CC BY
375
(Эквадор) - 59,1 г, к-2829 (Германия) - 58,8 г, к-2872 (США) - 57,3 г. К группе мелкосемянных относятся к-2059 (Чехословакия) - 22,9 г и K-2947,E-ser-362 (Канада) -28,0 г. К группе мелкосемянных относятся сортообразцьы с массой 1000 семян менее 40 г: к-1978 (Индия) - 23,3 г, к-2559 (Армения) - 28,3 г, к-1850 (Армения) - 28,5 г, к-1977 (Египет) - 26,3 г.
Коэффициент хозяйственной эффективности у сортообразцов высокопродуктивной группы составил в среднем за два года 39,2%, что на 5,2% выше, чем у низкопродуктивных. Это свидетельствует о том, что высокопродуктивные растения более эффективно используют пластические вещества на формирование хозяйственно ценной части урожая. Максимальную долю се ян в общей био ассе растения и ели образцы к-2059 (Чехословакия) - 45,7%, к-2947, E-ser-362 (Канада) -43,4%, к-2836,89ЬЯР-122 (Канада) - 41,6%, к-2794 (Эквадор) - 40,8%, к-2841, FVR-G (Канада) - 40,3%.
По продолжительности вегетационного периода (всходы-созревание) существенных различий ежду группами продуктивности обнаружено не было. Большинство сортообразцов коллекции чечевицы можно отнести к среднеспелы с продолжительностью вегетационного периода от 76 до 84 суток.
В ходе изучения межвидовых гибридов чечевицы были выявлены линии, превзошедшие стандартный сорт Рауза по отдельным хозяйственно ценным признакам. Так, в конкурсно сортоиспытании 2008 года по числу се ян с растения выделились 29/08 F7 (Образцов Чифлик 7х Lens orientalis.№1) - 26,3 шт. и 43/08 F7 (Образцов Чифлик 7х Lens orientalis.№1) - 29,4 шт. Высоким числом семян в
УДК 338.439:633.1:631.563(470.319)
бобе (1,76 шт.) характеризовался межвидовой гибрид 43/08 F7 (Образцов Чифлик 7 х Lens orientalis.№1). Длина стебля у стандартного сорта Рауза в контрольно питомнике составила 45,6 см. Среди межвидовых гибридов была выделена линия, превосходящая стандарт по это у показателю: 166/08 F7 (Раузах Lens orientalis №1) - 48,1см.
Таки образо , в ходе изучения коллекции и ежвидовых гибридов чечевицы выделился ряд образцов как по отдельны хозяйственно ценны признака , так и по их комплексу. Они могут быть использованы в дальнейше как ценный исходный атериал для селекционной работы с культурой.
Литература
1. А елин, А.В. Об из енении эле ентов структуры урожая у зерновых сортов гороха в результате селекции / А.В.Амелин // Селекция и семеноводство. - 1993. - №2. -С.9-14.
2. Варлахов, М.Д. Перспективы селекции чечевицы в условиях Нечерноземья / М.Д.Варлахов // Сборник статей научно- етодического координационного совещания. - Орел, 1996. - С.127-129.
3. Суворова, Г.Н. Характеристика межвидовых
гибридов чечевицы Lens culinaris х Lens orientalis / Г.Н.Суворова, А.В.Иконников, А.И.Рогожкина, Н.Е.Павловская, Н.Н.Корниенко, Н.А.Шипилова,
О.В.Уварова. // Повышение устойчивости производства сельскохозяйственных культур в современных условиях.
- Орел: ПФ «Картуш», 2008. - С.323-331.
Н.Е. Павловская, доктор биологических наук И.Н. Г агарина, кандидат сельскохозяйственных наук Е.Г. Прудникова, кандидат сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО Орел ГАУ
ПРИМЕНЕНИЕ ПИР - МЕТОДА ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ С ЕЛЬ СКОХОЗЯЙ С ТВЕННЫХ РА С ТЕНИЙ
В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межсортовые различия по всем образцам фасоли при использовании праймеров Bare. При анализе образцов пшеницы установлены межвидовые разичия по всем сортам пшеницы при использовании праймера Paw S6. Результаты изучения продуктов амплификации и полиморфизма могут быть использованы для идентификации и классификации указанных образцов методом ПЦР анализа.
