CC BY
41
ПРИМЕНЕНИЕ СМЕСЕЙ MOHO-И ОЛИГОЭПОКСИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОТЕЗОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА
Ю.А. Кудрявцева, И.Ю. Журавлева, Л.А. Опарина*, М.Я. Хилько*, Б.А.Трофимов*,
Л.С. Барбараш
ГУ «Научно-производственная проблемная лаборатория реконструктивной хирургии сердца и сосудов
с клиникой СО РАМН», Кемерово * Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, Иркутск
Цель исследования - оценка эффективности применения новых препаратов из класса эпоксисоеди-нений в качестве консерванта биологических протезов клапанов сердца. В эксперименте были использованы створки аортальных клапанов свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этилен-гликоля (ДЭЭ) и смесями различных эпоксисоединений - СМ1, СМ2 и СМ3. Комплексная оценка свойств биоматериала показала, что смеси моно- и олигоэпоксидов являются эффективными консервантами биологических протезов клапанов сердца. Изучение кальций-связывающей активности в эксперименте показало, что ксеностворки, обработанные всеми исследуемыми консервантами, устойчивы к накоплению кальция. В сравнении с индивидуальным ДЭЭ, биоматериал, консервированный эпоксидными препаратами, более активно связывает гепарин, что должно позитивно сказаться на антитромбогенных свойствах биологических протезов. Дальнейшее совершенствование способов консервации биологических протезов клапанов сердца на основе эпоксидных смесей СМ1, СМ2 и СМ3 является перспективным направлением.
Использование эпоксидных соединений для консервации биоматериала позволяет получить кардиоваскулярные ксенопротезы с высокой биосовместимостью, достаточно высокой прочностью и антитромбогенными свойствами [1-4, 11]. Эпоксисоединения представлены широким спектром препаратов, как моно-, так и полимерных. В России с этой целью успешно применяют диглицидиловый эфир этиленгликоля [1, 3, 5, 11]. Основным преимуществом консервации биологического материала эпоксидами является высокая резистентность биопротезов к кальцификации [1, 4, 12]. Этот феномен обусловлен структурой химических связей, образуемых эпоксигруппами с коллагеновой матрицей [1]. В то же время различия молекулярной структуры эпоксисоединений, широко варьирующей в пределах химического класса эпокси-дов, оказывают несомненное влияние на консервирующие свойства каждого конкретного представителя данного класса.
Большое внимание в последние годы уделяется возможности применения полиэпоксидных препаратов, так как данные соединения более перспективны в плане дополнительной модификации биоматериала за счет высокого содержания эпоксигрупп в разветвленной кар-боновой цепи полиэпоксидов [6, 7, 11, 13, 14]. Поэтому поиск новых оригинальных эпоксидных соединений для консервации биоматериалов является актуальной задачей. В настоящем исследовании представлены результаты комп-
лексной оценки биосовместимости и сшивающей активности новых комплексных эпоксидных препаратов в сравнении с применяемыми в практике ДЭЭ и глутаровым альдегидом (ГА).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В эксперименте были использованы створки аортальных клапанов свиньи, применяемые при изготовлении биологических протезов клапанов сердца. Для консервации биоматериала применяли глутаровый альдегид («Reanal», Венгрия), диглицидиловый эфир этиленгликоля (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН) [4] и оригинальные эпоксидные препараты СМ1, СМ2 и СМ3, представляющие собой смеси ДЭЭ, В2 и В4 (рис. 1) в различных соотношениях [6]. Препараты В2 и В4 синтезированы в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН по разработанному новому общему принципу синтеза эпоксидных смол нового поколения [8-10, 15]. Для комплексной оценки качества консервации биоматериала были использованы: аминокислотный анализ, физико-механические исследования и гистологическое изучение структуры биоматериала.
Для выполнения аминокислотного анализа в качестве контрольных служили образцы соответствующих нативных тканей. Образцы отмывали в 0,5 л дистиллированной воды при постоянном помешивании в течение 1 ч с 3-кратной
Рис. 1. Химическая структура эпоксисоединений: а - диглицидиловый эфир этиленгликоля; б - В2 - Ди-1-[2-(глицидилокси)этокси]этиловый эфир диэтиленгликоля; в - В4 - 1,2,3,4,6-Пента-0-{1-[2-(глицидилок-си)этокси] этил}-а-й-глюкопираноза.
