CC BY
403
бислое либо значительной дисперсией экспериментальных показателей и малым объемом выборки, либо другими причинами, требующими дополнительного изучения.
Выводы. 1. Анемия беременных вызывает увеличение процентного содержания лизофосфатидов, снижает содержание фосфатидилинозитолов и, возможно, компенсаторно увеличивает содержание холестерина и фос-фатидилинозитолов.
2. Степень влияния анемии на снижение содержания общих фосфолипидов составляет 11,1%, а на отношение ОФЛ/ХС - 23,9%.
3. Выявленные изменения не приводят к достоверным изменениям физико-химических свойств мембран и деформируемости эритроцитов, что может свидетельствовать о сбалансированности этих изменений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акоев В.Р., Бобровский Р.В., Жадан Г.Г. и др. Биологические мем-
браны. 1991; 8(1): 78-84.
2. БунакВ.В. Сов. педагогика. 1965; 11: 105-19.
3. Введение в биомембранологию. Учебное пособие. Под ред. А.А.
Болдырева. М.: Изд-во МГУ, 1990.
4. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., КарманскийИ.М. Биохимия. 1980;
45(4): 622-8.
5. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток,
мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989.
6. Егуткин Г.Г., Житкович А.В. Биологические науки. 1990; 8: 30-7.
7. Иванова С.В. Вестник ВГМУ 2008; 7(3): 17-23.
8. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975; 76; 138-40; 310-1.
9. Козловский В.И., Атрощенко Е.С., Петухов И.В. Фильтрационные методы исследования деформируемости эритроцитов: Метод. рекомендации. Витебск, 1996.
10. КолбВ.Г., КамышниковВ.С. Справочник по клинической химии. Минск: "Беларусь", 1982.
11. Локтюшкин А.В. Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2009.
12. Окунь И.М., Калер Г.В., Волковец Т.М. и др. Биохимия. 1986; 51(7): 1132-40.
13. Самойленко Г.Г., Калер Г.В., Конев С.В. Биофизика. 1999; 44(3): 455-60.
14. Anju Grewal. J. Anaesth. 2010; 54(5): 380-6.
15. Dodje J.T., Mitchell C., Hanahah D.J. et al. Arch. Biochem. 1963; 100(1): 119-30.
16. Oliveira S., Saldanha C. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2010; 44(1): 63-74.
17. Simpson R.J., Florida-James G.D., Whyte G.P. et al. Eur. J. Appl. Physiol. 2007; 99(2): 201-4.
18. SvanborgA., Svennercholm L. Acta Med. Scand. 1961; 169: 43-6.
19. Vaskovsky V.E., KostetskyE.J., Vassenolin J.M. J. Chromatogr. 1975; 114: 129-41.
Поступила 20.10.11
цитология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-076.5:008
Н.Н. Волченко, Е.Н. Славнова, А.А. Тугулукова
применение различных вариантов жидкостных технологий в цитологии
ФГБУ московский научно-исследовательский онкологический институт им. п.А. Герцена министерства здравоохранения РФ, москва
Проведено сравнительное исследование традиционных мазков и трех различным жидкостных технологий приготовления цитологических препаратов (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) на материале, полученном от 112 больных с патологическими процессами различным локализаций - выпотные жидкости (31), мягких тканей (22), лимфатических узлов (18), молочный: желез (20), слюнных желез (7), легких (9), щитовидной железы (5). Установлено, что при совместном применении жидкостной и традиционной цитологии эффективность цитологического исследования повышается на 3,3-5% (в зависимости от локализации патологического очага). Использование жидкостных технологий расширяет возможности применения иммуноцитохимии и молекулярной генетики на цитологическом материале.
Ключевые слова: жидкостная цитология, E-Prep, Cytospin3, BD TriPath, иммуноцитохимическое исследование
N.N. Voltchenko, Ye.N. Slavnova, A.A. Tugulukova
THE APPLICATION OF DIFFERENT TYPES OF LIQUID TECHNOLOGIES IN CYTOLOGY The P.A. Herzen Moscow research oncologic institute of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia
The article discusses the results of comparative study of traditional smears and three different liquid technologies of making ready of cytological preparations (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) using material from 112 patients with pathological processes of such different localizations as exudative liquids (31), soft tissues (22), lymphatic nodes (18), mammal glands (20), saliva glands (7), lungs (9), thyroid gland (5). It is established that under joint application of liquid and traditional cytology the effectiveness of cytological analysis increases up to 3.3%-5% depending on localization of pathologic nidus. The implementation of liquid technologies expands the possibilities of applying immunocitochemistry and molecular genetics to cytological materials.