Ключевые слова: ПЦР анализ, фасоль, пшеница,
амплификация, полиморфизм
Сопряженность генетических, етаболических и
орфогенетических систе в организ е в значительной ере предопределяет стратегию познания жизненных процессов и выбор ключевых объектов, ориентируя, прежде всего, на две категории биологических олекул -на олекулы белков и нуклеиновых кислот. Первые заним ают все сферы метаболизм а и морфогенеза, вторые - специализированы на хранение,
воспроизведение и передачу наследственной инфор ации на етаболиз и орфогенез, что, опять-таки, осуществляется через белки. Фер енты, являющиеся кофактора и етаболиз а и главны и 32
At application of Bare primers varietal differences of all bean species are defined as a result of polymeric chain reaction (PCR) analysis of bean species. Application of Paw S6 primer results in defining cross-species differences of all wheat sorts at wheat species analysis. The results being obtained from amplification and polymorphism products research can be used to identify and classify the mentioned species by the method of the PCR analysis.
Key words: polymeric chain reaction (PCR) analysis, bean, wheat, amplification, polymorphism
ингредиента и конституционной основы жизни, целико обеспечивают и работу олекул нуклеиновых кислот - реализацию их генетической инфор ации в метаболизм е и м орфогенезе [4].
Специфическое взаи одействие белков по принципу узнавания и и определенных участков в нуклеотидных последовательностях ДНК играет исключительно важную роль в генетической регуляции гено а путе непосредственного блокирования и деблокирования его отдельных областей и локусов или через соответствующие структурные переходы в хром осомах [6].
Принципы и методы маркирования генетических систем организма по ДНК основаны на использовании самого высокоспецифичного ингредиента клетки, стоящего на вершине иерархии систем генетической информации. В то же время следует иметь в виду, что ДНК с ее биологической специфичностью формируется при непосредственном участии большого числа ферментов и других белковых факторов, многие и. которых, кроме функциональной специфичности, наделены также видовой, сортовой и индивидуальной специфичностью. Можно себе представить, что ДНК с ее биологической и генетической специфичностью со.дается всей участвующей в репликации совокупностью множества белков. Последние ра.ными путями механи.ма биосинте.а несут в формирующиеся дочерние нити ДНК информацию наследственных свойств, присущих данному виду, сорту и т.д. Ведущую роль белковым системам придается не только в репликации ДНК, но и в эволюции генома. Стабильность геному и медленному ходу его эволюции придает полу консервативный матричный синтез [4, 6].
Белковые факторы репликации ДНК, возможно, являются основными агентами, доставляющими информацию на генетические сдвиги в онтогене.е и эволюции.
Главные по функциональному значению элементы генома представлены генами, кодирующими белки и все типы молекул РНК, участвующие в белковом синтезе. Суммарная длина их, выраженная числом пар нуклеотидов (п.н.), составляет у высших растений, как и у млекопитающих, всего лишь 3...5 % протяженности всего генома. Остальная часть его представлена разными служебными и вспомогательными нуклеотидными последовательностями: ДНК-интронами в структурах самих генов, промоторами в начале считывания, то есть транскрибирования генов РНК-полимера.ами, а также другими некодирующими межгенными участками, выполняющими регуляторные функции или имеющими интегрирующее .начение для отдельных хромосом или всего генома [7].
Некодирующая часть геномной ДНК, часто исполь.уемая в маркировании, в основном органи.ована в виде повторяющихся нуклеотидных
последовательностей (повторов). Они могут быть рассыпаны по гену или собраны в свя.анные между собой последовательности, обра.уя тандемные повторы, с ра.ным числом сцепленных друг с другом нуклеотидных пар [4, 6].
Повторяющиеся последовательности могут составлять у растений до 80% и более тотальной ДНК. Подавляющая часть тандемных повторов генома, однако, состоит из некодирующихся последовательностей ДНК. Из повторяющихся последовательностей состоят также прицентромерные участки ДНК хромосом [11].
Анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения (дескрипторы), нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодные для идентификации и ра.личения генотипов, регистрации сортов и маркирования хо.яйственно ценных генов и при.наков.
Совершенно иная ситуация во.никла с открытием полиморфи.ма длины растительных фрагментов ДНК, а также с ра.работкой методов полимера.ной цепной
реакции, анали.а маркеров случайным обра.ом амплифицированной полиморфной ДНК. Эти подходы по.воляют маркировать практически любой участок хромосомы и .атем путем анали.а последующих поколений установить их сопряженность с количественными и качественными при.наками. Более того, появилась во.можность быстро картировать гены, несущие определенные хо.яйственные при.наки, и .атем их клонировать и перемещать в другие геномы с целью улучшения существующих сортов гибридов. Все эти методы широко исполь.уются в генетике человека, но в последние годы их применяют в решении задач генетики и селекции растений [4].
