CC BY
8Ветеринарный врач. 2023. № 4. С. 33 - 37 The Veterinarian. 2023; (4): 33 - 37
Научная статья
УДК 619:579:57.083.13
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_4_33
Применение пеногасителей при глубинном культивировании бруцелл
Рамиль Юнусович Насибуллин
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия Автор, ответственный за переписку: Рамиль Юнусович Насибуллин, [email protected]
Аннотация. Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. Данные соединения определяют индивидуальность большинства питательных сред. Кроме наличия углерода и азота микроорганизмам в среде необходимы так называемые факторы роста, к которым относятся витаминные комплексы, аминокислоты и азотистые основания. Также для хорошего роста микроорганизмов в среде нужны различные автолизаты и экстракты (дрожжевой и кукурузный). При построении веществ в клетке микроорганизмам также необходимы сера, фосфор, калий, натрий, железо и другие элементы. Насыщение микроорганизмов в этих элементах возможно за счёт применения минеральных солей.
В статье описывается применение средств для разрушения пены, а также исследование эффективности применения различных видов пеногасителей при созданных одинаковых условиях глубинного культивирования бруцелл (температура, аэрация, частота вращения лопастей мешалки). На основании анализа результатов, экспериментальных данных процесса пеногашения рекомендованы (определены) виды пеногасителя, их оптимальная концентрация, а также режимы и условия применения.
Для исследования были взяты штаммы Brucella abortus R- 1096, которые были получены из Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве. Печёночно-пептонный бульон (ППБ) и полусинтетическая питательная среда были приготовлены лабораторией питательных сред. Культивирование микроорганизмов проводили в стерильных условиях, что связано со стерилизацией инструментов и вспомогательной посуды, а также всех компонентов, поступающих в ферментатор. Применялась стерилизация в 1 %-ном растворе Деохлора в сухожаровом шкафу при температуре 180 °С в течение 60 минут и в автоклаве. Стерильность бокса и предбоксового помещения поддерживали путём аэрозольной обработки стен, потолков, пола, лабораторной мебели и инвентаря 1 %-ным раствором Деохлора и путём облучения ультрафиолетовой лампой.
Ключевые слова: питательная среда, бульон, вспениваемость, глубинное культивирование, пеногашение, пеногаситель, оптимальные условия, поверхностно-активные вещества
The use of defoamers in submerged cultivation of brucella
Ramil Yu. Nasibullin
Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological safety», Kazan, Russia
Corresponding author: Ramil Yunusovith Nasibullin, [email protected]
Abstract. The main components of any nutrient medium for the cultivation of microorganisms are carbon and nitrogen compounds. These compounds determine the individuality of most nutrient media. In addition to the presence of carbon and nitrogen, microorganisms need the so-called growth factors from their environment, that include vitamin complexes, amino acids and nitrogenous bases. Also, for the good growth of microorganisms in the medium, various autolysates and extracts (yeast and corn) are needed. In the construction of cell substances, microorganisms also need sulfur, phosphorus, potassium, sodium, iron and other elements. The saturation of microorganisms in these elements is possible through the use of mineral salts.
This article describes the use of means for the destruction of foam and the study of the effectiveness of the use of various types of defoamers under the same conditions for deep cultivation of Brucella (temperature, aeration, rotational speed of the laboratory stirrer). The regimes, conditions, types of defoamer and their optimal concentration are determined based on the analysis of the results of the experimental data of the defoaming process.
To solve the research tasks, Brucella abortus R-1096 strains were taken from State collection of strains - causative agents of especially dangerous diseases, used in veterinary medicine and animal husbandry. Liver-peptone broth (PPB) and semi-synthetic nutrient media made by the laboratory of nutrient media. The cultivation of microorganisms was carried out under sterile conditions, which is associated with the sterilization of tools and auxiliary utensils, as well as all components entering the fermenter. Sterilization was applied in a 1 % Deochlor solution, in a dry-burning cabinet at 180 °C for 60 minutes and an autoclave. The sterility of the box and the pre-box room was maintained by aerosol treatment of walls, ceilings, floors, laboratory furniture and inventory with 1 % Deochlor solution and by irradiation with an ultra violet lamp.