Key words: liquid cytology, CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath, immunocitochemical assay
Жидкостные технологии успешно применяются в клинической цитологии и занимают важное место наряду с традиционным методом, дополняя его и улучшая качество цитологической диагностики. Жидкостную технологию для приготовления гинекологических мазков впервые стали использовать в 1996 г. в США для гинекологического скрининга (Thin Prep), а в 1999 г. введена система SurePath (Becton Dickinson). Метод жидкостной цитологии хорошо себя зарекомендовал и успешно используется за рубежом не только в гинекологическом скрининге, но и в диагностике опухолей. Жидкостные монослойные цитологические препараты получают путем переноса клеточного материала из фиксирующего раствора на стекло с использованием методов центрифугирования, осаждения иили фильтрации. Жидкостная цитология постоянно совершенствуется, появляются новые, полностью автоматизированные системы приготовления препаратов, изменяется состав фиксирующих растворов, обеспечивающих сохранность клеточного материала [5, 7, 16]. Использование жидкостной цитологии позволяет усовершенствовать преаналитический этап цитологического исследования - длительно хранить, транспортировать клеточный материал из отдаленных лабораторий в централизованные, создавать архив и получать тонкослойные цитологические препараты со стандартной областью просмотра. Применение фиксирующих растворов позволяет сохранить клеточную суспензию для дальнейших контрольных и повторных исследований, в том числе для иммуноцитохимии и молекулярно-генетических методов [1, 3, 9, 10, 14]. Качественные стандартизованные цитологические препараты улучшают аналитический этап цитологического исследования, ускоряя и облегчая работу цитолога [2, 3]. В ряде работ проведено сравнение жидкостных цитологических препаратов с традиционными мазками для негинекологических локализаций и показано улучшение качества цитологической диагностики за счет снижения числа неинформативного материала, более чистого фона и лучшей визуализации клеточного материала. В то же время при использовании различных жидкостных техник и способов обработки материала возникают трудности, связанные с правильной трактовкой цитологической картины, так как она существенно отличается от традиционных цитограмм. По мнению одних авторов, жидкостные цитологические препараты можно анализировать самостоятельно, по мнению других - только совместно с традиционным мазком, так как в жидкостных препаратах отсутствует часть диагностически важных признаков [4, 8, 12, 13-15, 17]. Цитоморфологические особенности и трудности, с которыми может столкнуться цитолог в оценке жидкостных препаратов, для одних локализаций описаны мало, для других вовсе не описаны. Однако знание этих особенностей необходимо, так как тонкослойные цитологические препараты могут успешно применяться для проведения уточняющей диагностики,
Для корреспонденции:
Волченко Надежда Николаевна, д-р мед. наук, проф., рук. отд-ния онкоцитологии
Адрес: 125284, Москва, 2-й Боткинский пр., 3 Телефон: (495) 945-43-92 E-mail: [email protected]
Таблица 1
Сравнение трех жидкостных технологий приготовления препаратов
Cytospin 3, Thermo Scientific Shandon
E-Prep - процессор, Han Bi Medical Co., Ltd
BD Prep Stain™ Slide Processor
Цитоцентрифугирование
Простота и удобство в работе
Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, фон более чистый по сравнению с традиционным мазком
Быстрота (5 мин - 12 препаратов)
Разные методы цитологической окраски (Романовский, Папаниколау)
Вариабельный размер окошка
Возможность проведения иммуноцитохимии
Использование сжатого воздуха и мембраны
Простота и удобство в работе
Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, чистый фон
Быстрота (23 с - 2 препарата)
Клеточное обогащение на градиенте плотности, центрифугирование
Длительный период предподготовки
Равномерное, тонкослойное распределение материала на стекле, чистый фон
За 45 мин делается 48 мазков, за 8-часовой рабочий день можно сделать 288 мазков
Окраска только по Папаниколау
Разные методы цитологической окраски (Романовский, Папа-николау)
Размер окошка 20 мм Размер окошка 13 мм
Возможно проведение иммуноцитохимии
Возможно проведение иммуноцитохимии
поскольку повышают эффективность цитологического исследования [1, 2, 4, 8-10, 12-14, 15, 17].
Цель настоящего исследования - определить возможности применения для цитологической диагностики различные жидкостные технологии (Cytospin3, E-Prep Processor, BD TriPath).