Существенно ускоряет и упрощает .адачу выявления молекулярных маркеров исполь.ование методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Широкое применение нашли варианты амплификации ДНК с прои.вольными праймерами. С их помощью можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному [1, 3, 10].
ДНК анализ с применением праймеров Paw5 и Paw8 позволили различить рожь, пшеницу и пырей (2). Причем различия между сортами пшеницы не обнаружены. Это объясняется их бли.кородственным происхождением. Наряду с этим проводится анали. ДНК-маркера, специфичного для G- генома пшеницы [8].
Широко применяются ДНК маркеры в селекции картофеля, в частности исполь.уется ДНК-маркер гена устойчивости к раку картофеля [2,3]. С использованием ДНК-маркеров проводится оценка устойчивости корейских сортов сои к соевой нематоде [10].
В исследованиях В.В.Соболева (2004) с успехом применяется метод ПЦР для генетического маркирования ремонтантной малины.
исследованиями ряда авторов пока.ана во.можность исполь.ования ДНК-маркеров при анали.е встречаемости компонентов RAPD-спектров у изучаемых сортов пшеницы и ячменя, ра.личных мелкосеменных видов и подвидов просовидных культур [5].
Представительность стержневой коллекции фасоли (Phaseolus vulgaris) в генбанке CIAT (n = 23000) была испытана с исполь.ованием белковых и нескольких ДНК методов. Стержневую коллекцию фасоли перуанского происхождения сравнивали с обра.цами ре.ервной коллекции. При этом, по данным полиморфи.ма белков, в 100 образцах стержневой коллекции обнаружено 95,7 % разнообразия, идентифицированного по спектрам полиморфных белков 382 обра.цов ре.ервной коллекции. RAPD-анализ также подтвердил корректность формирования стержневой коллекции и. 90 обра.цов для фасоли перуанского происхождения .
Достижения в молекулярной биологии, в частности, ра.витие таких технологий, как полимера.ная цепная реакция (ПЦР) - амплификация ДНК, сиквенс ДНК -определение последовательности ДНК, современные методы анали.а и обработки данных .начительно повысили во.можности молекулярных технологий в скрининге и оценке генетического разнообразия [7].
В настоящее время существует много современных подходов (технологий) выявления полиморфи.ма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие: анализ полиморфизма длины рестриктных фрагментов ДНК; «целенаправленная» ПЦР; ДНК - сиквенс.
Метод ПЦР предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК - продуктов. Большое число родственных технологий построено на этом принципе. Полиморфи.м определяется как присутствие - отсутствие в
электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК, обусловленных ра.личиями
последовательностей ДНК в местах посадки праймеров. Подход методически относительно прост и может применяться для изучения разнообразия на
внутривидовом уровне, включая популяционные исследования. Только анализ ДНК, который напрямую характери.ует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодны для идентификации и ра.личения генотипов, регистрации сортов и маркирования хо.яйственно ценных генов и при.наков [2].
В связи с вышеизложенным, целью представленной работы является выявление полиморфи.ма обра.цов фасоли и пшеницы на различных праймерах. Изучали полиморфизм образцов фасоли и пшеницы. Для амплификации геномной ДНК исполь.овали праймеры: Bare, Paw S5, Paw S6, Paw S11, Paw S16, P21, P27, P54, P191, P196, P198, P200. Праймеры применяли в ра.личной комбинации попарно и по одному. В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межсортовые ра.личия при исполь.овании праймеров Bare. В результате ПЦР анализа образцов пшеницы установлены межвидовые ра.личия по всем сортам пшеницы при исполь.овании праймера Paw S6.
Материал и методы
С целью изучения полиморфизма в работе анализировались образцы фасоли (15 сортов) и пшеницы (13 сортов) и. коллекции ВиР, селекции Всероссийского научно-исследовательского института .ернобобовых и крупяных культур РАСХН (Орел) и Института
биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН (Москва), отличающиеся морфобиологическими и
биохимическими особенностями. Выделение ДНК проводили и. молодых листьев с помощью набора реагентов DIAtomTMTMA Prep 100.
