CC BY
70
применение препарата «хитозан» с ионами бора в животноводстве
В. Р. КАЛИМУЛЛИНА,
0 о о WZ, KJKJ / и, 1. LiIVaitL/nnU у IJL J
аспирант, Уральским государственный аграрный университет, ул к. Либкнехта, д. 42;
Д. В. НЕСТЕРОВ, тел.: 89655175202; ’
аспирант, Уральский государственный лесотехнический университет, e-mail: [email protected]
О. Г. ПЕТРОВА, 620100, г. Екатеринбург, доктор ветеринарных наук, профессор, Сибирский тр„ д. 37;
Уральский государственный аграрный университет тел.: 8 (343) 254-65-06
620075, г. Екатеринбург,
Положительная рецензия представлена Л. С. Молочниковым, доктором химических наук, профессором кафедры общей и неорганической химии Уральского государственного лесотехнического университета.
Биологически активные вещества, неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т. д.), используются в качестве подкормки для животных, птиц и оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие и улучшают качество обрабатываемого продукта, находят все более широкое применение в ветеринарии.
Одним из наиболее проблемных направлений фармакологической науки является целенаправленный поиск новых высокоэффективных и безопасных лекарственных веществ.
Современные антибиотики и синтетические антимикробные средства занимают ведущее место в лечении бактериальных инфекций. Их применение при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях достигает 70-100 %. Трудности лечения и профилактики инфекционных заболеваний, обусловленные разнообразием биологических форм возбудителей, постоянным возникновением мультирезистентных форм, появлением новых видов опасных патогенов, определяют актуальность проблемы создания новых форм противомикробных средств.
Необходимость в новых препаратах обусловлена разнообразными причинами: расширение антимикробного спектра, повышение активности в отношении устойчивых возбудителей.
При проведении микробиологического мониторинга за 5 лет был отмечен возросший удельный вес полирезистентных штаммов St.aureus (10,2-66,7 %), Pseudomonas aeruginosa (5,2-18,8 %), множественная лекарственная устойчивость St.epidermidis (14,1-
55,6 %) к трем и более препаратам антимикробного действия. В этих условиях появление в клинической практике новых антибактериальных препаратов, активных в отношении полирезистентных штаммов, представляют огромный интерес.
В связи с этим актуален поиск веществ, обладающих антибактериальной активностью и не вызывающих развитие побочных реакций, характерных для большинства антибиотиков широкого спектра действия.
Одним из таких веществ является хитозан — природный поликатион, состоящий из остатков глюкоза-мина и N-ацетилглюкозамина.
Хитозан получают из панцирей красноногих крабов или из низших грибов путем удаления ацила (кар-
бонового соединения), который придает жесткость хитину.
Хитозан впервые был получен в 1859 г. профессором С. Роже.
Аминогруппы глюкозаминных звеньев хитозана позволяют ему связываться с отрицательно заряженными поверхностными структурами клеток микроорганизмов, что приводит к нарушению барьерной функции наружной мембраны у грамотрицатель-ных и активации автолизанов у грамположительных бактерий. Проникая внутрь, хитозан может взаимодействовать с различными компонентами цитоплазматического содержимого клетки, нарушая их нормальное функционирование, что в итоге приводит к гибели бактерий.
В связи с обнаружением уникальных свойств хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров во многих областях, в том числе ветеринарии и медицине.
Хитозан, благодаря уникальной структуре и положительному заряду, является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, низким порогом токсичности.
В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами, хито-зан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгистатические, противовоспалительные и другие свойства. Целью наших исследований было испытание препарата хитозан на основе ионов бора в ветеринарии. материалы и методы исследований.
Работа выполнялась в период с 2012 по 2013 г. на кафедре инфекционной и незаразной патологии в ГБУ Свердловской области «Свердловская областная ветеринарная лаборатория».
Исследованию был подвергнут препарат хитозан с ионами бора, разработанный в ФГБУ науки Ин-
ститут органического синтеза имени И. Я. Постов-ского Уральского отделения Российской академии наук (иОс УрОРАН).
Алгоритм исследований. В качестве объектов исследования использовали бактериальные культуры E.coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus epidermidis.
В ходе экспериментального исследования применялись клинические, микробиологические методы исследования.
Таблица 1
Антибактериальная активность хитозан с ионами бора в отношении клинических штаммов бактерий
Вид микроорганизмов МИК, %
E.coli (hem-) 0,0026 ± 0,001
E.coli (hem+) 0,0026 ±0,001
Klebsiella pneumonia 0,002 ± 0,001
Staphylococcus aureus 0,0002 ± 0,00004
Staphylococcus epidermidis 0,00006 ± 0,00004
Таблица 2
Бактерицидное действие препарата хитозан с ионами бора на E.coli и St.aureus
Тест-культура 2 %-й препарат 1 %-й препарат 0,5 %-й препарат
E.coli - - -
St.aureus - - -
Изучение антимикробной активности препарата хитозан с ионами бора проводили методом серийных разведений in vitro по стандартной методике разведений в питательном агаре на 4 культурах бактерий.
