CC BY
5
DOI: 10.24412/2074-5036-2024-464-3-13 УДК: 579.678
Ключевые слова: бактериофаги, листериоз, мясоперерабатывающее предприятие, технологическое вспомогательное средство, Listeria monocytogenes
Key words: bacteriophages, listeriosis, meat processing facility, processing aid, Listeria monocytogenes
1 2' 3Лаишевцев А. И., 1Смирнов Д. Д., 2Киселева И. А., 2Ефимова О. Г., 2Зубкова Е. С., 2Воробьев А. М., 2Андреева А. А., 2Пасивкина М. А., 2' ?3улькарнеев Э. Р., 2Алешкин А. В.
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЛИСТЕРИОЗНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ В ЦЕЛЯХ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕКОНТАМИНАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ: ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ
APPLICATION OF A PROCESSING AID BASED ON LISTERIA BACTERIOPHAGES FOR THE PURPOSE OF SELECTIVE DECONTAMINATION OF FOOD PRODUCTS:
EVALUATION OF EFFECTIVENESS
1000 «ЦБО Микроэкологии» (Evolink). Адрес: 143026, РФ, Москва, Территория инновационного центра «Сколково», Большой бульвар, 42, корпус 1. эт/пом/раб 0/157/5 LLC «CBO Microecology» (Evolink). Address: 143026, Russian Federation, Moscow, Territory of the Skolkovo Innovation Center, Bolshoy Boulevard, 42, building 1. floor/room/work 0/157/5 2ФБУН «МНИИЭМ им. Г. H. Габричевского» Роспотребнадзора Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10 Research Institute for Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky Address: 125212, Admiral Makarov Street, Moscow, 10 3ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я.Р Коваленко Российской академии наук». Адрес: 109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1 Federal State Budget Scientific Institution "Federal Scientific Centre VIEV". Address:109428, Moscow, Ryazansky avenue,24-1
Лаишевцев А. И., кандидат биологических наук, заведующий лабораторией диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, e-mail: [email protected] Laishevtcev A. I., PhD of Biological Sciences, Head of the Laboratory for Diagnosis and Control of Antibiotic Resistance of Causative Agents of the Most Clinically Significant Infectious Animal Diseases, Federal State Budgetary Scientific Institution Federal Scientific Center VIEV (FSC VIEV), e-mail: [email protected] Смирнов Д. Д., кандидат ветеринарных наук, ветеринарный консультант, e-mail: [email protected]
Smirnov D. D., PhD of Veterinary Sciences, Veterinary Consultant, e-mail: [email protected] Киселева И. А., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической
микробиологии и биотехнологии бактериофагов, e-mail: [email protected] Kiseleva I. A., PhD of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Clinical Microbiology
and Biotechnology of Bacteriophages, e-mail: [email protected] Ефимова О. Г., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической
микробиологии и биотехнологии бактериофагов, e-mail: [email protected] Efimova O.G., PhD of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, e-mail: [email protected] Зубкова E. С., научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов,
e-mail: [email protected] Zubkova E. S., Researcher at the Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages,
e-mail: [email protected] Воробьев A. M., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, руководитель лаборатории
клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, e-mail: [email protected] Vorobev A. M., PhD of Biological Sciences, Senior Researcher, Head of the Laboratory of Clinical Microbiology
and Biotechnology of Bacteriophages, e-mail: [email protected] Андреева А. А., младший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии
бактериофагов, e-mail: [email protected] Andreeva A. A., Junior Researcher at the Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages,
e-mail: [email protected]
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 4 (64), 2024
3
Пасивкина М. А., младший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии
бактериофагов, e-mail: [email protected] Pasivkina M. A., Junior Researcher at the Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages,
e-mail: [email protected] Зулькарнеев Э. P., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, e-mail: [email protected] Zulkarneev E. R., PhD ofBiological Sciences, Senior Researcher at Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, e-mail: [email protected] Алешкин А. В., доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заместитель директора по медбиотехнологии, e-mail: [email protected] Aleshkin A. V., Doctor of Biological Sciences, Corresponding member of RAS, Deputy Director for Medical Biotechnology, e-mail: [email protected]
