Применение природных штаммов-деструкторов в процессах разложения химических поллютантов Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 579.222.2;579.87;579.66

ПРИМЕНЕНИЕ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ В ПРОЦЕССАХ РАЗЛОЖЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ПОЛЛЮТАНТОВ

©2013 Д.О. Егорова1, М.Г. Первова2

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь 2Институт органического синтеза им. И .Я. Постовского УрО РАН, г. Екатеринбург

Поступила 11.06.2013

В статье представлены результаты разложения коммерческих смесей полихлорированных бифенилов (ПХБ), особо опасных химических поллютантов, под действием природных аэробных бактериальных штаммов. Штаммы-деструкторы выделены из почвы, подвергнутой длительному химическому загрязнению, и принадлежат родам Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus. В результате их применения, уровень деструкции смеси ПХБ торговой марки «Делор 103» составил 78.6-98.3%, торговой марки «Совол» - 84.0-87.5%.

Ключевые слова. ПХБ, деструкция, ШюАососсий.

Загрязнение окружающей среды, чужеродными для природы токсичными соединениями - одна из актуальных проблем современности. Мировым сообществом осуществляется несколько международных программ, направленных на оценку количества накопленных токсикантов и уровня загрязненности различных территорий, а также на разработку методов утилизации поллютантов различных классов. Одним из результатов работы ЮНЕП стало принятие в 2001 г. Стокгольмской конвенции, согласно которой выделен перечень особо опасных химических загрязнителей (стойкие органические загрязнители - СОЗ), подлежащих выводу из производства и полному уничтожению [1].

Анализ литературы показал, что одним из перспективных способов разложения соединений группы СОЗ является биодеструкция с использованием штаммов аэробных бактерий [2]. Методы биодеструкции позволяют утилизировать химически стойкие вещества и являются менее затратными, чем химические и физические методы разложения соединений группы СОЗ.

Основную долю веществ, включенных в список СОЗ, составляют хлорированные ароматические соединения, в частности полихлорированные би-фенилы (ПХБ). Для ПХБ характерны: стойкость в окружающей среде, биоаккумуляция, устойчивость к деградации, острая и хроническая токсичность, трансграничный перенос на большие расстояния. Семейство полихлорированных бифенилов содержит 209 конгенеров, отличающихся по количеству и расположению в молекуле в качестве заместителей ионов хлора. Также одной из особенностей, затрудняющих утилизацию ПХБ, является то, что в промышленности выпускали смеси, содержащие 20-60 конгенеров, отличющихся по своей биодоступности [3].

Известны штаммы аэробных бактерий, способные окислять ПХБ, тем самым разрушая их моле-

Егорова Дарья Олеговна, к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail: daryao(a!rambler.ru; Первова Марина Геннадьевна, к.х.н., старший научный сотрудник, e-mail: pervova(o!ios.uran.ru

кулу [4,5]. В результате деятельности большинства штаммов-деструкторов разлагаются в основном низко- и среднехлорированные конгенеры ПХБ [4]. При этом, молекула хлорбифенила окисляется под действием бактериальных ферментов и разлагается на пентадиеновую и (хлор)бензойную кислоты. Пентадиеновая кислота используется микроорганизмами в реакциях основного обмена клетки, (хлор)бензойные кислоты служат субстратом для других групп штаммов-деструкторов.

Цель исследования - изучить эффективность применения биодеструкции с использованием природных аэробных бактериальных штаммов в процессах утилизации коммерческих смесей полихло-ривраонных бифенилов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали почву, отобранную вблизи захоронения химических отходов г. Калуш (Ивано-Франковская обл., Украина). Анализ показал, что в данном образце почвы присутствуют два основных загрязнителя - полихлорированные бифенилы и гексахлорбензол (соединения группы СОЗ). Анализ почвы на наличие загрязнителя проводили согласно «Методике выполнения измерений массовой концентрации полихлорбифенилов в воздухе рабочей зоны, промвыбросах, природных и сточных водах и почвах методом газожидкостной хроматографии» № 88-16358-25-2000. Концентрация ПХБ в данном образце почвы превышает ПДК в 8000 раз [6].

Общее количество гетеротрофных микроорганизмов в почве оценивали методом серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри с полноценной питательной средой ЬВ состава (мг/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, ЫаС1 -10, агар - 15; и подсчетом образовавшихся колоний. Подсчет производили по формуле

М=(а хЮп)/У, где М - количество колониеобра-зующих единиц в 1 мл; а - среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V -объем суспензии, взятый для посева, мл; 10п- коэффициент разведения.

Выделение аборигенных штаммов-деструкторов осуществляли как описано [7], используя метод накопительных культур и бифенил (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии. Культивирование штаммов осуществляли в жидкой минеральной среде с бифенилом, как описано [8].