Клинические изоляты E.coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis были выделены из кишечника новорожденных телят с синдромом диспепсия. Массивность роста E.coli в кишечнике телят составила 105 КОЕ/г кала, Staphylococcus aureus > 105 КОЕ /г кала, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus epidermidis 104-105 КОЕ/г кала.
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли, используя серийные двойные разведения хитозана с ионами бора на мясо-пептон-ном бульоне.
В каждую пробирку вносили по 50 мкл физиологического раствора, содержащего суспензию бактерий в концентрации 6 х 107 КОЕ/мл. Контролем служила пробирка, содержащая чистую питательную среду.
Влияние концентрации хитозана с ионами бора на динамику роста культуры в жидкой питательной среде исследовали по модифицированному методу. Для этого 50 мкл суспензии 18-часовой культуры бактерий, содержащей 6 х 107 КОЕ/мл, добавляли к 100 мкл мясопептонного агара, содержащего испытуемый препарат в различной концентрации и рН 6,0. В контрольный вариант испытуемый препарат не добавлялся. Смесь инкубировали при 37 °С на качалке при 180 об./мин.
Антибактериальное действие в отношении бактерий исследовали в соответствии с принятой методикой, используя 0,1 %-й раствор препарата.
Изучение токсичности препарата проводили на 10 белых мышах. Препарат вводился в нативном виде в желудок белым мышам массой 25-30 г с помощью шприца, на сосок которого надевается эластичный зонд, внутренний просвет которого 0,5-0,7 мм. Было испытано 4 дозы: 0,5; 1; 1,5; 2,0 мл. За животными вели наблюдение в течение 2 недель после введения, учитывая общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхание, реакцию на внешние раздражители.
В хозяйстве, неблагополучном по колибактериозу, среди телят были проведены опыты по профилактике колибактриоза. Опыты проводили на телятах голштинской (черно-пестрой масти) породы в возрасте от рождения до одного месяца.
Для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней телят было сформировано две группы
новорожденных телят по 10 голов в каждой. Животным опытной группы в суточном возрасте задавали препарат хитозан с ионами бора в форме 3 %-го гелевого раствора в течение 15 дней по 30 мл на голову. Контрольные телята оставались интактными. Пробы крови для биохимических исследований брали в возрасте 1 сутки, а затем в возрасте 20 дней. Препарат разводили в молоке и выпаивали телятам.
Дезинфицирующие свойства препарата определяли на контаминированных тест-культурами (E.coli, Staphylococcus aureus) тест-объектах. В качестве тест-объектов использовались деревянные поверхности. Контаминированный тест-объект подсушивали в течение одного часа при комнатной температуре, а затем обрабатывали средством из опрыскивателя. Температура рабочего раствора препарата и воздуха во время опытов была в пределах 18-20 °С, относительная влажность 65-75 %. Опыты по антимикробной активности препарата, токсичности и изучению дезинфицирующих свойств были поставлены в двукратной повторности.
Статистическую обработку результатов производили с помощью программы MS Excel 2003.
результаты исследований.
Были проведены скрининговые исследования по изучению противомикробной активности препарата по отношению к тест-культурам E.coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus epi-dermidis (табл. 1).
МИК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост тест-культуры. В отношении клинических изолятов энтеробактерий МИК (минимальная ингибирующая концентрация) хитозана с ионами бора составила 0,0026 %, более чувствительными к действию вещества оказались золотистый стафилококк и Staphylococcus epidermidis.
Таким образом, грамотрицательные энтеробактерии оказались более устойчивыми к действию указанного полимера, по сравнению с грамположитель-ными кокками.
Возможно, это связано с наличием грамотрица-тельных бактерий внешнего липополисахаридного слоя, который выполняет барьерную функцию от проникновения олигомерных молекул препарата в клетку.
У грамположительных бактерий подобной структуры не имеется.
Энтеробактерии оказались более устойчивыми к действию хитозана с ионами бора на рост культуры в жидкой питательной среде. Ингибирование роста кишечной палочки отмечено при концентрации пре-
» - Аграрный вестник Урала № 6 (112), 2013 г.
