CC BY
76
0
ГЛАВНАЯ ТЕМА / Знаковое в науке
Применение «-омных» технологий
при анализе мясного сырья и продуктов
И.М. Чернуха, доктор техн. наук
ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии
Сейчас все чаще встречаешь словосочетание «постгеномная эра» как обозначение периода новейшей истории научных исследований. Таким образом, следуя логике изложения, существовали догеномный и геномный периоды развития науки.
Ключевые слова: геномика, протеомика, метаболомика, нутриогеномика, транскрип-томика.
^ Считается, что постгеномная эра наступила после полной расшифровки генома человека, что произошло в 2003 году. Геномная эра берет начало в 1970-х. Начало было положено в 1953 году Уотсо-ном и Криком, предложившим модель ДНК в виде двойной спирали. Это открыггие положило начало работам по установлению структуры генома как последовательности генов. В свою очередь, расшифровка генома позволит постепенно установить структуры всех белков, которые эти гены кодируют [1].
ГЕНОМИКА - наука о генах (геноме) - раздел молекулярной генетики, изучает последовательность ДНК, функциональные свойства генов, их функционирование в живых системах. В постгеномную эру появились - функциональная ге-номика, главной задачей которой является выяснение механизма функционирования клетки в динамическом режиме, когда белки классифицируются не только по массе, но и по функции, и структурная ге-номика, фармакогеномика [2]. Наконец, геномика положила начало получению трансгенных животных и растений медицинского назначения. Наследственные заболевания, дефекты гена и хромосом дают лишь 2% всех заболеваний, а нарушение экспрессии нормального гена, нарушение регуляции - причина ненаследственных болезней, которые составляют 98%
ПРОТЕОМИКА - наука о про-теоме, белковой клетке - системное изучение структуры белка, качества, состояния, активности, субклеточной локализации в данный момент
времени [3].
МЕТАБОЛОМИКА - определение вторичных метаболитов, использование продуктов обмена веществ в диагностике заболеваний
НУТРИОГЕНОМИКА - изучает биохимическую взаимосвязь между составом пищевого продукта и ДНК потребителя, в том числе:
- изучение физиологии механизмов влияния питания на генотип;
- изучение обменных процессов на молекулярном уровне;
- выявление метаболических связей не открытых ранее.
Нутриогеномика изучает влияние пищевых продуктов и ингредиентов на характер экспрессии генов, обменные процессы на молекулярном уровне. Предоставляет научную основу для понимания биологической активности компонентов пищевых продуктов - в отличие от нутрициологии, концепция которой не предполагает генетического разделения потребителей.
Как и в случае с человеком, применение положений нутригеномики к кормлению сельскохозяйственных животных позволит учитывать разнообразие и генетические особен-
ности пород.
ТРАНСКРИПТОМИКА - это идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной мРНК, определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки [4].
Главный Закон Генетики гласит, что информация ДНК записывается на РНК, а затем передается на белок (рис.1).
Белки ответственны за установление и поддержание биохимических процессов образования и/или обращения метаболитов в организме. Взаимосвязь «-омных» технологий можно описать следующим образом: с помощью транскипто-мики (экспрессия генов) происходит оценка изменений в транскрип-томе; с применением протеомики исследуется комплекс белков (про-теом), в то время как метаболомика изучает белковые комплексы, состоящие из молекул с массой менее 1500 кДа. По данным Дэвиса [5] в одном растении, в зависимости от вида, содержится 30000-60000 генов, не менее 100000-120000 белков и приблизительно 90000200000 метаболитов.
Рисунок 1. Схема регуляции процесса жизнедеятельности через питание.
12
ВСЁ О МЯСЕ № 6 декабрь 2012
Знаковое в науке / ГЛАВНАЯ ТЕМ.
А
Рисунок 2. Методика идентификации генов-маркеров нежности мяса
Такое количество генов, белков и метаболитов требует тщательного и дивесифицированного их изучения и оценки влияния на качество и безопасность пищевого продукта.
Во ВНИИ мясной промышленности в последние пять лет особое внимание быто уделено развитию таких современных фундаментальных направлений исследований как геномика, протеомика и нутригено-мика применительно к мясной отрасли.
В задачи функциональной гено-мики входит изучение генов конкретного организма, и определение функций конкретного гена. Функциональная геномика сочетает такие «омные» технологии как транс-криптомика и протеомика.
Результаты последних исследований [6,7,8] показали, что в ряде случаев функционально-технологические характеристики и качественный состав мяса зависит от присутствия единственного гена -носителя требуемой характеристики.
Специалистами ВНИИМПа установлены последовательности трех основных маркеров гена каль-паина - САР№, кальций-зависимой протеазы, ответственной за характеристику нежности говядины (рис. 2).
В результате проведенных исследований выявлена точечная мутация характерная для маркера 316, а также ряд других точечных мутаций исследованного участка ДНК, раз-
работан отечественный метод SNP детекции (идентификации генетических изменений) у крупного рогатого скота по данному признаку.