Для амплификации геномной ДНК исполь.овали праймеры: Bare, Paw S5, Paw S6, Paw S11, Paw S16, P21, P27, P54, P191, P196, P198, P200. Праймеры применяли в различной комбинации попарно и по одному. ПЦР проводили в амплификаторе прои.водства «БиоКом» с помощью сухого набора реагентов для ПЦР
амплификации GenePak Universal. Амплификация включала 1 цикл продолжительностью 2 мин
денатурации при +94°С, 30 циклов (1мин денатурации цепей ДНК при +94°С, 40 с отжима праймеров с матрицей при +50°С, 100 с синтеза комплементарных цепей ДНК при +72°С) и завершающего синтеза в течение 7 мин при +72°С. Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1,5%-ном агаро.ном геле.
Результаты
В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межсортовые различия по всем образцам фасоли при использовании праймеров Bare.
Выявлено, что образцы фасоли имеют основные фрагменты, которые находятся в зоне работы маркера от 600 до 1000 п.н. Для большинства исследованных образцов характерно наличие фрагмента в зоне около 34
600 п.н. у трех образцов: Л 179, Шоколадница, К 15196 таких фрагментов нет (рисунок 1). Вторым характер ным моментом является наличие фрагмента в зоне около 450550 п.н. Во всех образцах имеются фрагменты около 150 н.п. Таким образом, методом Полимеразной цепной реакции установлены фрагменты продукта амплификации ДНК, соответствующие 600, 450 - 550 и 250 п.н., характерные для всех сортов фасоли, а в зоне от 100 до 550 п.н. обнаружены фрагменты ДНК, дающие возможность выявлять межсортовой полиморфизм по ДНК - маркерам.
1000 п.н. 900 п.н.. 800 п.н.
700 п.н. 500 п.н. 400 п.н.
Рисунок 1 - Продукты амплификации ДНК образцов фасоли с праймером Bare (1-Контроль, 2-Оран, 3-Рубин, 4-Л 543/84, 5-Ока, 6-Неруса, 7-Л 202, 8-Л 714, 9-Л179, 10-Шоколадница,
11-К 15038, 12- К 15077, 13-К 13627, 14-К 15196,
15-К 15127, 16-Бельская, 17- Маркер)
В результате ПЦР анализа образцов пшеницы установлены межвидовые ра.личия по всем сортам пшеницы при исполь.овании праймера Paw S6.
Выявлено, что сорта пшеницы имеют основные фрагменты, которые находятся в зоне работы маркера от 100 до 800 п.н. (рисунок 2).
1000 п.н. 900 п.н. 800 п.н. 700 п.н.
500 п.н. 400 п.н.
100 п.н.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Рисунок 2 - Продукты амплификации ДНК сортов пшеницы с праймером Paw S6 (1-Контроль, 2-Ритза, 3-Беседа, 4-Ботовская 1, 5- Сибирская нива, 6-Имени Рапопорта, 7-Белая, 8- Волжанка Елена, 9-Булава, 10-Московская 39, 11-Бешкиль 500, 12-Мироновская 808, 13-Крестьянка, 14-Труженица, 15-Маркер)
У всех сортов пшеницы имеются фрагменты около 500-700 п.н. Для большинства исследованных сортов пшеницы характерно наличие фрагмента в зоне 750 п.н.,
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
у четырех сортов: Сибирская нива, Имени Рапопорта, Бешкиль 500, Мироновская 808 таких фрагментов нет. Вторым характерным моментом является наличие фрагмента в зоне около 450-500 п.н. у сортов пшеницы Беседа, Сибирская нива, Имени Рапопорта, Белая, Мироновская 808, Труженица. Фрагмент в зоне около 250-400 п.н. только у сортов Рит.а, Беседа, Ботовская 1, Волжанка Елена, Мироновская 808, Московская 39. Таким обра.ом, методом Полимера.ной цепной реакции установлены фрагменты продукта амплификации ДНК, соответствующие 500-700, 200 п.н., характерные для всех сортов пшеницы, а в .оне 750, 250 - 450 п.н. обнаружены фрагменты ДНК, дающие во.можность выявлять межсортовой полиморфи.м по ДНК-маркерам.
При исполь.овании других праймеров не удалось обнаружить существенных ра.личий межу обра.цами фасоли и пшеницы.
