высокомасличной и высокоурожайной по цветочному сырью, обладающей повышенным содержанием линалилацетата, тетраплоидной формы Ь. angustifolia Т30.37 с высокомасличной и засухоустойчивой амфидиплоидной линией или s2 Амф. 11.87) возможно получение гибридного потомства F1, которое, наряду с высокой
масличностыо, обладает повышенной засухоустойчивостью и высоким содержанием линалилацетата (более 70%). Разработана также схема создания гетерозисных высокопродуктивных гибридов с тремя геномами Ь. latifolia, пригодных для использования в медицине и фармацевтической промышленности. Таким образом, сочетание в одном генотипе лаванды нескольких хозяйственно ценных признаков (высокое содержание линалилацетата, линалоола и низкое - цинеола и камфары, высокая масличность, повышенная засухо- и морозоустойчивость) возможно путем подбора исходных родительских форм как на диплоидном уровне, так и путем специального их получения колхицинированием. Синтетически созданные родители должны обладать комплексом доминантных генов, обеспечивающих формирование перечисленных признаков. На полиплоидном уровне необходимо проводить семенное размножение уникальных амфидиплоидных генотипов в связи с константностью хозяйственно ценных признаков у них.
Выводы
Анализ различных методов показал, что основным направлением в создании высокопродуктивных сортов лаванды должна стать межвидовая гибридизация с использованием диплоидных и индуцированных полиплоидных форм.
На основании генетических исследований предложены схемы скрещивания родительских пар для выведения высокопродуктивных сортов (гибридов) лаванды с комплексом утилитарных признаков.
Установлен генотип видов и форм лаванды, используемых в селекционно-генетических исследованиях (Ь. angustifolia и Ь. 1а^оИа) по генам, контролирующим синтез основных компонентов эфирного масла (линалоол, линалилацетат, камфора, борнеол, цинеол).
Изучены закономерности структурных элементов продуктивности у лаванды. Составлена математическая модель продуктивности, показывающая взаимосвязь ее элементов. Выявлен эффект гетерозиса по продуктивности у аллотриплоидов, обьединяющих геномы двух различных видов лаванды - Ь. angustifolia и Ь. latifolia.
Доказана перспективность использования в селекции лаванды комплекса генетических методов - межвидовой гибридизации, полиплоидии, инбридинга - для улучшения утилитарных признаков исходного материала. Это позволило дифференцированно подойти к решению задач промышленного производства , а также наметить пути для дальнейшего совершенствования используемых методов селекции лаванды.
Список литературы
1. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ: Подход с использованием ЭВМ. - М.: Мир, 1982. - 488 с.
2. Буюкли М. Лаванда и ее культура в СССР. - Кишинев: Картя Молдавеняскэ, 1969. - 326 с.
3. Демьянов Н.Д., Нилов В.И., Вильямс В.В. Эфирные масла, их состав и анализ. - М.-Л., 1933. - С. 55.
4. Доспехов В.А. Методика полевого опыта. - М.: Колос, 1985. -
424с.
5. Иванов Н.Н. Методы биохимии и физиологии. - М.- Л., 1946. -268 с.
6. Карпеченко Г.Д. Теория отдаленной гибридизации // М.-Л.: Сельхозгиз ОГИЗ, 1935, 65 с.
7. Лиепа И.Я. Методологический комплекс для экологического изучения биологических систем // Общая биология. - 1980. - 41, №3. - С. 363-371.
8. Лиепа И.Я. Моделирование и прогнозирование в ботанике // Учен. Зап. Латв. Ун-та. - 1971. - Т. 153. - С. 36-40.
9. Машанов В.И. Итоги селекции лавандина // Тр. Никит. ботан. сада. - Ялта, 1987. - Т. 103. - С. 7-31.
10. Нестеренко П.А. Лаванда и лавандины // Тр. Никит. ботан. сада. -Ялта, 1939. - Т. 18, Вып. 2. - С. 76.
11. Нестеренко П.А. Селекция лавандинов // Тр. Гос. Никит. Ботан. сада. - 1947. - Т. 24, Вып. 2. - С. 8.
