CC BY
52
Вороной Н.О.1, Никитенко А.Ю.2, Атопкин Д.М.1, 2
Дальневосточный Федеральный университет 2 Биолого-почвеный институт ДВО РАН [email protected]
ПРИМОРСКИЕ ЭСТУАРНЫЕ ПОСЕЛЕНИЯ ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА CORBICULA JAPONICA PRIME, 1864 ОБЛАДАЮТ НИЗКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТЬЮ ГЕНА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ (I)
Впервые дана оценка внутривидовой генетической изменчивость эстуарного двустворчатого моллюска Corbicula japonica Prime, 1864 из разных водоемов Приморского Края Дальнего Востока России по данным частичного секвенирования гена первой субъединицы цитохром оксида-зы (COI) митохондриальной ДНК. Сравнительный анализ генотипов позволил установить принадлежность исследуемых особей к япономорской гаплогруппе C. japonica. Установлено, что исследуемый участок гена COI высоко консервативен у образцов из географически удаленных локаций, что, с одной стороны, может указывает на принадлежность всех особей к одному виду, C. japonica и с другой стороны - на недавнее вселение моллюсков в эстуарии юга Приморья.
Ключевые слова: Corbicula japonica, Приморский Край, секвенирование ДНК, ген COI, генетическая изменчивость, гаплогруппы.
Двустворчатые моллюски рода СотЬісиїа Megerle et Muhlfeld, 1811 представляют собой группу небольших по размерам пресноводных и солоноватоводных и моллюсков. Природный ареал корбикул охватывает значительную область, от Африки и Ближнего Востока, до Австралии и о. Сахалин, распространяясь практически по всей Азии. Корбикулы широко распространены в стоячих и проточных пресноводных системах российского Дальнего Востока, образуя значительные скопления в эстуариях, лиманах, лагунах, озерах и реках Приморского, Хабаровского краев и Сахалинской области [1]. В последние десятилетия дальневосточных корбикул активно добывают и экспортируют в страны Юго-Восточной Азии.
Для успешного долголетнего ведения промысла и сохранения биоразнообразия необходимо понимание популяционно-генетической структуры вида. Определение реальной под-разделенности вида на дискретные единицы воспроизводства позволяет разделить общую величину сырьевых запасов вида на запасы, приуроченные к отдельным участкам ареала, равномерно распределить промысловую нагрузку на локальные группировки, не нарушая способности этих группировок к восстановлению. В Японии и Корее генетическая структура популяций основных коммерчески ценных видов корбикул исследована достаточно подробно [2,3,4,5], при этом полностью отсутству-
ют аналогичные исследования российской части ареала корбикул.
Типичным представителем солоноватоводных моллюсков рода Corbicula на юге Дальнего Востока России является Corbicula japonica Prime, 1864. Этот вид распространен в эстуариях рек, впадающих в Японское море от Восточно-Корейского залива до западного побережья о. Сахалин. Однако для водоемов Приморского края являются валидными еще 4 вида корбикул [6], при этом определение описанных видов затруднительно ввиду изменчивости признаков раковины, используемых для межвидовой диагностики.
Поэтому целью данной работы было оценить генетическое разнообразие массовых эстуарных скоплений корбикул Приморского края для установления их видовой принадлежности.
Материал и методы
Материалом для исследования послужили 78 особей C. japonica, собранных в 7 эстуарных водоемах Приморского края (табл. 1, рис. 1). Тотальную ДНК выделяли из тканей мышц, фиксированных в 96% этаноле, методом фенол-хлороформной экстракции по стандартному протоколу [7]. Наличие и качество выделенной ДНК проверяли с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле, окрашенным бромистым эти-дием. Визуализацию ДНК проводили в УФ свете с помощью гель-документирующей системы
XRII, BioRad. Амплификацию участка гена COI проводили с помощью универсальных праймеров LCO1490 (5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TT 3’) и HCO2198 (5’ TAA ACT TCA GGG TGA CCAAAA AA 3’) в условиях, описанных ранее [8].