сменой воды, после чего лиофильно высушивали. Гидролиз высушенных образцов проводили в 6 N соляной кислоте в запаянных ампулах при 110 °С в течение 24 ч. После упаривания соляной кислоты сухой остаток растворяли в литий-цитратном буфере, центрифугировали и использовали супернатант для аминокислотного анализа.
Определение проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе «НйасИу-835» (Япония). Для каждой аминокислоты осуществлен расчет относительного содержания ее остатков, приходящихся на 1000 аминокислотных остатков белков исследованного образца.
Физико-механические испытания проведены в условиях продольного растяжения однотипно подготовленных образцов. Образцы в виде «лопаток» со стандартной длиной Ь вырезали из биоматериала с помощью специального ножа, согласно ГОСТ 11262-80. Эксперименты выполнены на разрывной машине «1пэ1гоп 5582» (Англия). По результатам испытаний расчитывали следующие показатели: И - средняя толщина образца (мм), э - разрушающее напряжение при растяжении (МПа) и Е - относительное удлинение (%).
Структуру биоматериала исследовали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилин-эозином. Приготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Гистологические препараты исследовали при помощи микроскопа МИКМЕД-2 («Л0М0», Санкт-Петербург).
Кальций-связывающую активность исследовали in vivo, путем подкожной имплантации образцов биоматериала крысам линии Vistar на 60 суток. По окончании эксперимента удаленные образцы отмывали в 0,9% растворе натрия хлорида, после чего высушивали до постоянной массы. Гидролиз образцов проводили на песочной бане в растворе 50% хлорной кислоты. Количество кальция определяли на атомно-адсор-бционном спектрофотометре («Perkin Elmer, 5100», USA) и расчитывали на 1 мг сухой ткани.
Количество иммобилизованного гепарина определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности раствора о-толу-идинового синего после взаимодействия с образцами. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре UV/Vis Ultraspec Plus (LKB-Pharmacia).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы MS Excel. Расчитывали значение средней арифметической величины (М) и стандартной ошибки (±m). Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что основой для образования ин-тра- и интермолекулярных поперечных связей при консервации биоматериала ГА и ДЭЭ служат аминогруппы лизина и оксилизина и именно эти связи отвечают за структурную стабильность обработанной ткани. Установлено, что суммарное количество остатков лизина и гид-роксилизина в ксеноаортальных створках, консервированных исследуемыми эпоксидными препаратами, в 2,0-2,5 раза меньше, чем в образцах, обработанных ГА (р<0,01).
Ранее проведенные исследования показали, что эпоксидные препараты, помимо лизина и гидроксилизина, взаимодействуют также с гистидином, тирозином и метионином [2, 6, 7]. Результаты аминокислотного анализа подтвердили эту характерную зависимость и в отношении новых препаратов - СМ1, СМ2 и СМ3 (табл. 1). Таким образом, применение эпоксидных смесей позволяет добиться очень высокой суммарной плотности поперечных связей в коллагене имплантата.
Внутри ряда исследуемых эпоксисоедине-ний отмечены различия в сшивающей активности. Так, эпоксисмеси СМ1, СМ2 и СМ3, по сравнению с ДЭЭ (р<0,05), более активно реагировали с метионином, но менее активно с тирозином. В отношении оксилизина сшивающая активность также различалась - минимальное количество остатков этой аминокислоты отмечено при применении ДЭЭ и СМ2, несколько выше у СМ1 и почти в 2 раза выше при консервации СМ3 (р<0,01).