Таким обра.ом, данные, полученные в ре.ультате
и.учения продуктов амплификации и полиморфи.ма, могут быть исполь.ованы для идентификации и классификации указанных образцов методом ПЦР
анализа.
Литература
1. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А.Коновалов // Генетика. - 2005. - Т. 41.
- № 4. - С.480-492.
2. Зайцев, В.С. ДНК-маркеры гена устойчивости к раку картофеля / В.С.Зайцев, Э.Е.Хавкин // Актуальные проблемы генетики. - М., 2003.- Т. 2.- С.127-128.
3. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений
/А.В. Конарев // Сельскохозяйственная биология. -1998. - № 5, с.36-42.
4. Конарев, А.В. Белки семян как маркеры / А.В. Конарев // Вестник семеноводства в СНГ. - 2000. -№ 2. - С.24-25.
5. Савельев, Н.и. Применение ДНК-маркеров для оценки генетического полиморфи.ма яблони / Н.И.Савельев, Д.Б.Дорохов; Рос. акад. с.-х. наук. -Мичуринск - Наукоград. - Изд-во ГНУ ВНИИГ и СПР им. И.В. Мичурина, 2004. - 111 с.
6. Со.инов, А.А. Генетические маркеры у растений / А.А.Созинов // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27, № 5. - С.15-23.
7. Стрельченко, П.П. Молекулярные маркеры в
и.учении генофонда растений / П.П.Стрельченко, Л.А.Малышев // Генетические ресурсы культурных растений: международная науч.-практ. конф.: тез. докл.
- СПб., 2001. - С.169-171.
8. Щербань, А.Б. Анализ ДНК-маркера, специфичного для G-генома пшеницы / А.Б.Щербань, Е.К. Хлесткина, Е.А. Салина // Генетика. - 2004. - Т. 40, № 3. - С .372-379.
9. Bonierable, M. Molecular genetic techniques in relation to sampling strategies and the development of core collections / M. Bonierable, S. Beebs, J.e.a. Tohme // Molecular genetic techniques for plant genetic resources: Report of an IPGRI Worhshop, october 1995. Rome, Italy, 1997. - P.98-102.
10. Poulsen, G.B. Oligonucleotide fingerprinting of resynthesized Brassica napus / G.B. Poulsen, G. Kahl, K. Wesing // Eupytica.-1993.-V.70,№ ^.-P.53-59.
11. Weising, K. Foreign genes in plants transfer, structure, expression, and applications / K. Welsing, J. Schell, G. Kahl // Ann Pev. Genet. Palo Alto, Galif, 1988. -V.22 - P.421-477.
УДК 635.656:631.55
A.B. Амелин, доктор сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО Орёл ГАУ И.В. Кондыков, кандидат сельскохозяйственных наук ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Е.И. Чекалин. И.И. Кузнецов, аспиранты ФГОУ ВПО Орёл ГАУ
КАЧЕСТВЕННЫЙ С ОСТАВ СЕМЯН ГОРОХА ПОЛЕВОГО И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ В ХОДЕ СЕЛЕКЦИИ НА
СЕМЕННУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ
В статье отражены результаты изучения продуктивности и качества семян сортообразцов гороха полевого, созданных за период 1920-2005 годов.
Ключевые слова: горох, селекция, ретроспективный анализ, семенная продуктивность, качество семян.
Сельскохозяйственное производство России испытывает острый дефицит растительного белка. В решении этой проблемы горох представляет большой интерес как высокоурожайная белковая и средоулучшающая культура. В ре.ультате ее научной селекции, которая в нашей стране началась более 100 лет назад, урожайность семян возросла в 4-5 раз, в основном, за счет укрупнения семян - в среднем в 3 раза. Но, при этом, устойчивость к вредителям и боле.ням,
The article shows the results of investigation of seed productivity and quality of field pea sort species being bred in 1920-2005.
Key words: field pea, selection, productivity, seed quality.
retrospective analysis, seed
экстремальным факторам среды снизились в 1,3-2 раза, а содержание белка в семенах на 2-3% [1,2,4], что негативно отразилось на площади посева культуры.
Большой интерес в свя.и с этим могут представлять пелюшки, более устойчивые к ряду биотических стрессоров по сравнению с сортами гороха посевного [3].
Последние достижения селекции культуры, в том числе и во ВНИИ ЗБК, подтверждают, что создание сортов пелюшек и активное внедрение их в