Ветеринария
парата, равной 0,0026 %, золотистого стафилококка — при 0,0002 %. Более чувствительным оказался эпидермальный стафилококк, рост которого не обнаруживался при концентрации хитозана с ионами бора 0,00006 %, менее чувствительными оказалась Klebsiella pneumonia — 0,002 %.
С целью изучения возможности применения хи-тозана с ионами бора для лечения и профилактики заболеваний животных был проведен комплекс экспериментов по определению токсичности на мышах. Установлено, что максимально переносимая доза препарата составляет 1600 мг/кг, профилактическая — 70 мг/кг, а терапевтический индекс (соотношение этих доз) — 22,8, что указывает на достаточный предел безопасного применения препарата в ветеринарной практике.
В соответствии с методикой определения токсичности препарат вводили в желудок мышей в течение 20 дней с 5-дневными интервалами. Показатели содержания гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в крови, а также гексаналовой пробы, определяющей состояние детоксицирующей функции печени, в опытной группе не отличались от таковых в контрольной.
При гистологическом исследовании внутренних органов от мышей, получавших препарат хитозан с ионами бора в течение 20 дней, существенных изменений, которые можно было бы связать с воздействием препарата на их организм, не обнаружено.
При наблюдении за клиническим состоянием, ростом и развитием телят в течение 2 месяцев при клинических проявлениях диареи было выяснено следующее. Телята контрольной группы значительно отставали в весе от телят опытной группы. Разность в живой массе между контрольными и опытными телятами значительно больше — 15,59 кг для телят, получавших, хитозан с ионами бора. Интенсивность роста телят опытной группы выше, чем контрольных, соответственно на 13,8 % на 30-е сутки и на
21,7 % — на 60-е сутки после начала лечения. Таким образом, телята, получавшие для лечения опытный препарат, обладали наибольшей скоростью роста, в сравнении с контрольными телятами хозяйства.
При подсчете среднесуточного прироста живой массы были получены аналогичные результаты. Среднесуточный прирост живой массы в месячном возрасте у контрольных телят был в 1,6 раза ниже, чем у опытной. На 60-е сутки интенсивность роста опытных телят повышалась в 2 раза, по сравнению с контрольными. Общий среднесуточный прирост живой массы за опытный период у телят опытной группы составил 615 г, у контрольных — 511 г. При этом телята опытной групп опережали по скорости роста телят контрольной группы.
При гематологическом исследовании крови телят контрольной группы были выявлены значительные
изменения, указывающие на наличие острого воспалительного процесса в организме животных. В частности, отмечено увеличение общего количества лейкоцитов на 69 %, снижение количества эритроцитов — на 29,5 %, а также количества гемоглобина — на 36 %. Также отмечается нейтрофилия со сдвигом ядра влево. При биохимическом исследовании крови телят контрольной группы отмечено снижение уровня каротина на 27 %, кальция — на 34 %, фосфора — на 21 %. Повышена резервная щелочность и понижено содержание общего белка в сыворотке крови.
Эффективность лечения животных в опытной группе составила 100 % выздоровления телят, в контрольной группе пало 2 теленка из 10, что составило 80 % эффективности лечения.
При концентрации препарата хитозан с ионами бора от 2 до 0,5 % включительно рост всех микроорганизмов отсутствовал. Данные изучения бактериальной активности препарата приведены в табл. 2.
Экспозиция препарата составляла 30 мин при расходе 200 мл/м2.
Приведенные в табл. 2 данные свидетельствуют о высоком бактерицидном действии указанного препарата. Опыт проводился на тест-объектах без использования органической защиты тест-культур.
Выводы.
1. Препарат хитозан с ионами бора обладает противомикробной активностью по отношению к штаммам грамположительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов, выделенных от больных животных, в том числе: E.coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.
2. Не выявлено токсического действия препарата на организм лабораторных животных.
3. Установлено лечебное и профилактическое действие препарата хитозан при желудочно-кишечных заболеваниях телят.
4. Установлена биологическая активность препарата в отношении следующих микроорганизмов E.coli, St.aureus при экспозиции 30 мин и норме расхода 200 мл/м2.
рекомендации.
Практической ветеринарии предлагается новый препарат хитозан с ионами бора, который может использоваться для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у телят.
В дальнейшем препарат хитозан с ионами бора представляют научный интерес в плане потенциальной возможности использования хитозанового полимера для коррекции дисбактериозов, и использовании при бактериальных загрязнениях объектов ветеринарного контроля.
Необходимо провести сравнительную оценку действия препарата на заболевания желудочно-кишечного тракта вирусной этиологии.
литература
1. Малик Н. И., Панин А. Н. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. 2001. № 1. С. 24-26.
2. Хитин и хитозан : получение, свойства и применение / под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. М. : Наука, 2002. 368 с.