Материалы и методы. Исследовали материал от 112 больных с патологическими процессами различных локализаций: 31 - выпотные жидкости, 22 - мягких тканей, 18 - лимфатических узлов, 20 - молочных желез, 7 - слюнных желез, 9 - легких, 5 - щитовидной железы. Препараты готовились параллельно традиционным способом и методом жидкостной цитологии (часть материала помещалась в "среду накопления" для приготовления мазков с помощью цитоцентрифуги Cytospin3 (Thermo Scientific Shandon), а часть помещалась в фиксирующие растворы для аппарата Е-Prep и системы BD CytoRich). Традиционные и жидкостные микропрепараты окрашивали по Романовскому и Папаниколау. Иммуноцитохимическое исследование проводилось с использованием системы визуализации Ultra Vision LP (Thermo Scientific, Великобритания) и антител к BerEp4, CK7, CK19, CK20, ER,PR, HER2, vimentin, calcitonin, CA125, WT1, HBME1, CEA, p63, TG, ТПО. Использовали первичные антитела производства Dako (Дания) и Novocastra (Великобритания). Флюоресцентное иммуноцитохимическое исследование проводилось с антителами BerEp4 FITC (Dako, Дания).
В нашей работе мы применяли три жидкостные технологии: Cytospin, E-Prep Processor, BD TriPath (табл. 1).
Результаты и обсуждение. Наше исследование показало, несмотря на то, что все аппараты для жидкостной цитологии используют разные физические принципы работы (цитоцентрифугирование, двойная мембранная фильтрация и преципитация, клеточное обогащение на градиенте плотности и центрифугирование), они обладают общими достоинствами, отличающими их от тра-
Таблица 2
Сравнение морфологических характеристик клеток в жидкостных препаратах и традиционных мазках
Критерии
Традиционный препарат
Cytospin 3
E-Prep
BD, TriPath
Фон
Плоский эпителий
Железистый эпителий
Структурный компонент
Эпителиально-
стромальное
соотношение
Имеется
Характерные морфологические признаки
Характерные морфологические признаки
Характерные морфологические признаки
Характерное
Имеется
Характерные морфологические признаки
Клетки имеют более округлую форму. Сохранность цитоплазмы и ядерных признаков
Структуры частично разбиты, больше клеток расположено разрозненно, в сравнении с традиционным препаратом
Клетки равномерно распределены в стромальном веществе
Чистый, большая часть фоновых элементов удалена
Характерные морфологические признаки
Более вытянутая форма клеток, в отдельных - более округлая. Легкий лизис части клеток. Сглаженный рисунок хроматина в ядре
Структуры более рыхлые, уплощенные, разбиты на более мелкие, много клеток расположено разрозненно
Снижено количество и вид стромального вещества отсутствует. Изменено расположение стромального компонента по отношению к эпителиальному
Чистый, большая часть фоновых элементов удалена
Уменьшение размера клеток
Более вытянутая форма клеток, частью - округлая. Клетки уменьшены в размере. Хорошо представлены детали ядра
Трехмерные структуры, уменьшены в размере. Клетки и структуры расположены в разных плоскостях
Снижено количество и вид стромального вещества/ отсутствует. Изменено расположение стромального компонента по отношению к эпителиальному
Таблица 3
Сравнение эффективности цитологических исследований - жидкостных и традиционных мазков (в %)
Локализация процесса Жидкостной + традиционный Традиционный
Эффектив- Точность Ошибки Неудачный Эффектив- Точность Ошибки Неудачный
ность материал ность материал
Жидкости 96,8 100 - 3,2 96,8 100 - 3,2
Лимфатические узлы 93,6 96,8 3,2 3,2 90,3 96,8 3,2 6,5
Молочная железа 90 95 5 5 85 95 5 10
Мягкие ткани 71 95 5 24 71 95 5 24
диционных цитологических мазков. Применение метода жидкостной цитологии при цитологическом и иммуноци-тохимическом исследованиях показало ряд преимуществ перед рутинным способом приготовления цитопрепара-тов: получение стандартных препаратов высокого качества, возможность получения монослоя клеток, высокая сохранность клеточных структур, уменьшение фона, что позволяет избежать "загрязнения" опухолевых клеток элементами крови и воспаления, облегчая просмотр цитологических препаратов, монослойные препараты хорошего качества позволяют использовать современные компьютерные технологии обработки изображений, проведения морфометрии, иммуноморфологические исследования, клетки сосредоточены в одном месте "окошечке", что практически в 6-8 раз уменьшает расход дорогостоящих реактивов, что особенно важно при иммуноцитохимиче-ских и молекулярно-биологических исследованиях, сокращается время просмотра мазка, нет опасности пересыхания препарата (при окраске по Папаниколау).