Установленное различие сшивающей активности эпоксидных препаратов обусловлено различием химических компонентов, входящих в каждый препарат, а также стереохимической конфигурацией реакционных групп компонентов по отношению к реакционным группам колла-геновой матрицы. Кроме того, в состав изучаемых эпоксидных смесей в различных соотношениях входили эпоксиды с различной длиной углеродной цепи, как с линейной, так и разветвленной структурой, что, в свою очередь, также влияет на их сшивающую активность. Суммарное количество остатков аминокислот при использовании эпоксидных консервантов в
2 раза ниже, чем при применении ГА, отмеченное различие среди исследуемых эпоксисме-сей не имеет статистической достоверности (р>0,05).
При гистологическом исследовании установлено, что все образцы имели однотипное строение - деление на слои сохранено, колла-геновые волокна расположены компактно в фиброзной слое и более рыхло в спонгиозном, сохранена их характерная извитость. Эндоте-лиальный слой практически отсутствует, фиброциты единичные, мелкие, с вытянутыми нор-мохромными ядрами (рис. 2, а-г). Следует отметить, что в образцах, обработанных изучаемыми смесями, структура биоматериала более компактна. На срезах створок, обработанных ДЭЭ, заметны участки с так называемым «стромальным отеком» (рис. 2, а), при использовании СМ1 и СМ2 таких участков значительно меньше (рис. 2, б, в). В образцах, консервированных СМ3, такие структуры полностью отсутствуют. При этом в фиброзном слое отмечено явление «полимеризации» - образование щелевидных пространств между сшитыми волокнами коллагена, причем максимальный эффект наблюдали у СМЗ-консервированных образцов (рис. 2, г). Вероятно, это обусловлено наибольшим содержанием в составе соединения с разветвленной структурой, обеспечивающей более плотную сшивку коллагена.
Этот феномен согласуется с результатами физико-механических испытаний. Показатели прочности створок, обработанных СМ3, были выше, чем в других группах образцов (р<0,05) (рис. 3). Прочность образцов, консервированных ГА, ДЭЭ, СМ1 и СМ2, практически не различалась (р>0,05). Показатели эластичности всех групп эпоксиобработанных образцов превосходили эластичность ГА-консервированных (р<0,05), при этом между собой эти группы достоверно не различались (р>0,05) (рис. 4).
Низкая эластичность образцов, консервированных ГА, обусловлена, по-видимому, тем, что глутаровый альдегид формирует ригидные гидрофобные связи, которые существенно снижают пластические свойства биоматериала [11]. Напротив, эпоксидные связи обладают значительной гидрофильностью, формируя в биоматериале структуры, подобные гидрогелю [3, 12, 13]. Благодаря этому, эпоксиобработанный биоматериал сохраняет естественные пластические свойства, близкие к нативному биоматериалу, и приобретает высокую резистентность к кальцификации [1, 2, 4, 12].
Полученные результаты свидетельствуют, что эпоксидные смеси СМ1, СМ2 и СМ3 придают биоматериалу высокую резистентность к кальцификации (табл. 2). Так, содержание кальция в створках, консервированных исследуемыми препаратами и имплантированных крысам на 60 суток, незначительно превышало уровень кальция в контрольных неимплантиро-ванных образцах. В образцах, обработанных ГА, по истечении 60 суток с момента имплантации количество кальция в 80 раз превышало его содержание в эпоксиобработанных образцах.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что эпоксидные пре-
параты СМ1, СМ2 и СМ3 при использовании их в качестве консерванта биоматериала обеспечивают высокую сшивающую активность, что в итоге определяет удовлетворительную структуру коллагена, улучшенные физико-механические характеристики и значительную устойчивость к кальцификации в эксперименте.