Аннотация. Цель работы - оценка эффективности использования технологического вспомогательного средства (ТВС) на основе коктейля листериозных бактериофагов для селективной деконтаминации пищевых полуфабрикатов в ходе проведения опытно-промышленных испытаний (ОПИ). Предварительно была подтверждена чувствительность штаммов листерий, выделенных из образцов мясных полуфабрикатов, к бактериофагам BF-1379 и BF-1426, входящим в состав ТВС. Деконтаминация образцов осуществлялась в критических точках и предполагала обработку коктейлем бактериофагов с разным соотношением объема ТВС к единице объема свиного фарша в производственных сериях двух ОПИ с последующим осуществлением ежедневного микробиологического контроля. В ходе ОПИ была подобрана оптимальная доза коктейля бактериофагов BF-1379 и BF-1426, необходимая для достижения абсолютной эффективности селективного ТВС в деконтаминации свиного фарша от Listeria monocytogenes. Таким образом, листериозные бактериофаги представляют собой перспективные антибактериальные биологические агенты, которые могут быть использованы в качестве ТВС на перерабатывающих предприятиях с учетом подбора индивидуализированного состава фагов.
Summary. The purpose of the work is to carry out the effectiveness of using a Processing Aid (PA) for selective decontamination of semi-finished food products based on a Listeria bacteriophages cocktail in pilot-scale industrial trials (PITs). The sensitivity of Listeria strains isolated from samples of meat semi-finished products to bacteriophages BF-1379 and BF-1426 included in the PA has been confirmed previously. Decontamination of samples was carried out at critical points and involved treatment with a cocktail of bacteriophages with different ratios of the volume ofPA to a unit volume of minced pork in two PITs followed by daily microbiological control. During the PITs, the optimal dose of the cocktail of bacteriophages BF-1379 and BF-1426 was selected, necessary to achieve absolute effectiveness of the selective processing aid in decontaminating minced pork from Listeria monocytogenes. Therefore, Listeria bacteriophages are promising antibacterial biological agents for their use as PA at a processing enterprise, considering the selection of an individualized phage composition.
Введение
Вспышки листериоза, вызываемые патогенными штаммами Listeria monocytogenes, опосредованы недостаточной противомикробной обработкой пищевых полуфабрикатов растительного и животного происхождения и, как следствие, фекально-оральным путем передачи инфекции [8]. Причем, чаще всего являющаяся высокоустойчивым видом L. monocytogenes обнаруживается в мясных деликатесах и полуфабрикатах ввиду способности микроорганизма размножаться при низких температурах (от +4 0С), при которых проходят основные технологические процессы производства и дальнейшего хранения мясного фарша [2].
С учетом вышесказанного, разработка эффективных мер по предупреждению микробного загрязнения штаммами L. monocytogenes и проведение должного микробиологического мониторинга является необходимой стратегией для производства безопасных мясных продуктов.
При этом добавление антибактериальных препаратов в корма животных малоэффективно при борьбе с листериями и впоследствии негативно сказывается на здоровье человека [3]. Высокая вирулентность L. monocytogenes и развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) также обуславливается способностью образования возбудителем бактериальных биопленок [4]. Таким образом, внедрение альтернативных антибиотикам средств является одной из наиболее актуальных задач для элиминации патогенных штаммов листерий из контаминированных мясных продуктов на мясоперерабатывающих предприятиях [1].
Одним из перспективных направлений снижения распространения патогенных штаммов возбудителя листериоза в мясной продукции является применение биологически активных агентов - бактериофагов, специфически воздействующих на пищевые изоляты L. monocytogenes
и обладающих выраженной антибактериальной активностью [1].
Технологическое вспомогательное средство на основе бактериофагов позволит не только избирательно лизировать планктонные формы L. monocytogenes, но и разрушать бактериальные биопленки, образующиеся на поверхности технологического оборудования [9].