В то же время, каждая из жидкостных методик имеет свои особенности, достоинства и недостатки (табл. 1, 2), что показано на ряде конкретных примеров совместного применения традиционного и жидкостных цитологических методик исследования клеточного материала.
При исследовании 31 экссудата из брюшной полости специфический характер экссудатов с наличием комплексов клеток аденогенного рака установлен при использовании всех жидкостных технологий (рис. 1). Наибольшее
сходство в строении клеток и клеточных структур отмечается в традиционных (рис. 1, а) и Cytospin-препаратах (рис. 1, б), а небольшой остаточный фон в виде эритроцитов не влиял на результат цитологической диагностики. В препаратах E-Prep (рис. 1, в) отмечалась фрагментация клеточных структур на более мелкие, большая часть клеток расположена разрозненно, клетки слегка лизированы, в сравнении с традиционными, цитоспиновыми и BD - препаратами (рис. 1, г). Одной из особенностей BD-препаратов является нахождение клеточных элементов и структур в разных плоскостях, в отличие от традиционных, Cytospin- и E-Prep препаратов. В BD-препаратах клетки меньше по размеру, но лучше представлены детали ядра и цитоплазмы, хорошо визуализируются ядрышки за счет окраски по Папаниколау. В E-Prep препаратах отмечается лизис части клеток, могут появляться "голые" ядра разрушенных клеток, что особенно хорошо видно в случае исследования специфической плевральной жидкости, с наличием клеток аденогенного рака, особенно при проведении флюоресцентного иммуноцитохимиче-ского исследования с эпителиальным маркером BerEp4 FITC. Эффективность традиционного цитологического исследования жидкостей из серозных полостей составила 96,8%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования составила также 96,8% (табл. 3).
Традиционную и жидкостную технологию применяли при исследовании 18 лимфатических узлов. Особен-
Рис. 1. Асцитическая жидкость, рак яичников. Специфический экссудат с наличием комплексов аденогенного рака. а - традиционный препарат, окраска по Романовскому (Ув. 400); б - препарат Cytospin, окраска по Романовскому (ув. 400); в - препарат Е-Ргер, окраска по Романовскому (ув. 400); г - препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 400).
но интересны три случая цитологическои диагностики. В одном случае на основании рутинного цитологического анализа установлен диагноз: метастаз аденогенного рака без признаков органоспецифичности в подмышечный лимфатический узел. Для уточнения источника ме-тастазирования потребовалось проведение иммуноцито-
химического исследования. В Cytospin-препаратах имелись лишь единичные клетки опухоли среди большого числа форменных элементов крови, иммуноцитохими-ческую реакцию по таким препаратам оценить не представлялось возможным. В препаратах, приготовленных с помощью Е-Ргер, клетки хорошо сконцентрированы,
а • - ц
• * •• • « • . * * * I » в . г Я/ 0 1 р*)' ■■
Рис. 2. Метастаз папиллярного рака щитовидной железы в лимфатический узел.
а - препарат Е-Ргер, окраска по Романовскому (ув. 200); б - Cytospin, окраска по Романовскому (ув. 200); в - Е-Ргер иммуноцитохимия, положительная экспрессия тиреоглобулина (ув. 200); г - Cytospin, иммуноцитохимия, положительная экспрессия тиреоглобулина (ув. 200).
чистый фон, что сделало возможным проведение имму-ноцитохимического исследования. Экспрессия антител к цитокератинам 7, рецепторам эстрогенов, прогестерона позволила установить метастаз рака молочной железы в подмышечный лимфатический узел.
Во втором случае исследовали метастаз высокодиффе-
ренцированного аденогенного рака в лимфатический узел шеи. По препарату Е-Ргер можно сделать заключение о наличии клеток аденогенного рака, но нельзя говорить о метастазе в лимфатический узел, так как лимфоидные элементы отсутствовали, что определяется спецификой приготовления жидкостных препаратов с помощью Е-Ргер-
Рис. 3. Пунктат бронхопульмонального лимфатического узла.
а - традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 200); б - Е-Ргер-препарат, остались лишь макрофаги. Окраска по Романовскому (ув. 200).