Однако для успешного функционирования биопротеза клапана сердца в организме реципиента, помимо структурной стабильности биоматериала, большое значение имеют его тромбо-резистентные свойства. Как было установлено ранее, консервация ДЭЭ придает биоматериалу высокие био- и гемосовместимые свойства [1, 2, 4]. Наличие свободных эпоксигрупп, не
Таблица 1
Относительное содержание аминокислот в створках ксенобиопротезов клапанов сердца,
консервированных различными способами
Аминокислота Натив ГА дээ CM1 CM2 CM3
THR 24,1±0,8 23,9±0,4 22,6±1,3 23,6±0,2 23,2±1,4 25,6±1,0
SER 34,8±0,7 39,4±1,2 31,3±0,5 34,2±0,4 34,2±1,6 38,3±1,5
GLU 84,4±0,8 85,5±0,7 58,8±1,8 66,5±1,7 62,2±4,6 62,2±2,43
PRO 107,4±6,5 116,9±0,4 102,4±1,6 104,3±0,3 101,9±2,5 102,5±09
OH-PRO 71,4±2,5 89,9±1,5 88,2±1,8 79,6±2,3 78,3±5,8 79,8±2,7
GLY 319,1±2,1 287,8±13,1 380,8±3,5 370,2±7,8 360,5±3,7 359,6±3,1
ALA 101,2±6,4 105,8±0,7 93,2±0,2 90,8±0,5 92,8±2,5 95,1±1,6
VAL 34,5±1,7 35,9±0,9 27,0±1,3 27,1±1,5 35,7±1,4 31,7±0,3
MET 6,7±0,2 4,57±0,4 5,2±0,3 3,1±0,3 3,7±0,2 3,6±0,9
ILE 15,5±0,2 17,4±0,1 14,3±0,5 14,8±0,2 15,8±0,6 17,4±0,7
LEU 41,7±0,3 43,7±0,7 39,9±1,3 41,7±0,2 43,9±1,1 47,0±1,2
TYR 8,8±0,2 6,9±0,2 2,5±0,1 3,7±0,2 5,3±0,5 5,7±0,2
PHE 18,8±0,7 21,4±0,1 17,7±0,1 19,3±0,4 19,8±0,3 17,9±1,3
HIS 8,4±0,2 6,2±0,07 0,6±0,1 1,1±0,3 1,3±0,2 0,6±0,02
OH-LYS 9,5±0,2 1,7±0,03 0,4±0,04 0,9±0,3 0,4±0,04 1,2±0,2
LYS 33,5±1,2 3,8±0,2 2,3±0,5 2,2±0,2 1,9±0,2 1,8±0,1
ASP 60,6±0,9 50,4±0,4 56,2±0,7 58,9±1,1 52,6±1,3 54,6±1,7
ARG 47,8±0,7 48,4±0,2 39,8±0,7 44,5±0,6 40,7±0,9 44,8±0,8
Таблица 2
Содержание кальция в биоматериале, обработанного различными консервантами
Кальций, мкг/г сух. ткани Консервант
ГА дээ CM1 CM2 CM3
до имплантации 0,48±0,11 0,57±0,09 0,54±0,12 0,59±0,08 0,55±0,10
После имплантации 121,85±15,7 1,40±0,18 1,53±0,32 1,48±0,22 1,54±0,30
пз о.
Консервант ■ ГА □ ДЭЭ ПСМ1 ПСМ2 ПСМ3
Рис. 3. Разрушающее напряжение (МРа).
Консервант ИГА ПДЭЭ ПСМ1 ПСМ2 0СМ3
Рис. 4. Относительное удлинение (Е, %).
Рис. 2. Гистологический препарат ксеностворки, консервированной: а - ДЭЭ; б - СМ1; в - СМ2; г - СМ3. Окраска гематоксилином-эозином, увеличение х 100.
Консервант ■ ДЭЭ ЩСМ1 ЩСМ2 ЩСМ3
Рис. 5. Количество иммобилизованного гепарина.
вступивших в реакцию с коллагеном в процессе консервации, предопределяет возможность дополнительной модификации биоматериала биологически активными веществами.
Для повышения антитромбогенных свойств биологических протезов широко используется гепарин. Молекулы гепарина содержат набор различных функциональных групп, способных участвовать в реакциях химических превращений, но при выборе метода иммобилизации необходимо учитывать различную степень ответственности этих групп за антикоагулянтную активность. Поскольку активность гепарина обеспечивают сульфо- и в меньшей степени
карбоксильные группы, в процессе иммобилизации следует использовать гидроксильные и аминогруппы [1].