Разработанный метод позволяет проводить массовое генотипирова-ние КРС по признаку нежности мяса (проводить порядка 1500 исследований в день, при секвениро-вании до 5 испыгганий), дает однозначный ответ: есть ли желательный аллель и его распространенность.
Ван ден Виль [9] в своем обзоре подтверждает возможность методами протеомики прогнозировать качество мяса на примере результатов изучения факторов, влияющих на водосвязытающую способность (ВСС). Методом электрофореза в двух измерениях выявлены три и потенциально еще восемь белков, значительные изменения в которых заставляют связывать их с изменениями ВСС L.dorsi и Biceps Femoris и говорить о возможности их использования в качестве белков-маркеров при прогнозировании ВСС. Наиболее четко быти идентифицированы креатин фосфокиназа М типа, десмин и транскрипционный активатор (SWI/SNF матрикс ассоциированный актин зависимый регулятор хроматино- вого субсемейства A, SNF2L.1)
Саркоплазматический протеом объединяет растворимые белки, включая миоглобин и ферменты, и составляет около 30% от общего содержания белков скелетный мышц, управляя различными биохимиче-
скими процессами в мышцах, в том числе и цветообразованием. Suman S.P., JosefP. et al. [10], изучая сарко-плазматические протеомы цветоста-билыных Longissimus lumborum (имеют положителыную корреляцию с величиной 'а') и цветолабилы-ныгх, например, Psoas Major, мышц КРС, выывили 17 пептидов, влияющих на стабилыносты цвета говядины. Из них толыко три белка (ша-перон белок DJ -1, связующий белок серотрансферин и тканевый фермент митохондриалыная акони-таза 2), выывленныге в значителыныгх количествах, характерны для Psoas Major (PM). Для L. lumborum (LL) характерны, например, шаперон -белок теплового шока 27КДа и белок стресса фосфопротеин 1.
В цветолабилыныгх мышцах исследователи выывили болышее количество митохондриалыной актиназы, которая отрицателыно коррелирует с показателем 'а' (коэффициент корреляции -0,59). Болышая цвето-стойкосты LL мышц КРС, полагают авторы, связана с чрезмерной экспрессией белков антиоксидантного действия - перокси- редоксина-2, дигидроптеридин редуктазы, алыдоз редуктазы, а также шаперона - белка теплового шока 27 КДа. Полученные данные позволяют предпола-гаты возможность направленного воздействия на цвет говядины.
По скорости и характеру образования карбонилыныгх соединений можно, по мнению ряда исследователей, контролироваты процессы окисления белков. Следователыно, контролироваты можно и такие функционалыно-технологические свойства мяса как ВУС, а по уровню калыпастатина - нежносты мяса (Р. Ламетш, 2011 meat omics) по концентрации белка 80 КДа, содержание которого обратно коррелирует с величиной усилия среза.
С увеличением спроса на продукты, готовые к потреблению, возрастает ролы мяса, подвергнутого глубокой технологической переработке.
С помощыю 2D электрофореза из образцов вареной колбасы выделены общие белки и проанализированы методом MALDI-TOF тан-демной масс-спектрометрии. Выщелено болышое количество тканевых ферментов, такие как мышечная креатинкиназа, аденилки-
№ 6 декабрь 2012 ВСЁ О МЯСЕ
13
0
ГЛАВНАЯ ТЕМА / Знаковое в науке
1 MSDEEVEHVE EEYEEEEEAQ EEEEVQEEEK PRPKLTAPKI PEGEKVD FDD
51 IQKKRQNKDL MELQALIDSH FEARKKEEEE LVALKERIEK RRAERAEQQR
101 IRAEKERERQ NRLAEEKARR EEEEAKRRAE DDLKKKKALS SMGANYSSYL
151 AKADQKRGKK QTAREMKKKV LAERRKPLNI DHLSEDKLRD KAKELWDALY
201 QLEIDKFEYG EKLKRQKYDI INLRSRIDQA QKHSKKAGTT PKGKVGGRWK
Рисунок 3. Тропонин Т
наза, альдолаза, нами были идентифицированы белки тропонин-Т, миоглобин, легкие цепи миозина, актин [11]. На рис. 3 представлен пример идентификации белков.
Фракция 18 была идентифицирована как Тропонин-Т - миофиб-риллярный белок, который играет главную роль в переносе внутриклеточного кальция при взаимодействии актина с миозином. В отличие от ферментов, которые всегда можно обнаружить в клетке, тропо-нины являются регуляторными протеинами, которые тесно связаны с сократительным аппаратом мышечных волокон и имеются в минимальном количестве в цитозольных запасах (внутриклеточная жидкость). Именно поэтому обнаружение тропонинов в экстракте является первым признаком разрушения мышечных клеток. Поскольку такое разрушение обуславливается автолитическими изменениями, то Тропонин-Т может рассматриваться как потенциальный маркер мяса стадии созревания.
