CC BY
94
УДК 615.31 Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
4. Дисфункция вегетативной нервной системы в формировании синдрома раздражённого кишечника и принципы её коррекции /
Н. А. Жуков (и др.) // Российский журнал гастроэнтерологии, гепа-тологии, колопроктологии. - 2004. - № 5. - С. 35-41.
5. Ивашкин В. Т. Синдром раздраженного кишечника как био-психосоциальное заболевание / В. Т. Ивашкин, Е. А. Полуэкто-ва.- С.11.
6. Белухшет С. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2003. - № 6. - С. 2-10.
7. Индекс эрготропной активности - интегральный показатель состояния надсегментарных центров вегетативной регуляции / С. А. Котельников, А. Д. Ноздрачев, А. П. Коваленко (и др.) // Физиология человека. - 2003. - Т. 29. № 3. - С. 66-71.
8. Лечение головных болей напряжения методом биологической обратной связи / А. М. Вейн (и др.) // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 1997. - Т. 97. № 1. -
С. 67-70.
9. Метод адаптивного поведенческого биоуправления и перспективы его использования в лечении функциональных и психосоматических заболеваний / М. А. Унакафов, Г. А. Трембач, Г. Ф. Коротько (и др.) // Труды Всерос. конф. с междунар. участием «Современные проблемы адаптивной физической культуры, адаптивного спорта и физической реабилитации». - Краснодар, 2009. - С. 245-248.
10. Нейрофизиологические механизмы формирования навыка сопротивления страху под контролем биологической обратной связи / Е. И. Попова (и др.) // Журнал высшей нервной деятельности. - 2002. - Т. 52. № 5. - С. 563-569.
11. Полуэктова Е. А. Синдром раздражённого кишечника - от патогенеза к лечению // Южно-российский медицинский журнал. -
2004. - № 4. - С. 39-43.
12. Современные представления о патогенезе синдрома раздражённого кишечника / Н. А. Жуков (и др.) // Клиническая медицина. - 2003. - № 12. - С. 7-13.
13. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения больных с заболеваниями органов пищеварения: Приказ МЗ № 125 от 17.04.1998. - 64 с.
14. Трембач Г. А. Использование адаптивного биоуправления с обратной связью в лечении синдрома раздражённого кишечника / Г. А. Трембач, Г. Ф. Коротько // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2009. - № 1. -
C. 67-71.
15. Уголев А. М. Гормоны пищеварительной системы / А. М. Уголев, О. С. Радбиль. - М.: Наука, 1995. - 282 с.
16. Циммерман Я. С. Синдром раздражённой кишки: современное состояние проблемы и перспективы // Клиническая медицина. - 2007. - № 10. - С. 14-21.
17. American gastroenterological association technical review of irritable bowel syndrome / D. A. Drossman (et al.) // Gastroenterology. -1998. - № 10. - P. 895-901.
18. Functional bowel disorders and functional abdominal pain. Rome 2: A multinational consensus document on functional gastrointestinal disorders / W. G. Thompson (et al.) // Gut. - 1999. -V. 45. - P. 1143-1148.
19. Irritable bowel syndrome / K. W. Heaton (et al.) // Gastroenterology. - Edinburgh: Churchill Livingstone, 1992. -P. 49-62.
20. Psychological factors of irritable bowel syndrome /
D. A. Drossman (et al.) // Gastroenterology. - 1988. - Vol. 95. -P. 701-708.
Поступила 23.12.2010
Д. А. ФАДЕЕВА1, В. И. КОЧКАРОВ1, М. А. ХАЛИКОВА2, О. О. НОВИКОВ1, Д. И. ПИСАРЕВ1, В. Н. СОРОКОПУДОВ1, Л. М. ДАНИЛЕНКО1, Н. Н. ПОПОВ1
ПРИМЕНЕНИЕ ТИТРИМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРНОЗИНА
кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии;
2кафедра фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет»;
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85, тел. (4722) 301300*2057. E-mail: [email protected]
В статье приведены результаты разработки методики количественного определения карнозина методом прямого кислотного титрования и косвенной йодометрии. Разработанные методики предложено использовать для анализа карнозина индивидуально и в смеси.
Ключевые слова: карнозин, количественное определение, титрование, ацидиметрия, косвенная йодометрия.