Keywords: nutrient medium, broth, foaming capacity, deep cultivation, defoaming, defoamer, optimal conditions, surfactants
Введение. Основными задачами развития животноводства являются повышение его продуктивности с целью полного удовлетворения потребностей населения в продуктах [1]. Сложная ситуация по бруцеллезу остаётся главной причиной широкого распространения данной инфекции и больших экономических потерь [2]. Немаловажная роль в решении этих задач отводится ветеринарным специалистам, призванным обеспечить стойкое благополучие животноводства в отношении заразных и незаразных заболеваний животных [1, 3].
Для ликвидации и профилактики инфекционных болезней животных и птиц отечественная промышленность выпускает разнообразные биопрепараты, вакцины, сыворотки, диагностикумы [2]. Одним из перспективных способов производства биопрепаратов является суспензионное (глубинное) культивирование микробов.
Трудности широкого применения суспензионного выращивания бруцелл обусловлены тем, что эти микроорганизмы, являясь факультативными внутриклеточными паразитами, весьма требовательны к подбору питательных компонентов в среде, строго определены к физико-химическим условиям культуральной жидкости, большой способностью к изменчивости бруцелл под влиянием различных внешних факторов [4, 5, 6]. Жидкие питательные среды с высоким содержанием органических компонентов характеризуются способностью к пенообразованию.
Ввиду высокого содержания органических компонентов, печёночно-пептонный бульон обладает более высокой вспениваемостью по сравнению с полусинтетической средой, что является нежелательным фактором, поскольку в процессе культивирования микробов возможен выброс пены из ферментатора, потеря продукта, нарушение асептических условий выращивания [7, 8].
В условиях лаборатории необходимо было определить, какие поверхностно-активные вещества окажутся наиболее эффективными пеногасителями при глубинном культивировании и позволят сократить потерю продукта, а также обеспечат сохранение асептических условий выращивания бруцелл.
Материалы и методы. Для изучения вспениваемости питательных сред и отработки технологии пеногашения были взяты печёночно-пептонный бульон (ППБ) и полусинтетическая питательная среда. Содержание аминного азота в обеих средах составляло100 мг/%. Вспениваемость сред определяли барботажным методом. Количественный показатель этого свойства сред определяли по формуле:
q=(HпxТр) /Th
где q - вспениваемость (см);
Нп - высота пены, достигаемая в период интенсивного аэрирования;
Тр - длительность самопроизвольного разрушения пенного столба после прекращения аэрации;
Th - длительность достижения уровня пенообразования с момента начала аэрации (С).
Для отработки технологии химического пеногашения в процессе аэрации питательных сред нами были испытаны поверхностно-активные вещества: рафинированное подсолнечное масло, Антифоам 204, силиконовые жидкости ПГЖ-891и ПМС-1000. Поверхностно-активные вещества добавлялись в культуральную жидкость в концентрации от 0,1 % и выше.
Результаты исследований. Изучение оптимальных условий глубинного культивирования R культуры штамма B. abortus осуществлялось на опытных образцах, которые по культурально-биохимическим свойствам соответствовали паспортным данным культуре штамма B. abortus R-1096. Результаты изучения вспениваемости питательных сред приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты изучения пенообразования сред
Номер опыта Нп (см) Th (с) Тр (с) q (см)
Полусинтетическая гидролизатальбуминовая питательная среда
1 29 900 453 14,6
2 29 850 496 17,0
3 30 930 481 15,2
M±m 15,6±0,8
Печёночно-пептонный бульон
1 29 120 720 174
2 29 150 1200 232
3 29 180 1560 251
4 37 290 2280 308
5 37 289 2460 296
M±m 254±4,0