Таксономическое положение изолированных штаммов-деструкторов определяли используя анализ последовательности reHalôS рРНК [8]. Амплификацию нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили, как описано ранее, с использованием бактериальных праймеров 27F и 1492R. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК определяли с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL ("Applied Biosystems", США).

Полученные нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программы CLUSTAL X 1.83. Поиск гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http ://www. eztaxon. org).

Активность аборигенных штаммов-

деструкторов в отношении коммерческих смесей ПХБ «Делор 103» и «Совол» изучали в эксперименте с «отмытыми» клетками, как описано [9]. Смеси ПХБ вносили до конечной концентрации 0.6 мг/мл. Эффективность деструкции оценивали в течение 8 сут.

Анализ промежуточных продуктов бактериальной деструкции ПХБ провыодили с использованием методов высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-10ADvp (""Shimad/u". Япония) с колонкой Lichrosorb RP-18 10U (250 х 4.6 мм) ("Alltech", США) и спектроскопии на приборе UV-Visible BioSpec-mini (""Shimad/u". Япония), как описано [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ образца почвы показал, что в ней присутствуют конгенеры ПХБ с разной степенью хлорирования молекулы (рис. 1).

По составу конгенеров можно предположить, что в данной почве присутствуют такие коммерческие смеси ПХБ как «Делор 103» (Словакия), «Трихлорбифенил» и «Совол» (СССР). Концентрация ПХБ составила 485 мг/кг сухой почвы.

Известно, что длительное загрязнение почвы токсическими веществами приводит к формированию уникальной микрофлоры, в которой присутствуют аэробные бактериальные штаммы, способные разлагать различные поллютанты [7].

Методом накопительного культивирования из исследуемой почвы были выделены 8 штаммов бактерий, использующих бифенил в качестве ростового субстрата (табл. 1).

Рис. 1. ГХ-МСД хроматограмма образца почвы (цветом обозначены номера конгенеров ПХБ по классификации ИЮПАК)

Таблица 1. Рост штаммов в минеральной среде с бифенилом, в качестве единственного источника углерода и энергии

Оптическая плотность культуры (ОПвоо), оп.

Штамм ед.

5 сут 8 сут 11 сут

MD1 0.116±0.001 0.921±0.003 1.426±0.003

MD2 0.185±0.002 1.449±0.002 1.587±0.002

MD3 0.008±0.001 0.009±0.001 0.007±0.001

MD4 0.074±0.002 0.091±0.002 0.090±0.001

MD5 0.086±0.002 0.095±0.002 0.096±0.002

MD6 0.082±0.002 0.089±0.003 0.090±0.001

MD7 0.009±0.001 0.008±0.001 0.006±0.001

MD8 0.095±0.003 0.388±0.004 1.129±0.002

Среди изолированных штаммов у пяти был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена 168 рРНК, на основании которого установлена их таксономическая принадлежность (табл. 2).

Таблица 2. Анализ нуклеотидной последовательности гена 168 рРНК изолированных штаммов

Штамм Размер фрагмента гена, н. Типовой штамм Номер в GenBank % сходства

Rhodococcus

MD1 631 wratislmùensis NCIMB 13082т Rhodococcus Z37138 99.8

MD2 630 wratisla\>iensis NCIMB 13082T Pseudomonas Z37138 99.8

MD6 820 xanthomarina KMM 1447T AB176954 97.9

MD7 165 Bacillus viet-namensis 15-1T Pseudomonas AB099708 100

MD8 705 rhizosphaerae IH5T AY152673 98.3

Таким образом, на основании молекулярно-генетических признаков штаммы MD1 и MD2 идентифицированы как Rhodococcus sp., штаммы MD6 и MD8 - как Pseudomonas sp., а штамм MD7 -как Bacillus sp. Для дальнейших исследований были отобраны штаммы Rhodococcus sp. MD1, Rhodococcus sp. MD2, Pseudomonas sp. MD8.

В «остром» эксперименте установлено, что штаммы Rhodococcus sp. MD1, Rhodococcus sp. MD2 и Pseudomonas sp. MD8 эффективно разлагают коммерческую смесь ПХБ «Делор 103» и «Со-вол» в концентрации, сопоставимой с уровнем загрязненности хлорбифенилами исследуемой почвы (табл. 3, 4).

Таблица 3. Разложение «Делора 103» изолированными штаммами-деструкторами

мов рода Rhodococcus - 89.5-98.3%. При разложении смеси «Совол» установлено, что штамм Pseudomonas sp. MD8 разлагает 87.5% смеси, тогда как штаммы Rhodococcus sp. MD1 и MD2 - 84.0% и 86.9% соответственно. По видимому, штамм Pseudomonas sp. MD8 проявляет большую активность к конгенерам ПХБ, содержащим более 4 заместителей в молекуле (в «Соволе» преобладают пента- и гексахлорированные бифенилы [2]), тогда как штаммы Rhodococcus sp. MD1 и MD2 эффективнее разлагают ди- три- и тетрахлорированные бифенилы.