На данный момент уже существуют аналогичные зарубежные зарегистрированные средства на основе листериозных бактериофагов, предназначенные для деконтаминации пищевых продуктов на производстве: Listex™ P100 (Micreos; Нидерланды); ListShield™ (Intralytix; США).
Однако ввиду высокой специфичности бактериофагов, необходимым этапом перед их применением являются опытно-промышленные испытания на мясоперерабатывающем предприятии для подтверждения эффективности сконструированного индивидуализированного фагового состава ТВС.
Цель исследования: Оценка эффективности использования технологического вспомогательного средства (ТВС) на основе коктейля листериозных бактериофагов для селективной деконтаминации пищевых полуфабрикатов в опытно-промышленных испытаниях.
Материалы и методы
Материалы:
Технологическое вспомогательное средство
Для обработки оборудования и мясных полуфабрикатов использовали технологическое вспомогательное средство (ТВС) на основе коктейля бактериофагов, содержащее бактериофаги Listeria monocytogenes phage BF-1379 и Listeria monocytogenes phage BF-1426 в титре 1*109 БОЕ/ мл каждого фага.
Данные бактериофаги задепонированы в Го -сударственной коллекции вакцинных и патогенных штаммов ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН (Listeria monocytogenes BF-1379; Listeria monocytogenes phage BF-1426).
Исследуемые образцы
Изоляты листерий, выделенные из пищевой продукции на мясоперерабатывающем предприятии в ходе опытных и контрольных производственных серий свиного фарша объемом по 250 кг в процессе опытно-промышленных испытаний (ОПИ 1 и ОПИ 2).
Опытные серии обрабатывались ТВС, контрольные серии - плацебо (физиологический раствор) в объеме, аналогичном фаговому коктейлю. На микробиологический анализ направлялось по 13 готовых образцов мясного фарша от каждой
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 4 (64), 2024
опытной и контрольной серии, расфасованных в индивидуальные упаковки массой по 0,5 кг.
Питательные среды
Для выделения и культивирования изолятов листерий из образцов мясного фарша использовали: бульон Фразера полуконцентрированный (Half Fraser broth) (жидкая селективная среда для первичного обогащения), бульон Фразера (Fraser broth) (жидкая селективная среда для вторичного обогащения). Пересев анализируемого биоматериала осуществлялся на хромогенный агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA-агар) (Merck, Германия) и питательный агар для выделения листерий сухой (Среда ПАЛ) (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Для определения чувствительности изолятов листерий к бактериофагам применяли плотный питательный агар (1,5 %) на основе бульона с сердечно-мозговым экстрактом (СМ-агар) (Brain Heart Infusión Broth (BHI)) (Laboratorios Conda, С. А., Испания), а также питательный бульон для выделения листерий (Среда ПБЛ) (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия).
При определении титра бактериофагов методом двойных агаровых слоев использовали мя-сопептонный бульон, 0,9 %-ный раствор NaCl и полужидкий агар. Титр бактериофагов BF-1379 и BF-1426 определяли на непатогенном штамме Listeria innocua В-1319.
Методы:
Отбор чистых линий листерий и их культивирование
Отбор образцов свиного фарша осуществлялся согласно ГОСТ 31904-2012 «Методы отбора проб для микробиологических испытаний». Микробиологическое исследование образцов проводилось согласно ГОСТ 32031-2022 «Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)».
Идентификацию выделенных штаммов проводили при помощи времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на приборе BactoScreen (ООО НПФ «Литех», Россия) с использованием набора реагентов для подготовки образцов с целью последующего анализа, согласно инструкции производителя.