процессора (рис. 2, а). При исследовании лимфатических узлов с помощью Е-Ргер процессора, в большей части наблюдений, лимфоциты не попадали в жидкостной препарат. Параллельный анализ традиционного и жидкостного препаратов облегчает морфологическую диагностику, благодаря присутствию лимфоидных элементов в традиционном препарате (рис. 2, б) и чистому фону в жидкостном Е-Ргер препарате. Концентрация патологических клеток в жидкостном препарате позволяет удачно провести имму-ноцитохимическое исследование. Иммуноцитохимическое исследование в препаратах Е-Ргер (рис. 2, в) и Cytospin (рис. 2, г) с антителами к тиреоглобулину показало положительную экспрессию в клетках метастаза папиллярного рака щитовидной железы. Но в Cytospin-препаратах наличие фона в виде большого числа лимфоидных элементов затрудняло оценку иммуноцитохимической реакции.
Традиционным цитологическим методом и с помощью Е-Ргер процессора исследовали пунктат бронхопульмонального лимфатического узла (рис. 3) с выраженным антракозом и синус-гистиоцитозом. В Е-Ргер (рис. 3, а) препаратах отсутствовали лимфоидные элементы и присутствовали только макрофаги, клеточность ниже в сравнении с традиционными препаратами (рис. 3, б). При исследовании лимфатических узлов в ВБ-препаратах и Cytospin препаратах лимфоидные элементы сохраняются.
Эффективность традиционного цитологического исследования лимфатических узлов составила 90,3%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования - 93,6% (табл. 3).
Исследован клеточный материал, полученный от 20 больных с патологией молочных желез. Наиболее наглядными были два случая совместного исследования молочных желез. В одном случае при исследовании пунктата молочной железы наличие выраженного воспалительно-некротического фона затрудняло проведение иммуно-
цитохимического исследования на традиционных и Су-tospin препаратах. В препаратах Е-Ргер отмечался чистый фон, позволяющий рассмотреть клетки, однако клетки опухоли слегка лизированы, имели вытянутую форму. В традиционном препарате клеточные элементы почти полностью разрушены, присутствовали лишь "голые" ядра. Наибольшая сохранность цитоплазмы и ядер опухолевых клеток отмечалась в Сytospin-препаратах, но воспалительно-некротический фон сохранен.
Во втором случае при исследовании ВБ препаратов возникли затруднения в дифференциальной диагностике фиброаденомы и высокодифференцированного протоко-вого рака молочной железы. По традиционному препарату поставлен диагноз высокодифференцированного протокового рака молочной железы, что соответствовало гистологическому заключению (рис. 4, а). В жидкостных ВБ препаратах разрозненно лежащие клетки рака уменьшены в размере, имеют вытянутую форму и ошибочно приняты за стромальный компонент фиброаденомы (рис. 4, б). Следует отметить, что в традиционной цитологии одним из важных диагностических критериев является оценка клеточности новообразования, в жидкостных препаратах оценить клеточность невозможно. Эффективность традиционного цитологического исследования молочных желез составила 85%, эффективность совместного применения жидкостных методик и традиционного исследования - 90% (см. табл. 3).
Совместное исследование традиционных и жидкостных цитологических мазков проводилось в 7 случаях опухолей слюнных желез. Рутинные цитологические препараты, в большинстве случаев, делали постановку диагноза более легкой, благодаря максимальной сохран-
Продолжение см. на стр. 37
Рис. 4. Высокодифференцированный протоковый рак молочной железы.
а - традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 200); б - ВБ-препарат, окраска по Папаниколау (ув. 200).
Рис. 5. Высокодифференцированная аденокарцинома легкого, бронхиолоальвеолярный рак. а - традиционный препарат, окраска по Романовскому (ув. 400); б - препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 400).
ности клеточных элементов и стромального вещества. В одном наблюдении плеоморфной аденомы в полученном материале преобладало мезенхимальное вещество и клеточные элементы просматривались с трудом.
В препаратах, приготовленных в аппарате Е-Ргер, отмечался более чистый фон за счет уменьшения стромаль-ного компонента, клетки располагались разрозненно, вне стромального вещества, хорошо просматривались
Рис. 6. Медуллярный рак щитовидной железы.
а - препарат ВБ, окраска по Папаниколау (ув. 200); б - Сytospin, окраска по Романовскому (ув. 200); в - препарат ВБ, положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли (ув. 200); г - Сytospin, положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли (ув. 200).