Как видно из таблицы 1 обе взятые в серию опытов среды обладают тенденцией к вспениванию при подаче в них потока газовой смеси. В экспериментах максимальная аэрация составляла в соотношении объёмов среда/воздух 1/3 (л/мин). Однако этот показатель в количественном отношении у данных сред существенно отличается. У полусинтетической питательной среды он составил всего 15,6 см и характеризует вспениваемость этой среды как малую. У печёночно-пептонного бульона -среды с высоким содержанием органических компонентов - вспениваемость выше по сравнению с полусинтетической средой, что свидетельствует об очень высокой способности указанной среды к пенообразованию. Несомненно, что в процесс культивирования микробов в печёночно-пептонной среде сопровождается нежелательными факторами. Возможен выброс пены из ферментатора, потеря продукта, нарушение асептических условий. В этом плане ПСП среда имеет преимущество. Эффективность пеногашения определялась в тех же условиях и по той же методике, что и в исследованиях по пенообразованию. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Эффективность пеногашения различных поверхностно-активных веществ
Пеногасители Количество ПАВ, (в % к среде) q (см)
Полусинтетическая гидролизатальбуминовая питательная среда
Подсолнечное масло 0,1 11,0
0,2 7,2
0,4 1,0
Антифоам 204 0,1 Следы пенообразования
0,2 Следы пенообразования
0,5 Следы пенообразования
ПГЖ-891 0,1 Следы пенообразования
0,2 Следы пенообразования
0,5 Следы пенообразования
ПМС-1000 0,1 Эмульгация без пленкообразования
0,2 Эмульгация без пленкообразования
0,5 Эмульгация без пленкообразования
Печёночно-пептонный бульон
Подсолнечное масло 0,1 Выброс пены
0,2 Выброс пены
0,4 Выброс пены
0,5 10,0
0,6 4,0
Антифоам 204 0,1 Следы пенообразования
0,2 Следы пенообразования
0,5 Следы пенообразования
ПГЖ-891 0,1 Следы пенообразования
0,2 Следы пенообразования
0,5 Следы пенообразования
ПМС-1000 0,1 Эмульгация без пленкообразования
0,2 Эмульгация без пленкообразования
0,5 Эмульгация без пленкообразования
Из испытанных поверхностно-активных веществ лучшие результаты по эффективности пеногашения получены при использовании Антифоам 204 и ПГЖ-891. Добавление их в питательные среды в количестве 0,1 % в полусинтетическую и 0,2 % в печёночные среды практически полностью разрушала образовавшуюся в процессе аэрации пену.
Значительно меньшей способностью разрушать пену обладает рафинированное подсолнечное масло. Его требуется от 0,4 % до 0,6 % к объёму питательной среды. К тому же, масло в процессе культивирования микробов быстро эмульгирует в среде и требуется его постоянное добавление, что, в конечном счёте, изменяет физико-химический состав среды и отражается на результатах биохимических исследований жидкости. Подсолнечное масло обладает низкой способностью пеногашения и может быть использовано в случае отсутствия других пеногасителей. Силиконовые жидкости марки ПМС-1000 непригодны для пеногашения. Они эмульгируют в питательной среде в виде мелких капель, не образуют на поверхности среды плёнку натяжения.
Резюмируя вышеизложенное, можно отметить, что полусинтетическая питательная среда обладает малой вспениваемостью и в этом отношении выгодно отличается от печёночно-пептонного бульона, вспениваемость которого в несколько раз выше.
Наиболее приемлемыми пеногасителями в процессе работы определены Антифоам 204 и ПГЖ-891. Добавление их в питательную среду от 0,1 % до 0,2 % достаточно для полного разрушения пены.
Заключение. В результате проведённых исследований получили данные, дополняющие научное обоснование технологии суспензионного (глубинного) культивирования.
Представлена характеристика вспениваемости полусинтетической и печёночно-пептонной сред, и определены наиболее эффективные химические пеногасители. Установлено, что гидролизатальбуминовая среда в отличие от печёночно-пептонной обладает малой вспениваемостью. Этот показатель у неё в несколько раз ниже. Данное свойство выгодно отличает эту среду, поскольку фактор вспениваемости культуральной среды один из важных в производственных условиях. Установлено, что наиболее эффективными химическими пеногасителями для культивирования бруцелл в вышеуказанных средах являются Антифоам 204 и ПГЖ-891. Добавление их в минимальной концентрации от 0,1 % до 0,2 % в питательные среды практически полностью разрушает образующуюся пену. Силиконовая жидкость марки ПМС-1000 для этой цели не пригодна, а подсолнечное масло малоэффективно.