Оценка чувствительности листериозных изолятов, выделенных из свиного фарша, к бактериофагам
Оценка чувствительности листериозной микрофлоры свиного фарша к бактериофагам осуществлялась методом spot-теста. Принцип применяемого метода заключается в нанесении капли (20-30 мкл) фаголизата на предварительно посеянный сплошным газоном исследуемый
5
Таблица 1
Схема обработки мясного фарша ТВС на основе бактериофагов ВЕ-1379 и ВЕ-1426
№ Технологический этап Технологическое оборудование Методика обработки ТВС Дозировка коктейля бактериофага
ОПИ 1 ОПИ 2
1 Крупное измельчение замороженного мяса Блокорезка Спрей (туман), направленная струя на образцы мясной продукции 0,13 мл 109 БОЕ/мл на 1 кг мяса
2 Мелкое и среднее измельчение охлажденного и замороженного мяса Волчок Спрей (туман), направленная струя на образцы мясной продукции 0,13 мл 109 БОЕ/мл на 1 кг мяса
3 Приготовление и перемешивание фарша с посолочными ингредиентами и специями Фаршемешалка Внесение (выливание) в фарш с раствором специй 0,13 мл 109 БОЕ/мл на 1 кг мясного фарша 1 мл 109 БОЕ/мл на 1 кг мясного фарша
Примечание. ОПИ - опытно-промышленное испытание; ТВС - технологическое вспомогательное средство.
Рис. 1. Технологический процесс изготовления опытной промышленной серии свиного фарша с указанием критических точек обработки ТВС. Слева — условия проведения эксперимента для ОПИ 1, справа — для ОПИ 2.
6
штамм листерии на плотной питательной среде (СМ-агар). Через 18-20 часов культивирования при температуре 25±1 °С в аэробных условиях проводится учет результатов и их интерпретация в соответствии с методическими рекомендациями [7].
Определение концентрации фаговых частиц в ТВС
Концентрация фаговых частиц BF-1379 и BF-1426 в ТВС была определена методом двойных агаровых слоев.
Дизайн исследования
Оценка эффективности деконтаминации свиного фарша от листерий с помощью ТВС на основе коктейля бактериофагов BF-1379 и BF-1426 на мясоперерабатывающем предприятии проводилась согласно этапам:
1. Выделение и идентификация изолятов листерий из образцов свиного фарша, изготовленного до эксперимента на мясоперерабатывающем предприятии;
2. Определение чувствительности изолятов листерий, циркулирующих на производстве, к бактериофагам BF-1379 и BF-1426;
3. Производство опытно-промышленных серий свиного фарша с использованием исследуемого ТВС в технологическом процессе с целью биодеконтаминации полуфабрикатов;
4. Учет результатов микробиологического мониторинга образцов свиного фарша, определение оптимальных условий обработки мясных полуфабрикатов коктейлем бактериофагов (в рамках данных ОПИ определение колониеобразующих единиц (КОЕ/г) патогенных листерий, выделенных из готовых образцов свиного фарша, не подразумевалось, выявлялась инцидентность микроорганизма).
Биодеконтаминация мяса в рамках ОПИ 1 проводилась на стадиях измельчения с помощью блокорезки и волчка, а также на конечном этапе смешивания фарша с посолочными ингредиентами и специями, в рамках ОПИ 2 исключительно на этапе смешивания фарша с посолочными ингредиентами и специями (Рисунок 1).
Биодеконтаминация продукции осуществлялась по схеме, представленной в таблице 1.
После ОПИ 1 и ОПИ 2 готовые пробы свиного фарша были направлены для хранения и микробиологического мониторинга в лабораторию ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и в производственно-технологическую лабораторию предприятия производителя. Микробиологическое исследование проводилось ежедневно в течение 13 дней с момента производства с целью имитации инспекционного контроля.
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 4 (64), 2024
Результаты исследования и их обсуждение
Перед проведением опытно-промышленных испытаний с применением ТВС была осуществлена оценка видового состава листерий из образцов свиного фарша. Далее выполнялась проверка чувствительности высеянных листерий к фаговому коктейлю BF-1379 и BF-1426. Результаты spot-теста представлены в таблице 2.
Согласно результатам эксперимента, представленным в таблице 2, была доказана 100 % чувствительность выделенных и идентифицированных штаммов к листериозным бактериофагам BF-1379 и BF-1426. При этом, из данных таблицы следует вывод, что бактериофаги, входящие в состав исследуемого комбинированного ТВС, при оптимальных условиях применения могут приводить к элиминации не только патогенных штаммов Listeria monocytogenes, но и непатогенных видов, таких как: Listeria ivanovii, Listeria innocua, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri.