D. A. FADEEVA1, M. A. KHALIKOVA2, D. I. PISAREV1, O. O. NOVIKOV1,
V. N. SOROKOPUDOV1, V. I. KOCHKSROV1, L. M. DANILENKO1, N. N. POPOV1
APPLICATION OF TITRIMETRIC METHODS FOR QUANTIFICATION OF CARNOSINE
department of pharmaceutical chemistry and pharmacognosy of Belgorod state university; department of pharmaceutical technology, management and economics of public health service
of Belgorod state university,
Russia, 308015, Belgorod, Pobedy st., 85, tel. (4722) 301300*2057. E-mail: [email protected]
The results of elaborating of analysis procedure of carnosine quantification are represented in article. It is offered to use this procedure in analysis of carnosine individual and in mixture.
Key words: carnosine, quantification, titration, acidimetry, indirect iodometry.
Введение
Поиск новых действующих веществ для лекарственных препаратов в последние годы направлен в сторону природных биологически активных веществ ввиду их низкой токсичности и минимуму побочных эффектов. Одним из таких соединений является дипептид карнозин [6].
Карнозин (в-аланил-Ь-гистидин) — дипептид природного происхождения, широко встречающийся в тканях животных и человека. Открытие карнозина в составе мышечной ткани поставило перед исследователями проблему его биологической активности. Изучение феноменов, присущих этому дипептиду, осуществлялось параллельно с исследованием механизмов его вовлечения в метаболизм клетки. К настоящему времени продемонстрирована способность карнозина защищать клетки от окислительного стресса, а также увеличивать их устойчивость при избыточной функциональной нагрузке и при накоплении возрастных изменений
[1]. Одним из доказанных свойств карнозина является его антикатарактальное действие. Карнозин, являясь антиоксидантом, предотвращает окислительное модифицирование белков хрусталика и, как следствие, развитие катаракты [3].
Широкий спектр биологической активности карнозина позволяет использовать данное соединение в качестве активного компонента лекарственных препаратов различных терапевтических групп как в промышленных масштабах, так и в условиях производственных аптек.
С приходом на постсоветский фармацевтический рынок дженерических препаратов количество производственных аптек и отделов резко сократилось. Однако именно аптечное производство может решить социальный заказ населения по недорогостоящим препаратам первой необходимости, например, глазным каплям, мягким лекарственным формам. Особенно значимым аптечное производство становится для социально незащищенных слоев населения, страдающих офтальмологическими заболеваниями, в том числе катарактой. Производство антикатарактальных препаратов с карнозином в условиях аптек позволит существенно снизить стоимость и повысить их доступность для всех категорий пациентов.
Для адекватного процесса производства таких препаратов необходимы современные экспрессные и точные методы анализа внутриаптечных заготовок.
Изучению химических свойств карнозина посвящено немало исследований, однако вопросам анализа
данного соединения в лекарственных формах уделялось недостаточно внимания. Следовательно, существует необходимость в разработке методик анализа карнозина с целью их использования в формировании нормативной документации на создаваемые лекарственные препараты.
Целью работы явилась разработка методик количественного определения карнозина титриметрически-ми методами.
Известно, что взаимодействие карнозина с солями меди (II) позволяет использовать метод косвенной йодометрии для количественного определения данного пептида [4].
Наличие в структуре карнозина третичного атома азота позволяет разработать методику количественного определения карнозина методом прямого кислотного титрования 0,1 М раствором кислоты хлороводородной с потенциометрическим определением точки эквивалентности. При взаимодействии карнозина с кислотой хлороводородной образуется гидрохлорид:
Фактор эквивалентности карнозина в данной реакции равен 1.
Методика определения
Для определения стехиометрической закономерности карнозина с ионом Си2+ использовали спектрофотометрическое титрование по методу Йоу-Джонса [5], заключающееся в последовательном измерении оптической плотности серии растворов с постоянным содержанием карнозина и различным содержанием ионов меди (II). После этого строили график зависимости величины оптической плотности от отношения числа молей лиганда к числу молей иона металла. Точку эквивалентности определяли в месте перегиба кривой.
В качестве раствора лиганда использовали 0,1 моль/л раствора карнозина, который готовили следующим образом: точную навеску вещества (22,6 г) переносили количественно в колбу мерную вместимостью
Таблица 1
Приготовление растворов меди сульфата (II)
№ п/п Концентрация раствора меди (II) сульфата, моль/л Навеска кристаллогидрата соли (С^04-5Н20), г Объем колбы мерной, мл
1 0,005 0,25 50
2 0,01 0,25 100
3 0,015 0,75 50
4 0,02 0,5 100
5 0,03 0,75 100
6 0,04 1,0 100
7 0,05 1,25 100
8 0,08 2,0 100
9 0,1 2,5 100
10 0,15 3,75 100
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
1000 мл, добавляли 100 мл воды очищенной, перемешивали до полного растворения субстанции и доводили объем в колбе до метки тем же растворителем.