ПЦР-продукты были секвенированы с использованием набора Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) согласно протоколу производителя. Детекцию продуктов сиквенсовой реакции осуществляли в генетическом анализаторе GA 3130x1
Таблица 1. Исследованные популяции C. japonica Приморского края
Шифр № Район Координаты
Место сбора Широта Долгота
ЗЛ 1 зал. Лебединый, устье Хасанский 42035'52” 130043-57"
ЛМ 4 зал. Лебединый, мост Хасанский 42034-41" 130041-47"
ГУ 9 р. Гладкая, устье Хасанский 42042’6" 130050-17"
Г 4 р. Гладкая, протока Хасанский 42042-2" 130052-50"
ЛУ 4 лаг. Лебяжья, устье Хасанский 42058-56" 131029-14"
КС 25 р. Киевка, старое русло Лазовский 42051-42" 133040-30"
КН 19 р. Киевка, новое русло Лазовский 42051-43" 133038-38"
РУ 3 р. Раздольная Надеждинский 430 19-28" 131049-56"
РП 3 р. Раздольная Надеждинский 43027-1" 131050-58"
П 3 р. Партизанская Партизанский 42051-43" 13300-57"
ТП 3 оз. Пресное Ольгинский 43052-10" 135028-54"
Рисунок 1. Карта-схема расположения исследованных выборок из эстуарных водоемов Приморского края (шифр мест сбора см. табл.1)
(Applied Biosystems) на базе Кафедры клеточной биологии и генетики ДВФУ.
Сборку консенсусных последовательностей выполняли в программе SeqScape v. 2.6 (Applied Biosystems). Выравнивание последовательностей выполняли с помощью модуля Clustal W, встроенного в пакет MEGA 5.0 [9]. Оценку генетической дивергенции проводили путем расчета p-дистанций в пакете MEGA 5.0. Филогенетические связи были реконструированы с помощью методов ближайшего соседа, максимальной парсимонии, максимального правдоподобия в программе PAUP 4.b.10 [10] и байесового моделирования с использованием эволюционной модели Таму-ры-Нея (TrN+G+I) с гамма - распределением нуклеотидных замен и расчетом пропорции инвариантных сайтов [11] в программе Mr.Bayes 3.1.2 [12]. Выбор оптимальной эволюционной модели осуществляли с помощью информационного критерия Акейки [13] в программе Modeltest 3.7 [14]. Тест на дифференциацию AMOVA выполняли с помощью программы Arlequin v. 3.11 [15]. Достоверность филогенетических связей оценивали с помощью бутстреп анализа с использованием 1000 репликаций [16].
Результаты
Длина секвенированного участка, использованного для анализа, составила 450 пн. Значения p-дистанций между последовательностями гена COI у образцов C. japonica из разных географических локаций варьировали от 0 до 0.5%, составляя в среднем
0.16%±0.08%. Максимальное значение дивергенции выявлено между популяциями C. japonica из разных водоемов Хасанского района. Результаты теста AMOVA показали, что основная часть генетической изменчивости (92.9%) участка гена COI при сравнении моллюсков C. japonica с разных водоемов сосредоточена внутри сравниваемых выборок. Значения p-дистанций между последовательностями C. japonica из Дальнего Востока России (ДВР) и из Южной Кореи и Японии изменялось в диапазоне от 0.5 до 1%. Дифференциация последовательностей гена COI между C. japonica и другими видами составляла от 2.08% (“C. fluminalis") до 11.33% (C. australis).
Гаплотипическая сеть, реконструированная для C. japonica по данным p-дистанций, демонстрировала наличие двух гаплогрупп (рис. 2). Первая гаплогруппа включала 13 гап-лотипов, обнаруженных у особей как с рос-
Рисунок 2. Гаплотипическая сеть, реконструированная для С. ]аропка из выборок Приморского Края, Кореи и Японии по данным частичного секвенирования гена С01 мтДНК (шифр мест сбора см. табл.1).