Результаты первого опытно-промышленного испытания
В процессе ОПИ 1 изготовлено и передано в микробиологическую лабораторию 78 опытных и контрольных образцов свиного фарша. Из поступивших проб в течение 13 дней выделено 442 изолята микроорганизмов (различных видов). Среди них был идентифицировано 75 изолятов бактерий рода Listeria, а именно 5 видов: Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri (таблица 3).
Стоит отметить, что одновременно из одного и того же образца фарша было выделено несколько различных видов изолятов рода Listeria (таблица 4).
Согласно данным, отраженным в таблице 4, установлено, что 27 культур относятся к виду Listeria monocytogenes, в то время как все оставшиеся 48 изолятов относятся к другим видам, не контролируемым по Техническому регламенту Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и другим регулирующим стандартам. В частности: Listeria innocua -37, Listeria welshimeri - 5, Listeria ivanovii - 4, Listeria seeligeri - 2 изолята.
В таблице 5 представлены данные о частоте выделения штаммов листерий из исследуемого материала мясных полуфабрикатов.
В первой опытной серии наблюдается снижение количества выделяемых L. monocytogenes на 28,57 % по сравнению с контрольной, в то время как во второй и третьей опытных сериях наблюдается практически полная элиминация возбудителя по сравнению с контрольными (85,71 % и 100 % соответственно). Результаты, приведенные
7
Таблица 2
Оценка чувствительности листерий к видовому бактериофагу
№ Вид микроорганизмов, изоляты согласно данным Maldi-ToF Бактериофаг
BF-1379 BF-1426
1. Listeria monocytogenes 3154 LT7100 ++++ ++++
2. Listeria welshimeri 3115 LT2213 ++++ ++++
3. Listeria monocytogenes 3164 LT7100 ++++ ++++
4. Listeria welshimeri 3119 LT2213 ++++ +++
5. Listeria monocytogenes 3169 LT70FF ++++ ++++
6. Listeria innocua 3174 LT70E6 +++ ++++
7. Listeria monocytogenes 3176 LT70FE ++++ ++++
8. Listeria welshimeri 3178 LT2213 ++++ +++
9. Listeria innocua 3285 LT70E7 ++++ ++++
10. Listeria ivanovii 3284 LT2201 +++ ++++
11. Listeria monocytogenes 3288 LT70FF ++++ ++++
12. Listeria monocytogenes 3295 LT70FF ++++ ++++
13. Listeria monocytogenes 3296 LT70FD ++++ ++++
14. Listeria innocua 3519 LT70E2 +++ ++++
15. Listeria monocytogenes 3517 LT70FF ++++ +++
16. Listeria monocytogenes 3518 LT70FF ++ ++
17. Listeria innocua 3187 LT70E1 +++ +++
18. Listeria monocytogenes 3188 LT70FF ++++ ++++
19. Listeria monocytogenes 3189 LT7100 ++++ ++++
20. Listeria monocytogenes 3196 LT7100 ++++ ++++
21. Listeria innocua 3199 LT70E1 +++ +++
22. Listeria monocytogenes 3201 LT70FE ++++ ++++
23. Listeria welshimeri 3202 LT7111 +++ +++
24. Listeria monocytogenes 3204 LT70FF ++++ ++++
25. Listeria innocua 3209 LT70E7 +++ ++++
26. Listeria monocytogenes 3216 LT70FF ++++ +++
27. Listeria welshimeri 3213 LT7111 +++ +++
28. Listeria innocua 3221 LT70E7 +++ ++++
29. Listeria innocua 3304 LT70E2 ++++ ++++
30. Listeria innocua 3310 LT70E6 ++++ ++++
31. Listeria innocua 3521 LT70E1 +++ ++++
32. Listeria innocua 3526 LT70E2 +++ +++
33. Listeria monocytogenes 3524 LT70FD ++++ ++++
34. Listeria monocytogenes 3131 LT70FE ++++ ++++
35. Listeria innocua 3107 LT70E1 +++ ++++
36. Listeria monocytogenes 3108 LT7100 ++++ +++
37. Listeria innocua 3136 LT2199 +++ ++++
38. Listeria innocua 3139 LT70E1 +++ +++