12. Нестеренко П.А., Книшевецкая Т.И. О методах селекции эфиромасличных культур // Определение содержания масла Lavandula vera DC по железкам // Соц. растениеводство. - 1934. - № 12. - С. 37-46
13. Нилов В.И. Биохимия лаванды // Биохимия культурных растений .- М.- Л., 1938. - Т.6. - С. 5-30.
14. Работягов В.Д. Преодоление стерильности у лавандинов (L.angustifolia Mill, и L. latifolia Medic.) // Цитология и генетика. -1975. -Т. 9, №5. - С. 443-446.
15. Работягов В.Д. Проблема синтеза лавандина // Тр. Никит, ботан. сада. - 1983. - Т. 91. - С. 92-101.
16. Работягов В.Д. Способ отбора высокопродуктивных форм лаванды. - А.с. №1421279 на изобр., выд. 8 мая 1988.
17. Работягов В.Д. Экспериментальная полиплоидия у лаванды настоящей: Автореф дисс... канд. биол. наук: спец. 03.00.05. «Ботаника». -Донецк, 1972. - 22 с.
18. Работягов В.Д., Акимов Ю.А. Наследование содержания и состава эфирного масла у тетра- и сесквидиплоидов лаванды // Генетика. -1990. -Т. 6. -С. 283-291.
19. Работягов В.Д., Акимов Ю.А. Наследование содержания и состава эфирного масла при межвидовой гибридизации лаванды // Генетика. - 1986. - Т. 22, № 6. - С. 1163-1172.
20. Резникова С.А., Бугаенко Л.А. Методические рекомендации по подбору родительских пар при межвидовых скрещиваниях у мяты. - М., 1985. - 22 с.
21. Романенко Л.Г. Характеристика коллекционных клонов лаванды по урожаю соцветий в онтогенезе // Селекция и семеноводство. -1981. - Вып. 47. - С. 30-33.
22. Романенко Л.Г., Буюкли С.М. Лабильность способов опыления у лаванды настоящей // Селекция, технология возделывания и переработки эфироносов. - Симферополь, 1980. - Т. 13. - С. 19-22.
23. Савченко В.К. Ассоциированный отбор и его роль в эволюции и селекции // Общая биология. - 1980. - Т. 41, №3. - С. 405-417.
24. Чувашина Н.П. Отдаленная гибридизация и экспериментальная полиплоидия в роде Ribes: автореф. дис. д-ра биол наук. спец: 03.00.05 - ботаника - М.: ГБС АН СССР, 1973. - 38 с.
25. Шоферистова Е.Г., Работягов В.Д., Машанов В.И. Органогенез и биология цветения лаванды и лавандина // Ботан. журнал. - 1977. - Т. 62. - С. 1479-1491.
26. Abrial C. et Gettefosse R.M. Lavandins La parfumerie moderne. -1937, V. 31, № 4. - Р. 133-139.
27. Devetak Z. Selekcija lavande i lavandina // Rodovi Poijoprivrednoge Fakulteti Universiteta u Srajevi. - 1971/1972. - V. 20/21. -№22/23. - P. 165.
28. Maia E. Contribution a l'amelioration de letal sanitaire du Lavandin clone ABRIAL // Ann. Phytopathol. - 1973. - V.5, №2. - P. 115-124.
29. Maia N. Beck A., Marais et al. La selection du lavandin // Riv. Italians. - 1981. V. 63, N 3. - P. 163-167.
30. Martin C., Zola A. Etude sur le nouvelles varieties de Lavandin // Rivista Italiana. - 1975. - V. 55, № 5. - Р. 291-298.
31. Paris R., Dilleman G. Le probleme du Lavandin et les lois de l'hybridation La France ses Parfums. - 1950. - № 13. - Р. 14-21.
32. Rabotyagov V.D. Overecoming sterility in Lavandins (X. angustifolia x L.latifolia ) Cytology and genetics. - 1975 - 9(5). - P. 57-60.
33. Vinot M., Bouscary A. Etudes sur la Lavande. VI. Les hybrides // Recherches. - 1971. - Vol. 18. - P. 29-44.
34. Vinot М., Bouscary A. Etudes sur la Lavande. V // Population et selections Recherches. - 1969. - Vol. 17. - P. 55-74.