Указано количество мутационных шагов
АШ0
100
100 П С.}аротеа ДВР 100 АП96271 С. }аротеа Япония
АГ367441 С. ]аротеа Ю. Корея 93 С. ]аротеа ДВР
---С. АыттаИя АЕ457996
--------С. madagascariensis АГ196275
— С Аыттеа АП20666
100 Г С. anomioid.es DQ285604 100 1 С. possoensis DQ285596
100 I С. 1еапа АП96268 100 ----С. ]агатса АЕ457993
100
100
100 100 100
С. ІоеНетІБ DQ285580
— С. таіаппетіз DQ285591
С. яапйаі ЛЕ196273 ---------С. атїгаШ ЛП96274
— С. Іатагекіапа DQ285578 І^еоеогЬіеиІа Птоза ЛГ196277
10
Рисунок 3. Филогенетическое дерево видов рода реконструированное с помощью алгоритма максимального правдоподобия (N1)
сийского Дальнего Востока (примерно 10% всей выборки), так и из Японии и Южной Кореи.
Вторая гаплогруппа включала остальных особей С. )ароп1са из ДВР и была представлена одним гаплотипом. Полученные группы были разделены друг от друга одним мутационным шагом.
Филогенетические реконструкции показали, что вид С. )аротса достоверно отличался от других представителей рода СотЫсы1а и дифференцировался на два кластера с высокой статистической поддержкой (рис. 3). Филограммы, построенные по разным алгоритмам сохраняли свою топологию. Первый кластер включал значительную часть особей С. )ароп1са с ДВР и образец из Японии, формировавший здесь базальную ветвь. Второй кластер включал в себя особей из ДВР и Южной Кореи. Дивергенция между последовательностями С. )аротса, включенными в разные кластеры, составила 0.5%. Дифференциация особей С. )ароп1са из Приморского края внутри каждого кластера не согласовывалось с географическим происхождением выборок.
Обсуждение
В данной работе впервые проведен анализ генетической изменчивости С. )аротса на территории Приморского Края Дальнего Востока России по данным частичного секвени-рования гена С01 мтДНК. Результаты указывают на высокую консервативность данного гена внутри вида на всей исследуемой территории. Однако дифференциация дальневосточных корбикул из разных локальностей значительно ниже по сравнению с дифференциацией приморских особей и образцов из Японии и Южной Кореи. Тем не менее, данный уровень дифференциации (0.5%) не превышает минимальных значений межвидового диапазона (2.08%). Таким образом, наши
данные указывают на принадлежность исследуемых моллюсков в эстуарных водоемах Приморского Края к одному виду - С. )ароп1са.
Из исследованных 77 особей, собранных на расстоянии до 400 км друг от друга было обнаружено 12 гаплотипов, отличающихся друг от друга максимум двумя мутационным шагами. При этом в работе японских исследователей, в выборках С. )ароп1са, собранных от устья Амура до юга Корейского полуострова и вокруг островов Японии было обнаружено 113 гаплотипов с дифференциацией до 11 мутационных шагов, среди которых 4 гап-лотипа встречались практически повсеместно [5]. На основании этих данных авторы выделили 4 основные гаплогруппы: 1) Россия (устье р. Амур), Хоккайдо, Япономорская группа; 2) Тихоокеанская группа; 3) Северо-восток Корейского полуострова; 4) Юго-запад Корейского полуострова. Наши данные в целом согласовываются с результатами Иида с соавторами и указывают на принадлежность всех исследуемых нами моллюсков С. )аротса к выделенной ими первой гаплогруппе.
Анализ собственных и литературных данных позволяет интерпретировать полученные результаты с двух взаимодополняющих позиций:
1. Низкий уровень изменчивости митохондриального гена цитохромоксидазы I свидетельствует об относительно недавнем заселении корбикулы в водоемы Приморья.
По данным археологических раскопок раковинных куч было показано, что С. )аротса отсутствовала в раннем голоцене до рубежа периода бореал-атлантик, и появилась в самом начале атлантического периода (около 7.3-7.4 тыс. л.н.), а через несколько сот лет корбикулы имели уже довольно большую численность [17] (Раков и др., 2011). Появление и широкое распространение корбикул в водах Приморского края связывают с климатическим оптимумом голоцена, сопровождавшегося повышением уровня моря на 3-4 метра выше современного [18]. До этого времени (в раннем голоцене) условия для появления и распространения корбикул в Приморье были довольно неблагоприятными. В период от 9,3-8,0 тыс. лет назад до 7,4-7,5 тыс. лет назад, отмечено значительное похолодание климата, сопровождавшегося небольшой регрессией моря [18].