клеточные структуры. Вместе с тем, в другом исследовании опухоли слюнной железы в жидкостном препарате миксоидный фон почти полностью отсутствовал, что затрудняло постановку диагноза плеоморфной аденомы без традиционного мазка.
Совместное исследование традиционных и жидкост-
опухолей легкого. При исследовании материала из опухоли легкого, возникли трудности в установлении степени дифференцировки плоскоклеточного рака по жидкостным мазкам. В традиционном препарате морфологическая картина соответствовала малодифференцирован-ному плоскоклеточному раку и совпадала с гистологи-
ных цитологических мазков проводилось в 9 случаях ческим заключением. В ВБ-препаратах, руководствуясь
критериями классической цитологии, цитологически поставлен диагноз умереннодифференцированного плоскоклеточного рака. При высокодифференцированной аденокарциноме легкого (бронхиолоальвеолярном раке) одним их важных классических критериев является расположение клеток в виде сосочкоподобных структур, что лучше представлено в жидкостных препаратах ВЬ (рис. 5, а) в сравнении с традиционными цитологическими мазками (рис. 5, б). С другой стороны, клетки бронхиального эпителия, помещенные в жидкость, округляются и структуры могут напоминать сосочки, что при отсутствии клеточного полиморфизма может стать причиной гипердиагностики бронхиолоальвеолярного рака.
Исследовали 5 опухолей щитовидной железы. В одном случае диагноз папиллярного рака щитовидной железы удалось поставить только по жидкостным Е-Ргер препаратам благодаря хорошей концентрации клеток опухоли, расположены в виде папиллярных структур. Традиционный препарат из-за большого числа форменных элементов крови оказался неинформативным. В другом случае в ВЬ-препаратах при медуллярном раке щитовидной железы клетки имеют более вытянутую форму (рис. 6, а), несколько сморщены и уменьшены в размере, по сравнению с Cytospin-препaрaтaми (рис. 6, б). Отмечалась положительная экспрессия кальцитонина в клетках опухоли как в ВЬ, Cytospin-препaрaтaх (рис. 6, в, г).
Исследование традиционным и жидкостным цитологическим методом 22 опухолей мягких тканей показало высокую эффективность их совместного применения 71% (см. табл. 3).
В нашем исследовании иммуноцитохимическое исследование проводилось параллельно на препаратах Cytospin, ВЬ и Е-Ргер в 18 случаях. Более яркая имму-ноцитохимическая экспрессия отмечалась на Cytospin-препаратах по сравнению с препаратами Е-Ргер. Для проведения иммуноцитохимии на ВЬ-препаратах необходима предподготовка. В 3-х случаях, из-за присутствия воспалительно-некротических масс при раке молочной железы и большого числа эритроцитов, лимфо-идных элементов при метастазе в лимфатический узел папиллярного рака щитовидной железы, исследование удалось провести только на препаратах Е-Ргер и ВЬ.
Выводы. 1. Применение жидкостных технологий имеет как преимущества, так и свои ограничения.
2. Все жидкостные препараты имели более чистый фон, тонкослойное, равномерное распределение материала на стекле, в сравнении с традиционными препаратами, что облегчало просмотр материала.
3. Применение жидкостной цитологии позволило повысить эффективность цитологической диагностики, проводить иммуноцитохимическое исследование, транспортировать и архивировать клеточный материал.
4. Морфология жидкостных препаратов отличается от классической цитоморфологии, так как различные способы приготовления тонкослойных препаратов, многочисленные этапы обработки материала и разный состав фиксаторов влияют на интенсивность фона, размер и особенности строения клеток и клеточных структур, эпителиально-стромальное соотношение, функциональные признаки в клетках. Так, изменение морфологии клеток затрудняет дифференциальную диагностику доброкачественного процесса от злокачественного, например, высокодифференцированного протокового рака молочной железы и фиброаденомы. Возникают трудности в оценке степени дифференцировки клеток при мало-дифференцированном плоскоклеточном раке.
5. Высокая или низкая клеточность - косвенный, но
важный признак, на который опирается цитолог в оценке характера опухолевого процесса и этот признак отсутствует в жидкостных мазках. Во всех жидкостных препаратах клетки сконцентрированы, что создает ложное впечатление о высокой клеточности. Если признаки атипии хорошо представлены в клетках, то диагноз можно поставить как во всех случаях жидкостных, так и традиционных препаратов и клеточность не имеет большого значения.