39. Listeria monocytogenes 3140 LT2205 ++++ ++++
40. Listeria innocua 3265 LT70E2 +++ ++++
41. Listeria monocytogenes 3152 LT7100 ++++ ++++
42. Listeria innocua 3267 LT70E1 +++ +++
43. Listeria seeligeri 3268 LT7108 +++ +++
44. Listeria monocytogenes 3277 LT2205 ++++ ++++
8
45. Listeria innocua 3511 LT70E1 +++ ++++
46. Listeria ivanovii 3513 LT2201 +++ ++++
47. Listeria monocytogenes 3512 LT7100 ++++ +++
48. Listeria monocytogenes 3516 LT70FF ++++ ++++
Примечание: «-» - отсутствие литической активности; «+» - низкая активность; «++» - зона лизиса с большим количеством колоний вторичного роста; «+++» - зона лизиса с единичными колониями вторичного роста, «++++» - прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста
Таблица 3
Частота высевов штаммов листерий в опытных и контрольных сериях ОПИ 1
День эксперимента Вид микроорганизмов
Группа Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanovii Listeria seeligeri Listeria welshimeri
1. + - - - -
2. - - - - +
3. + - - - -
4. + - - - +
5. - + - - -
6. + - - - -
Контроль 1 7. - - - - +
8. - - - - -
9. - - - - -
10. - + + - -
11. + - - - -
12. + - - - -
13. + + - - -
1. + - - - -
2. - - - - -
3. - + - - -
4. - + - - -
5. + - - - -
6. - + - - -
Опыт 1 7. + - + - -
8. - + - - -
9. - + - - -
10. + + - - -
11. - - - - -
12. - + - - -
13. + + + - -
1. + + - - -
2. + - - - -
3. + - - - -
4. + + - - +
Контроль 2 5. + + - - -
6. - + - - -
7. + - - - +
8. - + - - -
9. - + - - -
9
10. - + - - -
Контроль 2 11. - - - - -
12. - + - - -
13. + + - - -
1. - - - - -
2. - + - - -
3. - - - - -
4. - - - - -
5. - - - - -
6. - - - - -
Опыт 2 7. - - - - -
8. - - - - -
9. + + - - -
10. - - - - -
11. - - - - -
12. - - - - -
13. - - - - -
1. + - - - -
2. + + - - -
3. - + - - -
4. - + - - -
5. + - - - -
6. - - - - -
Контроль 3 7. + + - - -
8. - + - + -
9. - - - - -
10. + - - - -
11. + + + - -
12. - - - - -
13. + - - - -
1. - + - - -
2. - - - - -
3. - + - - -
4. - + - - -
5. - - - - -
6. - - - - -
Опыт 3 7. - + - - -
8. - + - - -
9. - + - - -
10. - - - - -
11. - + - + -
12. - + - - -
13. - + - - -
Примечание. «+» - высеваемость микроорганизма из образцов свиного фарша; «-» - отсутствие микроорганизма в образцах свиного фарша.
10
Таблица 4
Видовой состав штаммов листерий, полученных из образцов мясного фарша ОПИ1
Вид микроорганизма Количество % в структуре
Listeria innocua 37 49,33
Listeria monocytogenes 27 36,00
Listeria welshimeri 5 6,67
Listeria ivanovii 4 5,33
Listeria seeligeri 2 2,67
в таблице 5, свидетельствуют о частичной эффективности применяемого листериозного коктейля бактериофагов для предотвращения контаминации свиного фарша патогенными бактериями.
Исходя из полученных данных было выдвинуто предположение об отсроченном действии средства на основе бактериофагов, связанном с природой взаимодействия фаг - бактерия-мишень. Бактериофаги обладают способностью к саморепликации на бактерии-мишени с их последующим лизисом и инфицированием соседних клеток возбудителя. Поэтому элиминация патогенных микроорганизмов из мясного фарша и с поверхности оборудования происходит спустя некоторое время после непосредственной обработки ТВС, что отличает их действие от стандартных применяемых химических средств, для которых свойственно одномоментное воздействие на патоген исключительно в зоне контакта с дезинфектантом.