По всей видимости, такого сравнительно небольшого времени существования поселений корбикулы в эстуариях Приморья недостаточно для преобладания дрейфа генов над миграцией. Поэтому высокая консервативность исследуемого участка гена С01 у С. )аротса вероятнее всего является следствием эффекта основателя. Моллюски могли заселять водоемы юга Приморья примерно в одно и то же время, о чем говорит идентичность приморских особей из разных локальностей японским гаплотипам.
2. Консервативность исследованного фрагмента гена С01 объясняется обменом генами между отдельными поселениями. Эс-туарные скопления корбикул из разных водоемов разделены между собой морем. Взрослые
моллюски не могут попадать из одного эсту-арного водоема в другой через море из-за невозможности более 5 дней переносить морскую соленость [18]. Вероятно, такой период времени корбикулы способны переносить гипоксию, при срабатывании изолирующего рефлекса.
Логично предположить, что такой обмен может существовать благодаря перемещению личинок корбикулы. Как и большинство двустворчатых моллюсков, С.)аротса имеет свободно плавающую планктонную личинку. Длительное (до двух недель) пребывание в планктоне [19], зависимость от приливно-отливных течений [20] и соленостно-избира-тельное поведение личинок корбикулы [21, 22] делает возможным их перенос между отдельными эстуарными системами. Этому может способствовать также тот факт, что нерест корбикулы происходит с июля по сентябрь [23, 24] (Маги & №ка1, 2006; Рыбалкина и др., 2013), когда наблюдается значительное рас-преснение прибрежных вод, вызванное ливневыми дождями.
Заключение
Таким образом, исследованные поселения эстуарных корбикул обладают низким уровнем изменчивости гена С01 мтДНК. Низкие значения р-дистанций (менее 1% ) между исследованными нами выборками и образцами из Японии и Кореи соответствуют внутривидовому уровню изменчивости (до 2% ), что указывает на принадлежность этих моллюсков к одному виду - С. )аротса. Учитывая особенности наследования митохондриальных генов (гены передаются по материнской линии без формирования аллельных вариантов) можно предположить, что миграционные процессы на личиночной стадии способствуют поддержанию высокого сходства между отдельными поселениями корбикул в Приморье.
2.08.2013
Работа выполнена при поддержке гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, договор № 11.G34.31.0010, а также гранта Министерства образования и науки РФ № 02.740.11.0678 «Структура и функционирование прибрежных экосистем российской части Японского моря» в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Список литературы:
1. Явнов С.В., Раков ВА. Корбикула. Владивосток: ТИНРО-центр. - 2002. 145 с.
2. Hatsumi M., Nakamura M, Muneyoshi H., Nakao S. Phylogeny of three Corbicula species and Isozyme polymorphism in the Corbicula japonica populations // Venus. - 1995. - V. 54. - №3. - P. 185-193.
3. Lee J.-S., Kim J.-B. Systematic study on the genus Corbicula (Bivalvia; Corbiculidae) in Korea // The Korean Journal of Systematic Zoology. - 1997. - V. 13. - P. 233-246. [In Korean with English summary]
4. HuhM. K., Lee B.K., Kim B.K., Heo Y.-S., Lee H.Y. Ecological and genetic biodiversity of Corbicula leana in the Nakdong River and the Nam River // Korean J. Ecol. - 2005. - V. 282. - P. 63-67.
5. Iida M, Kanno M, Kijima A. Genetic population structure of Corbicula japonica around East Asia estimated by mtDNA COI sequence analisys // Nippon Suisan Gakkaishi. - 2012. - V. 78. - №5. - P. 934-944.
6. Kantor Yu.I, VinarskiM.V., Schileyko A.A., SysoevA.V. Catalogue of the continental mollusks of Russia and adjacent territories version 2.3.1. (published online on March, 2). - 2010.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. 480 стр.
8. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R., Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates // Molecular Marine Biology and Biotechnology. - 1994. - V. 3. - P. 294-299.