Для проведения реакции комплексообразования готовили ряд растворов меди сульфата: навеску кристаллогидрата переносили в мерную колбу, растворяли в воде очищенной и доводили водой до метки (табл. 1).
Для определения карнозина методом косвенной йодометрии точную навеску карнозина (около 0,3 г) растворяли в 10 мл воды в конической колбе вместимостью 100 мл с притертой пробкой, добавляли 3 мл 10%-ного водного раствора меди (II) сульфата и 2 мл 10%-ного раствора калия йодида. Реакционную смесь оставляли на 20 минут в темном месте, после чего фильтровали для отделения осадка меди (I) йодида. Фильтрат оттитровывали 0,1 М раствором натрия тиосульфата в присутствии индикатора - крахмала. Параллельно проводили холостой опыт. Расчет содержания карнозина в субстанции проводили по формуле:
с = (V - V• ) • Т (1),
где V - объем раствора натрия тиосульфата, пошедший на титрование холостого опыта, мл;
V - объем раствора натрия тиосульфата, пошедший на титрование избытка иона меди, мл;
Т - титр раствора натрия тиосульфата по определяемому веществу, г/мл;
а - навеска карнозина, г.
Титр (г/мл) по определяемому веществу рассчитывали следующим образом
Т =
3-226,2-/ -С (2), 1000
где 1 - фактор эквивалентности карнозина;
С - концентрация раствора натрия тиосульфата, моль/л;
226,2 - молярная масса карнозина, г/моль;
3 - коэффициент пересчета (при взаимодействии кар-нозина с ионом Си2+ на один моль карнозина приходится 1/3 моль меди (фактор эквивалентности равен 1), однако для стехиометричности расчетов необходимы целые значения количества вещества, поэтому при расчетах фактор эквивалентности необходимо умножать на 3.
Приготовление раствора меди сульфата 10%-ного: в мерную колбу вместимостью 250 мл помещали навеску около 39,06 г кристаллогидрата меди сульфата
(II) и растворяли в воде очищенной.
Приготовление 10%-ного раствора калия йодида: в мерную колбу вместимостью 250 мл помещали навеску калия йодида (25 г) и растворяли в воде очищенной, после чего доводили объем в колбе до метки.
Для определения карнозина методом прямой аци-диметрии точную навеску карнозина (0,3 г) помещали в коническую колбу вместимостью 50 мл, добавляли 20 мл воды дистиллированной, перемешивали до полного растворения субстанции. После этого титровали полученный раствор 0,1 М раствором кислоты хлороводородной с потенциометрической детекцией точки эквивалентности. Титр 0,1 Н раствора кислоты хлороводородной по карнозину составил 0,02262 г/мл. Содержание карнозина в субстанции (%) рассчитывали по формуле:
где V - объем раствора кислоты хлороводородной, пошедшей на титрование, мл;
Т - титр раствора кислоты хлороводородной по определяемому веществу, г/мл;
а - навеска субстанции карнозина, г.
Результаты и их обсуждение
В результате исследований получена кривая спектрофотометрического титрования (рис. 1) и установлено, что один моль ионов меди (II) связывает в комплекс три моль молекул карнозина.