Таблица 4. Разложение «Совола» изолированными штаммами-деструкторами

Время, сут Концентрация «Делор 103», мг/мл

MD1 MD2 MD8

0 1 5 8 0.6±0.01 0.026±0.001 0.021±0.002 0.007±0.002 0.6±0.01 0.17±0.01 0.16±0.01 0.05±0.01 0.6±0.01 0.112±0.002 0.107±0.003 0.100±0.002

Время, сут Концентрация «Совола», мг/мл

MD1 MD2 MD8

0 1 5 8 0.6±0.01 0.087±0.002 0.076±0.002 0.075±0.002 0.6±0.01 0.197±0.002 0.070±0.002 0.062±0.002 0.6±0.01 0.093±0.001 0.074±0.001 0.059±0.002

Анализ результатов показал, что уровень деструкции «Делора 103» штаммом Pseudomonas sp. MD8 составил 78.6%, а при использовании штам-

Анализ образующихся промежуточных соединений показал, что разложение конгенеров ПХБ происходит с разрывом молекулы и образованием хлор- и гидроксибензойных кислот (рис. 2).

7.5 10.0

Time (min)

Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов бактериальной деструкции коммерческих смесей ПХБ штаммами Rhodococcus sp. MD1, Rhodococcus sp. MD2, Pseudomonas sp. MD8: А - гидроксизамещенные бензойные кислоты, Б - хлорзамещенные бензойные кислоты

Известно, что гидроксибензойные кислоты являются основными метаболитами при разложении хлорированных бензойных кислот [9].

Полученные результаты позволяют предположить, что штаммы осуществляют разложение не только ПХБ, присутствующих в коммерческих смесях, но и хлорбензойные кислоты, образующиеся как основной продукт бактериальной деструкции ПХБ.

В результате использования природных аэробных бактериальных штаммов удалось достичь вы-

сокого уровня деструкции коммерческих смесей ПХБ торговых марок «Делор 103» и «Совол». Установлено, что штамм Pseudomonas sp. MD8 эффективнее разлагает смесь «Совол» - 87.5%, а штаммы Rhodococcus sp. MD1 и MD2 проявляют высокую деградативную активность к смеси «Делор 103» (уровень деструкции 89.5 - 98.3%).

Также применение данных штаммов позволяет осуществить разложение ПХБ без образования опасных промежуточных продуктов.

Работа поддержана Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» №01201256872, грантом РФФИ-Урал №11-04-96028-р^урал_а, междисциплинарным проектом УрОРАН №12-М-34-2036.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. URL: http://chm.pops.int

2. Васильева Г.К., Стрнжакова Е.Р. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными би-фенилами // Микробилогия. 2007. Т. 76. № 6. С. 725-741.

3. Полихлорбифенилы: Проблемы экологии, анализа и химической утилизации / Под ред. В.Н. Чарушина. М.: КРАСАНД; Екатеринбург: УрО РАН, 2011. 400 с.

4. Unternian R. A history of РСВ biodégradation // Bioremedi-ation. Principles and Applications / Eds Crawford R.L., Crawford D.L. 1996. P. 209-253.

5. Pieper D.H. Aerobic degradation of poly chlorinated biphe-nyls // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67. N 2. P. 170-191.

6. Приказ МЗ СССР от 08.09.86 г №697.

7. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Демаков В.А. Характеристики микроорганизмов, выделенных из техногенных почв прикамья // Экология. 2006. № 4. С. 261-268.

8. Егорова Д.О., Корсакова Е.С., Демакова В.А., Плотникова Е.Г. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49. № 3. С. 267-278.

9. Егорова Д.О., Шумкова Е.С., Демаков В.А., Плотникова Е.Г. Разложение хлорированных бифенилов и продуктов их биоконверсии штаммом Rhodococcus sp. В7а // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 6. С. 644-650.

APPLICATION OF NATURAL STRAINS-DESTRUCTORS IN THE DEGRADATION PROCESS OF THE CHEMICAL POLLUTANTS

©2013 D.O. Egorova1, M.G. Pervova2

institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, UB RAS, Perm institute of Organic Synthesis, UB RAS, Ekaterinburg

The results of the decomposition of commercial mixtures of polychlorinated biphenyls (PCBs), highly hazardous chemical pollutants, under the influence of natural aerobic bacterial strains were demonstrated. Strains-destructors isolated from soils subjected to long-term chemical contamination, and belong to the genus Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus. As a result of their use, the level of destruction of PCB mixtures brands "Delors 103" was 78.6-98.3%, the brands "Sovol" - 84.0-87.5%.

Key words: PCB, degradation, Rhodococcus.

Darya Egorova, Candidate of Biology, senior researcher, email: daryao©rambler.ru; Marina Petvova, Candidate of Chemistry, senior researcher, e-mail: pervova(S)ios.uran.ru