Также после проведения микробиологического исследования (таблица 5) выявлено, что при обработке композицией литических бактериофагов BF-1379 и BF-1426 инцидентность выделения штаммов листерий (L. innocua, L. welshimeri, L. ivanovii, L. seeligeri) не снижается должным образом, как у L. monocytogenes. Частичная эрадикация может быть ассоциирована с недостаточным количеством фаговых частиц по отношению к количеству бактерий. Для решения проблемы достижения абсолют-
ной эрадикации штаммов листерий в ОПИ 2 было скорректировано MOI (множественность инфицирования) ТВС на единицу продукции (В рамках данных ОПИ определение колониеобра-зующих единиц (КОЕ/г) патогенных листерий, выделенных из готовых образцов свиного фарша, не подразумевалось, выявлялась инцидентность микроорганизма).
Результаты второго опытно-промышленного испытания
Ввод ТВС в мясную продукцию был осуществлен теми же методами, что в ОПИ 1 (таблица 1), однако во время данного эксперимента не обрабатывалось технологическое оборудование и была увеличена доза ТВС (1 мл/кг фарша). На микробиологическое исследование было направлено 52 готовых образца свиного фарша для ежедневного микробиологического контроля в течение 13 дней.
Результаты высевов листерий из образцов фарша представлены в таблице 6.
В опытных сериях свиного фарша к 13 дню не были обнаружены листерии.
Таким образом, путем экспериментального подбора оптимального количества бактериофагов BF-1379 и BF-1426 на единицу контамини-рованной листериями мясной продукции была достигнута элиминация патогенных штаммов из свиного фарша и доказана абсолютная эффективность индивидуализированного состава ТВС для данного мясоперерабатывающего предприятия.
Таблица 5
Высев листерий в опытных и контрольных группах ОПИ 1
Видовая принадлежность листерий Опыт 1 Контроль 1 Опыт 2 Контроль 2 Опыт 3 Контроль 3
Listeria monocytogenes 5 7 1 7 0 7
Listeria innocua 8 3 2 9 9 6
Listeria welshimeri 0 3 0 2 0 0
Listeria ivanovii 2 1 0 0 0 1
Listeria seeligeri 0 0 0 0 1 1
11
Таблица 6
Частота высевов штаммов листерий в опытных и контрольных сериях ОПИ 2
День эксперимента Вид микроорганизмов
Группа Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanovii Listeria seeligeri Listeria welshimeri
1. - - - - -
2. + - - - -
3. + - - - -
4. - + - - -
5. + - - - -
6. - - - - -
Контроль 7. - - - - -
8. + - + - -
9. + - - - -
10. + - - - -
11. - - - + -
12. - - - - -
13. + - - - -
1. - - - - -
2. - - - - -
3. - - - - -
4. - - - - -
5. - - - - -
6. - + - - -
Опыт 1 7. - - - - -
8. - + - - -
9. - + - - -
10. - - - - -
11. - - - - -
12. - - - - -
13. - - - - -
1. + - - - -
2. - - - - -
3. - - - - -
4. - - - - -
5. - - - - -
6. - + - - -
Опыт 2 7. - - - - -
8. - - - - -
9. - - - - -
10. - - - - -
11. - - - - -
12. - - - - -
13. - - - - -
1. - - - - -
Опыт 3 2. - - - - -
3. - - - - -
4. - + - - -
12
5. - - - - -
6. - - - - -
7. - + - - -
8. - + - - -
Опыт 3 9. - - - - -
10. - - - - -
11. - - - - -
12. - - - - -
13. - - - - -
Заключение
Недостаточная противомикробная обработка мясных полуфабрикатов может стать причиной распространения опасных зоонозных инфекций с риском развития тяжелого течения заболевания и, как следствие, неблагоприятным исходом. Одним из таких эпидемиологически значимых заболеваний является листери-оз, вспышки которого связаны с потреблением контаминированной мясной продукции. Циркулирующие на мясоперерабатывающих предприятиях Listeria monocytogenes в ряде случаев способны к образованию биопленок на поверхностях технологического оборудования, вследствие чего возникает устойчивость к физическим и химическим методам дезинфекции. Поэтому разработка ТВС на основе листериоз-ных бактериофагов для использования в процессе переработки мясных полуфабрикатов является актуальной задачей.