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
К
D
Рис. 1. Кривая спектрофотометрического титрования 0,1 М раствора карнозина
раствором меди (II) сульфата
(К - отношение числа моль карнозина к числу моль ионов меди)
Таблица 2
Результаты количественного определения карнозина в субстанции методом косвенной йодометрии
№ п/п Масса навески карнозина, г Содержание карнозина в субстанции (С), % S АС, % е, %
1 0,3020 95,31 0,66 1,71 1,79
2 0,3014 94,69
3 0,2996 95,32
4 0,2996 95,32
5 0,3014 95,78
6 0,3005 96,67
С=95,52
Таблица 3
Результаты количественного определения субстанции карнозина методом прямого кислотного титрования
№ п/п Масса навески карнозина, г Содержание карнозина в субстанции (С), % S АС, % е, %
1 0,2988 100,97 0,77 1,98 1,97
2 0,3000 99,84
3 0,2991 99,73
4 0,2989 101,63
5 0,2995 100,21
6 0,3002 99,81
С=100,37
Таблица 4
Результаты определения содержания карнозина в его смеси с таурином методом прямого кислотного титрования
№ п/п Объем HCl, пошедший на титрование, мл Содержание карнозина в растворе (С), % Найдено карнозина (С), % S АС, % е, %
1 4,4 1,99 1,990 0,029 0,07 3,74
2 4,2 1,96
3 4,4 2,02
4 4,35 2,03
5 4,25 1,97
6 4,28 1,97
Эти данные использованы для расчета количественного содержания карнозина в растворе методом косвенной йодометрии, уравнения реакций которого приведены ниже [4]. На первой стадии карнозин связывается реакцией комплексообразования с ионом меди:
После этого избыток меди сульфата оттитровыва-ют йодометрически:
2CuSO, +4 KI
І, + 2 Na2S203
-2CuI
\+ h
+ 2JCSO,
2NaI + Na2S406
Результаты йодометрического титрования раствора субстанции карнозина приведены в таблице 2.
Как следует из таблицы 2, содержание карнозина в субстанции, установленное методом косвенной йодометрии, составило 95,52±1,71%. Ошибка определения составила 1,79%.
По результатам экспериментов ацидиметрического титрования была также построена соответствующая
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
объем раствора кислоты хлороводородной, мл
Рис. 2. Кривая титрования раствора карнозина 0,1 М раствором кислоты хлороводородной
кривая (рис. 2). Объем титранта, пошедшего на титрование субстанции карнозина, определяли по точке перегиба кривой титрования.
Результаты ацидиметрического титрования раствора субстанции карнозина приведены в таблице 3. Как следует из таблицы 3, содержание карнозина в субстанции, установленное методом ацидиметрии, составило 100,37±1,98%. Ошибка определения не превысила предела 5%, установленного Государственной фармакопеей, и составила 1,97%.
Известно, что количественный анализ компонентов смеси со сходными свойствами значительно затруднен. Так, при совместном присутствии нескольких аминокислот стандартный метод фор-мольного титрования неприемлем. Разработанная методика позволяет определить содержание карнозина в смеси с аминокислотами. Так, была определена концентрация карнозина в модельной смеси с таурином. Анализировали смесь, содержавшую 2% карнозина и 2% таурина по методике, приведенной выше. Результаты определения приведены в таблице 4.
Как следует из таблицы 4, в смеси карнозина и таурина обнаружено 1,99±0,07% карнозина.
Все разработанные методики были валидирова-ны по показателям «точность», «сходимость», «воспроизводимость», «линейность» и признаны корректными.
Таким образом, разработанные методики позволяют количественно определить карнозин как в нативном виде, так и в смеси и могут быть рекомендованы для использования контроля качества внутриаптечных заготовок.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, Государственный контракт № 14.740.11.0119 от 8 сентября 2010 года, проект «Комплексные фармакологические и технологические исследования ряда субмикроструктури-рованных (наноструктурированных) фармацевтических субстанций с доказанными измененными физико-химическими свойствами».
ЛИТЕРАТУРА
1. Арзуманян Е. С. Карнозин защищает эритроциты от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой / Е. С. Арзуманян, А. В. Махро, О. В. Тюлина и др. // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 418. № 6. - С. 834-836.
2. Болдырев А. А. Карнозин: эндогенный физиологический корректор активности антиоксидантной системы организма / А. А. Болдырев, С. Л. Стволинский, Т. Н. Федорова // Усп. физиол. наук. - 2007. - Т. 38 (3). - С. 57-71.
3. Волков О. А. Биологическая роль карнозина и его использование в офтальмологии (обзор) // Клиническая офтальмология. -2005. - Т. 6. № 3. - Режим доступа: http://www.rmj.ru/articles_5109.htm.
4. Эшворт М. Р. Ф. Титриметрические методы анализа органических соединений. Часть II. Методы косвенного титрования: Пер. с англ. / М. Р. Ф. Эшворт, под общей ред. проф. А. П. Крешко-ва. - М.: Химия, 1972. - 496 с.
5. Юинг Г. Инструментальные методы анализа. - М.: Мир, 1989. - 608 с.
6. Guiotto A. Carnosine and carnosine-related antioxidants: a review / A. Guiotto, A. Calderan, P. Ruzza et al. // Curr. med. chem. -
2005. - Vol. 12 (20). - P. 2293-2315.
Поступила 28.12.2010