При оценке ковалентно иммобилизованного гепарина было установлено, что биоматериал, обработанный эпоксидными смесями, связывает гепарин более активно, чем консервированный индивидуальным ДЭЭ (рис. 5). Связывающая активность ткани после обработки препаратами СМ1, СМ2 и СМ3 в 1,5-1,6 раза превышает активность ДЭЭ-консервированной (р<0,01) и составляет 580-615 мкг гепарина на мг сухой ткани. Эти результаты еще раз подтверждают предположение о том, что смеси, содержащие в своем составе, помимо мономерного эпоксида, соединения с несколькими эпок-сигруппами, способны обеспечить более эффективное связывание антикоагулянта.
ВЫВОДЫ
Исследуемые эпоксисмеси СМ1, СМ2 и СМ3 обладают высокой сшивающей активностью, обеспечивая удовлетворительные физико-механические свойства биоматериала и высокую резистентность к кальцификации. Всем образцам ксеностворок, обработанных эпоксидными препаратами, присущи общие свойства, связанные с химической структурой консервантов и образуемых ими поперечных связей в коллагене: в процесс сшивки вовлекаются лизин, ок-силизин, гистидин, метионин и тирозин. Кроме того, важным преимуществом исследуемых эпоксисмесей в сравнении с индивидуальным ДЭЭ, является активное связывание гепарина, что должно позитивно сказаться на тромборез-ристентных свойствах биологических протезов.
Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые эпоксисмеси, также как и ДЭЭ, являются эффективными консервантами биологических протезов клапанов сердца. Весьма перспективно дальнейшее совершенствование способов консервации биологических протезов клапанов сердца на основе эпоксидных препаратов СМ1, СМ2 и СМ3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. БарбарашЛ.С., Барбараш H.A., Журавлева И.Ю. Биопротезы клапанов сердца: проблемы и перспективы. Кемерово, 1995. 399 с.
2. Барбараш Л.С., Журавлева И.Ю., Борисов В.В. и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. № 2. С. 42-49.
3. Барбараш Л.С., Криковцов A.C., Журавлева И.Ю. Биологические протезы артерий. Кемерово, 1996. 207 с.
4. Барбараш Л.С., Новикова С.П., Журавлева И.Ю. и др. Способ консервирования биоткани для протезирования клапанов сердца и сосудов: Патент 2008767РФ, опубл. Б.И. 1994. № 5.
5. Журавлева И.Ю., Кузнецов П.В., Гантимуро-ва И.Л., Барбараш Л.С. //Биосовместимость. 1994. Т. 2. № 1. С. 13-22.
6. Журавлева И.Ю., Барбараш Л.С. и др. Способ обработки биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии: Патент 2122321 РФ, опубл. 27.11.99, Бюл. № 33.
7. Кудрявцева Ю.А. Новые подходы к созданию тромборезистентного биоматериала для сердечно-сосудистой хирургии: Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 1997. 21 с.
8. Станкевич В.К., Белозеров Л.Е., Кухарев Б.Ф., Трофимов Б.А. // Наука производству. 2004. № 1. С. 19-20.
9. Трофимов Б.А., Недоля H.A., Хилько М.Я. и др. Способ получения полиглицидиловых эфиров многоатомных спиртов. Авт. св-во № 892887 СССР. 1981.
10. Трофимов Б.А. и др. Способ получения эпок-сипроизводных углеводов. Авт. св-во № 1074881 СССР (1983). Б.И. 1984. № 7.
11. БарбарашЛ.С.,Журавлева И.Ю.,Лучанкин А.А., Криковцов А.С. //Ангиология и сосудистая хирургия. 1996. № 2. С. 86-92.
12. Imamura E., Savatani O., Koyanagi H. et al. // J. Card. Surg. 1989. V. 4. № 1. P. 50-57.
13. Lee J.M., Pereira C.A., Kan W.K. // J. Biomed. Mater. Res. 1994. V. 28. P. 981-992.
14. Shen S.N., Sung H.W., Tu R. et al. // J. Appl. Biomater. 1994. Summer 5 (2). P. 159-162.
15. Trofimov B.A., Nedolya N.A. // Reviews heteroatom Chemistry. 1993. V 9. P. 205-229.
16. Tu R. et al. //Int.J.Art.Org.1993. V.16. P. 141-145.