6. Значительное снижение или отсутствие фона, с одной стороны, позволяет лучше рассмотреть клетки, с другой стороны, лишает важной диагностической информации. Отсутствие лимфоидных элементов в жидкостных препаратах Е-Ргер не позволяет предположить о том, что материал получен из лимфатического узла в отсутствие традиционного препарата. Диагноз аутоиммунного ти-реоидита невозможен при отсутствии лимфоцитов в пун-ктате, а реактивные изменения фолликулярного эпителия, при отсутствии лимфоцитов, могут быть ошибочно приняты за клетки фолликулярного рака. Значительное снижение или отсутствие миксоидного фона делает трудной диагностику плеоморфной аденомы слюнной железы.
7. Морфология клеток в препаратах, приготовленных с помощью разных жидкостных техник, отличается между собой. Для трактовки цитологической картины необходимо знать, в какую среду взят материал и на каком приборе приготовлен. Так, морфология клеток в препаратах, полученных методом цитоцентрифугирова-ния с применением "среды накопления", максимально приближена к морфологии традиционных мазков, но сохраняется фон. В препаратах Е-Ргер, клетки и структуры уплощены, крупные скопления клеток фрагментирова-ны, много разрозненно расположенных клеток, в некоторых случаях отмечается легкий лизис железистого эпителия. В ВЬ-препаратах клетки слегка сморщены и уменьшены в размере, имеют более вытянутую форму, структуры имеют трехмерное расположение.
В выпотных жидкостях, когда клетки изначально находились в жидкой среде, отмечалось максимальное сходство морфологии жидкостной и традиционной цитологии. При исследовании соскобов с опухоли и тонкоигольных аспи-рационных биопсий, отличия жидкостных и традиционных препаратов были значительнее, в отдельных случаях отсутствовали важные диагностические критерии.
9. Все жидкостные технологии позволили провести иммуноцитохимическое исследование.
10. Благодаря чистому фону и более равномерному распределению клеток в препарате, реакции в препаратах Е-Ргер оценить оказалось легче. Реакции в Cytospin-препаратах проходили ярче, но остаточный фон и элементы крови, в некоторых случаях затрудняли оценку препарата.
11. Совместное применение жидкостной и традиционной цитологии позволяет повысить эффективность цитологической диагностики за счет снижения процента неудачно взятого материала. Точность исследования оставалась прежней на нашем материале.
12. Таким образом, все жидкостные технологии ^у-tospin, Е-Ргер, ТлРаШ ВЬ) могут успешно использоваться в диагностике опухолей молочной железы, щитовидной, слюнных желез, опухолей мягких тканей, вы-потных жидкостей, метастазов в лимфатические узлы в сочетании с классическим цитологическим методом.
13. Морфологические критерии препаратов жидкостной цитологии в литературе описаны недостаточно, поэтому пока не будет накоплен опыт обязательно параллельно с жидкостным должен анализироваться традиционный препарат.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Атлас цитологической и им-муноцитохимической диагностики опухолей. М.: Репроцентр М, 2010.
2. Назарова И.В., Родионова О.М., Волков М.В., Богатырев В.Н. Первый опыт использования аппарата Е PREP для жидкостной цитологии в России. Новости клинической цитологии России. 2012; 16(1-2): 3-5.
3. Шабалова И.П., Касоян К.Т., Савостикова М.В. Жидкостная цитология в клинической практике (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. М., 2011; 12: 25-35.
4. Al-Khafaji B.M., Afify A.M. Salivary gland fine needle aspiration using the ThinPrep technique: diagnostic accuracy, cytologic artifacts and pitfalls. Acta Cytologica. 2001; 45(4): 567-74.
5. Esquivias Lopes-Cuervo J., Montalban Beltran E., Cuadros Lopez J.L., Alonso Castillo A., Nieto Sanchez T. Preliminary Study of a New, Fully Automated System for Liquid-Based Cytology: The NovaPrep® Processor System. Acta Cytologica 2011; 55: 281-6.
6. Geers C., Bourgain C. Liquid-based FNAC of the thyroid: a 4-year survey with SurePath.Cancer Cytopathology. 2011; 119(1): 58-67.
7. Jae Soo Koh M.D., Cytology Evaluation of Cell prep LBC in Cytology specimens. The Korean Journal of Cytopathology. 2007; 18(1).
8. Jung C.K., Lee A., Jung E.S., Choi Y.J., Jung S.L/, Lee K.Y. Split sample comparison of a liquid-based method and conventional smears in thyroid fine needle aspiration. Acta Cytologyca. 2008; 52(3): 313-9.