9. Tamura K., Peterson D,. Peterson N, Stecher G, Nei M,. Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution. -2011. - V. 28. - P. 2731-2739.
10. SwoffordD., Olsen G.J., WaddellPJ., HillisD.M. Phylogenetic inference // Molecular Systematics / Eds Hillis D.M., Moritz C., Mable B.K. Sunderland: Sinauer. - 1996. P. 407-514.
11. Tamura K,. Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. - 1993. - V. 10. - P. 512-526.
12. HuelsenbeckJ.P, RonquistF. MRBAYES: Bayesian inference of phylogeny // Bioinformatics. - 2001. - V. 17. - P. 754-755.
13. Akaike, H. A new look at the statistical model identification // IEEE Trans. Automatic Control. - 1974. - V. 19. -P. 716-723.
14. Posada D.P, Crandall K.A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution // Bioinformatics. - 1998. - V. 14. -P. 817-818.
15. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin ver. 3.1: An Interrated software package for population genetics data analysis // Switzerland: Institute of Zool. Comp. and Mol. Pop. Gen. Lab. (CMPG). - 2006. - 145 p.
16. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using bootstrap // Evolution. - 1985. - V. 39. - P. 783-791.
17. Раков В.А., Вороной. Н.О., Шарова О.А. Особенности экологии и распространения корбикулы Corbicula japonica (Bivalvia) в водоемах Сахалина и Приморья в позднем голоцене // Чтения памяти Владимира Яковлевича Леванидо-ва. - 2011. - Вып. 5. - С. 447-453.
18. Короткий А.М. Колебания уровня моря и ландшафты прибрежной зоны (этапы и тенденции) // Вестник ДВО РАН. -1994. - № 3. - С. 29-42.
19. Комендантов А.Ю., Орлова М.И. Экология эстуарных двустворчатых моллюсков и полихет Южного Приморья. В серии: Исследования фауны морей. СПб. - Вып. 52. - №60. - 2003. 164 с.
20. Baba K. Ecological study on spawning and early life stage of the brackish water bivalve Corbicula japonica in Lake Abashiri // Sci. Rep. Hokkaido Fish. Exp. Stn. - 2006. - V. 71. - P 1-41
21. Roegner G.C. Transport of molluscan larvae through a shallow estuary // Journal of Plankton Research. - 2000. - V. 22. -№9. - P. 1779-1800.
22. Hajime S., Hisami K., Kazuko N, et al. Selectivity on salinity of Asiatic brackish clam larvae, Corbicula japonica Prime, 1864 // Benthos Research. - 2005. - V. 60. - №1. - P. 1-10.
23. Lee J.-Y., Kim W.-k., Lee C.-s. Growth and survival of the brackish water clam, Corbicula japonica larvae according to rearing conditions // Korean J. Malacol. - 2011. - V. 27. - №4. - P. 337-343. [In Korean with English summary]
24. Maru K., Nakai J. Annual variation in spawning season of the brackish water bivalve, Corbicula japonica Prime in the Ishikari River // Suisan Zoshoku. - 2006. V. 54. - №3. - P. 313-318. [In Japanese with English summary]
25. Рыбалкина (Дзюба) СМ, Майорова М.А., Анисимов А.П., Кравченко Д.Н. Гаметогенез и репродуктивный цикл двустворчатого моллюска Corbicula japonica Prime (1864) в устье реки Киевка (Японское море) // Биология моря. - 2013. -Т. 39. - №4. - С. 261-271.
Сведения об авторах:
Вороной Николай Олегович, соискатель, инженер кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов Дальневосточного федерального университета 690060 г. Владивосток, ул. Октябрьская 27-142, [email protected] Никитенко Алина Юрьевна, аспирант лаборатории паразитологии Биолого-почвенного института ДВО РАН, [email protected] Атопкин Дмитрий Матвеевич, научный сотрудник лаборатории паразитологии Биолого-почвенного института ДВО РАН, кандидат биологических наук, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостоку, 159, 8(423) 231-07-18, заведующий лабораторией кафедры клеточной биологии и генетики Дальневосточного федерального университета. 690060 г. Владивосток, ул. Октябрьская 27-236, [email protected]