В результате проведенной работы был определен фаговый состав ТВС и оптимальное соотношение объема используемого средства к единице пищевой продукции: 1 мл коктейля бактериофагов в титре 109 БОЕ/мл на 1 кг мясных полуфабрикатов. Такое соотношение обеспечивает эрадикацию патогенных штаммов листерий L. monocytogenes из образцов мясного фарша определенного перерабатывающего предприятия.
Таким образом, испытуемое технологическое вспомогательное средство на основе листериозных бактериофагов с учетом индивидуального штаммового состава может рекомендоваться в качестве основного про-тиволистериозного агента для селективной деконтаминации пищевой продукции на перерабатывающих предприятиях.
Список литературы
1. Алешкин А. В. Опыт деконтаминации пищевых полуфабрикатов с помощью бактериофагов / А. В. Алешкин, Ю. В. Ларина, Н. В. Воложанцев [и др.] // Вопросы диетологии. 2015. Т. 5. № 1. С. 24-30.
2. Березняк О. В. Лабораторные исследования по выявлению листерии в пищевой продукции / О. В. Березняк, Е. О. Рысцова // Бюллетень науки и практики. 2019. Т. 5. № 5. С. 192-199.
3. Ермолаева С. А. Распространение антимикробной устойчивости среди клинических и пищевых изолятов Listeria monocytogenes, выделенных в Москве в 2019-2021 гг. / С. А. Ермолаева, Т. И. Карпова, П. А. Андриянов [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2022. Т. 24. № 2. С. 156-164.
4. Зайко Е. В. Распространенность и устойчивость к антибиотикам патогенных микроорганизмов, выделенных из мяса различных видов животных / Е. В. Зайко, А. А. Панченко, Д. М. Сатабаева, Д. С. Багаева // Все о мясе. 2019. № 3. С. 42-45.
5. Кузнецова Н. М. Антибиотики и консерванты, используемые в мясоперерабатывающей промышленности / Н. М. Кузнецова, А. А. Валишев // Известия СПбГАУ 2017. Т. 4. № 49. С. 93-97.
6. Латыпова 3. A. XapawrepncTHKaListeriaMonocytogenes, выделенных из мяса разных видов животных / 3. А. Латыпова, Л. С. Аубекерова, Ш. Т. Сарбаканова [и др.] // Микробиология жэне вирусология. 2022. Т. 1. № 36. С. 113-123.
7. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике: федеральные клинические рекомендации. М., 2014. 40 с.
8. Щербинин А. В. Листерии в продукции мясоперерабатывающих предприятий / А. В. Щербинин, С. В. Мезенцев, О. С. Спиркина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014. Т. 8. № 118. С. 101-104.
9. Byun K. H. Efficacy of disinfectant and bacteriophage mixture against planktonic and biofilm state of Listeria monocytogenes to control in the food industry / K. H. Byun, S. H. Han, M. W. Choi [ et al.] // International Journal of Food Microbiology. 2024. 413:110587. DOI: 10.1016/j. ijfoodmicro.2024.110587. PMID: 38301541.
10. Matereke L. T. Listeria monocytogenes Virulence, Antimicrobial Resistance and Environmental Persistence: A Review / L. T. Matereke, A. I. Okoh // Pathogens. 2020. 9(7):528.
11. Peccio A. Listeria monocytogenes occurrence and characterization in meat-producing plants. / A. Peccio, T. Autio, H. Korkeala [et al.] // Letters in Applied Microbiology. 2003. 37 (3): 234-238. DOI: 10.1046/j.1472-765x.2003.01384.x. PMID: 12904225.
13