9. Konofaos P., Kontzoglou K., Georgoulakis J. et al. The role ThinPrep cytology in the evaluation of estrogen and progesterone receptor content of breast tumors. Surg. Oncol. 2006; 15: 257-66.
10. Lukas Burendorf. Multiprobe fluorescence in situ Hybridization (UroVysion) for the detection of urothelial carcinoma - FISHing for the right catch. Acta Cytologica. 2011; 55: 113-9.
11. Malapelle U., de Rosa N., Rocco D., Bellevicine C., Crispino C., Illiano A. et al. EGFR and KRAS mutations detection on lung cancer liquid-based cytology: a pilot study. J. Clin. Pathol. 2011; 65(1): 87-91.
12. Michael C.W., McConnel J., Pecott J., AfifyA.M., Al-Khafaji B. Comparison of ThinPrep and TriPath PREP liquid-based preparations in nongynecologic spesimens: a pilot study. Diagnostic Cytopathology. 2001; 25(3): 177-84.
13. Rana S., HodaM.D. Non-gynecologic cytology on liquid-based preparations: a morphologic review of facts and artifacts. Diagnostic Cytopathology. 2007; 35: 621-34.
14. Rieko Nishimura, Kenjiro Aogi, Tamami Yamamoto, DaisukeTakabat-ake, Seiki Takashima, Norihiro Teramoto et al. Usefulness of liquid-based cytology in hormone receptor analysis of breast cancer spesim-ens. Virchows Arch. 2011; 458: 153-8.
15. Rossi E.D., Mule A., Russo R.M., Pierconti F., Fadda G. Application of liquid-based preparation to non-gynaecologic exfoliative cytology. Pathologica. 2008; 100(6): 461-5.
16. Seung-Myoung Son, Ji Hae Koo, Song-Yi Choi, Ho-Chang Lee, Yong-Moon Lee, Hyung Geun Song et al. Evaluation of urine cytology in urothelial carcinoma patients: a comparison of CellprepPlus® Liquid-Based Cytology and conventional smear. The Korean Journal of Pathology. 2012; 46: 68-74.
17. Yi-Bo Fan, Qing-Shan Wang, Lin Ye, Tian-Yu Wang, Guang-Ping Wu. Clinical application of the SurePath liquid-based Pap test in cytological screening of bronchial brushing for the diagnosis of lung cancer. Cyto-technology. 2010; 62: 53-9.
Поступила 07.02.13
микробиология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.835.12.083.134
Г.Ш. Исаева1, В.А. Алешкин2, Е.П. Селькова2, М.С. Герасимова3, П.И. Мороз3
двухфазная питательная среда Для сУБКУльтивировАния HELiCOBACTER PYLORi
1ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии Республики Татарстан" Казань; 2Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора; Республиканский клинический онкологический диспансер Минздрава Республики Татарстан, Казань
H. pylori - очень прихотливый микроорганизм, нуждающийся в создании комплекса условий, включающих определенную атмосферу, температуру культивирования и состав питательной среды. Рекомендована двухфазная среда для субкультивирования на чашках Петри диаметром 90 мм, состоящая из шоколадного агара с добавлением бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, субкультивирование, двухфазная питательная среда G.Sh. Isayeva, V.A. Aleshkin, Ye.P. Selkova, M.S. Gerasimova, P.I. Moroz
THE TWO-PHASE GROWTH MEDIUM FOR SUB-CULTURING OF HELICOBACTER PYLORI
A.Pylori is a very undemanding microorganism needing the in support of complex of conditions including particular atmosphere, temperature of culturing and composition of growth medium. The two-phase growth medium is recommended to sub-culturing in Petri dishes with diameter of 90 mm. The growth medium consists of chocolate agar with addition ofS^edler broth and enriched with 10% serum of cattle.
Key words: Helicobacter pylori, sub-culturing, two-phase growth medium Инфекция
Для корреспонденции:
Исаева Гузель Шавхатовна, канд. мед. наук, доц. каф. микробиологии
Адрес: 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 Телефон: (843) 236-06-52 E-mail: [email protected]
Helicobacter pylori - одна из самых распространенных в мире. Для диагностики хеликобактериоза разработано множество методов, одним из которых является бактериологическое исследование. Трудоемкость и сложность выделения H. pylori ограничивает применение этого метода в рутинной практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам. Мониторинг за