Литература
1. Авцинов, И. А. Модель кинетики процесса культивирования микроорганизмов / И. А. Авцинов, Ю. Е. Кожевников, Н. В. Суханова // Вестн. Тамб. гос. техн. ун-та. - 2017. - Т. 23, № 3. - С. 481-487. - DOI: 10.17277/vestnik.2017.03.
2. Бруцеллез: его распространение и профилактика / Р. Ю. Насибуллин, Л. А. Тухватуллина, Я. А. Богова, Г.М. Сафина, М.А. Косарев // Ветеринарный врач. - 2021. - № 1. - С. 38-43.
3. Карпов, А. А. Масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах : специальность 03.00.23 «Биотехнология» : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Карпов Антон Александрович ; Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН. - Щелково, 2004. - 26 с.
4. Универсальная синтетическая среда для выращивания патогенных и пробиотических микроорганизмов при получении биопрепаратов / Д. А. Евглиевский, А. А. Евглиевский,
В. В. Семенютин, И. И. Смирнов, К. В. Татарников // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 4. - С. 64-66.
5. Изучение культурально-морфологических свойств бруцелл вида Abortus, находящихся в различной степени диссоциации / М. А. Косарев, А. М. Фомин, Г. М. Сафина, С. А. Григорьева // Ветеринарный врач. - 2018. - № 4. - С. 14-18.
6. Сравнительное изучение разных питательных сред для промышленного культивирования бруцелла абортус 19 / П. М. Кабахова, С. Г. Хаиров, О. Ю. Юсупов, Э. А. Яникова // Ветеринарная медицина. - 2014. - № 2. - С. 6 - 8.
7. Глубинное культивирование микроорганизмов. - URL: http://www.bioinside.ru/conibs-1246-2.html (дата обращения 16.03.2023).
8. Озеренко, О.А. Моделирование процессов периодического культивирования микроорганизмов : специальность 03.00.23 «Биотехнология» : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Озеренко Оксана Алексеевна ; Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН. - Щелково, 2004. - 28 с.
References
1. Avtsinov, I. A. Model of the kinetics of the process of cultivation of microorganisms / I. A. Avtsinov, Yu. E. Kozhevnikov, N. V. Sukhanova // Vestn. Tamb. state tech. university. - 2017. - Vol. 23, No 3. - Р. 481-487. - DOI: 10.17277/vestnik.2017.03.
2. Brucellosis: its distribution and prevention / R. Yu. Nasibullin, L. A. Tukhvatullina, Ya. A. Bogova, G. M. Safina, M. A. Kosarev // The Veterinarian. - 2021. - No 1. - P. 38-43.
3. Karpov, A. A. Scaling the processes of deep cultivation of microorganisms in a bioreactor: specialty 03.00.23 «Biotechnology» : author. dis. ... cand. biol. Sciences / Karpov Anton Aleksandrovich ; All-Russian Scientific Research and Technological Institute of the Biological Industry of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - Shchelkovo, 2004. - 26 p.
4. Universal synthetic medium for the cultivation of pathogenic and probiotic microorganisms in the production of biological products / D. A. Evglievsky, A. A. Evglievsky, V. V. Semenyutin, I. I. Smirnov, K. V. Tatarnikov // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2011. - No 4. - P. 64-66.
5. Study of the cultural and morphological properties of Brucella species Abortus, which are in varying degrees of dissociation / M. A. Kosarev, А. М. Fomin, G. M. Safina, S. A. Grigoryeva // The Veterinarian. -2018. - No 4. - P. 14-18.
6. Comparative study of different nutrient media for industrial cultivation of Brucella abortus 19 / P. M. Kabakhova, S. G. Khairov, O. Yu. Yusupov. E. A. Yanikova // Veterinary medicine. - 2014. - No 2. -Р. 6 - 8.
7. Deep cultivation of microorganisms. - URL: http://www.bioinside.ru/conibs-1246-2.html (accessed 03.16.2023).
8. Ozerenko, O. A. Modeling of the processes of periodic cultivation of microorganisms: specialty 03.00.23 «Biotechnology» : author. dis. ... cand. biol. Sciences / Ozerenko Oksana Alekseevna ; All-Russian Scientific Research and Technological Institute of the Biological Industry of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - Shchelkovo, 2004. - 28 p.
© Насибуллин Р. Ю. 2023