Таким образом, протеомика может стать инструментом управления функционально-технологическими характеристиками мяса.
Одно из практических направлений протеомики - выделение и изучение биоактивных пептидов (БАЛ). БАЛ природного происхождения делятся на четыре группы: пептиды, обладающие гормональной активностью, пептиды, принимающие участие в процессе пищеварения, пептиды, источник которых - а2-глобулиновая фракция сыворотки крови, нейропеп-тиды. Особенность биоактивных пептидов заключается в том, что в составе белков они находятся в латентном (спящем) состоянии и высвобождаются под воздействием протеолитических ферментов (мышечных протеиназ, микробиальных, пищеварительных) [12]. Такие БАЛ могут обладать антигипертензив-ной, антиокислительной, иммуно-
модулирующей, антимикробной, антитромболитической, гипохоле-стеринолииической, пребиотиче-ской активностью, обладать способностью образовывать комплексы с минеральными веществами, способностью ингибировать действие опиоидов.
Например, ангиотензины (представленные октапептидами), оказывающие выраженное сосудосуживающее действие, образуются из присутствующего в сыворотке крови неактивного белка ангиотен-зиногена в результате последовательного действия ряда протеолити-ческих ферментов.
К ним можно добавить БАЛ, способствующие формированию или коррекции функциональных характеристик тканей. К этой группе можно отнести БАЛ, выделенные из мясного сырья [13].
Из экстрактов ткани предсердия человека и животных были выделены биологически активные пептиды, регулирующие тонус сосудистой системы и электролитный обмен. Физиологический эффект их оказался противоположным влиянию системы ренин-ангиотен-зин-альдостерон. Он выражается в сосудорасширяющем действии, усилении клубочковой фильтрации и стимуляции выведения натрия и хлоридов за счет угнетения их реаб-сорбции в канальцах. Эти пептиды получили название атриопептидов (atrio - предсердие). Они построены из разного числа аминокислот (от 23 до 100), но обязательным условием для проявления биологического эффекта является наличие в молекуле 17-членной кольцевой структуры, образующейся за счет дисульфидной связи между остатками цистеина [14].
Изучение гиполипидемических и антиатерогенных свойств сердец и аорт молодых телят, проведенное во ВНИИМЛе [15], показало положительное влияние биологически активных веществ, содержащихся в
данном сырье. Они влияют не только на липидный спектр, снижая уровень холестерина и триглицери-дов в крови, но и на иммунную составляющую развития атеросклероза, что проявлялось в снижении числа клеток, ответственных за возникновение и развитие заболевания. Установлено, что наибольший анти-атерогенный эффект оказывает аорта, однако вещества, содержащиеся в сердце, проявляют вместе с активным началом аорты синерги-ческое действие.
Интерес к природным пептидам в значительной степени обусловлен необычно высокой их биологической активностью. Они оказывают мощное фармакологическое действие на множество физиологических функций организма. В то же время были замечены низкая стабильность и быстрый распад их в организме при физиологических значениях рН среды. Все это способствовало развитию исследований по выделению и изучению функциональной направленности пептидов, выделенных из органов и тканей животных.
Преимущество мясного сырья как источника биоактивных пептидов состоит в том, что послеубой-ное созревание приводит к высвобождению тканевых ферментов, которые, в свою очередь, атакуют белки мяса с образованием пепети-дов. Таким образом, послеубойное созревание приводит к увеличению в мясном сырье биоактивных пепе-тидов. Например, под действием ка-тепсинов и кальпаинов происходят известные процессы формирования вкуса, аромата и нежности мяса. В то же время Арихара сообщал о наблюдаемом увеличении антигипер-тензивной АСЕ-ангеотензивный I-конвертирующий фер- мент) активности говядины, т.е., ингибитора АСЕ. Таким образом, перетид-ингибитор АСЕ способен подавлять рост кровяного давления, ингиби-руя каталитическую активность АСЕ.
БАЛ образуются и в сырокопченых и сыровяленых мясных продуктах под действием мышечных протеаз, активность которых возрастает в процессе естественной ферментации в присутствии молочнокислых бактерий. Содержание БАП может в результате фермента-
36
ВСё О МЯСЕ № 6 декабрь 2012
Знаковое в науке / ГЛАВНАЯ ТЕМА
ДР
JJ». ko. h.[ rinJ.
п 1:c й rl |:л|/1*ег»змпр ipu; -t
№ш№41ф1наЪпв ЬНлЪк A LCI&4-1 ïï
s is.i j.ié L-_izli:i d:de*:uji Ае|1з:л nie 34-
? члг ■ KJS al&i'.ydiïlioïïi* 311 14ОГЛьU1E pogl Ur
з» 13." 3,56 DbeetWEl i!
IL :t ■ i.r- !i-.:|*:Ml-:i:::]ri-.:r 1 l^il' it
J: :ijî s.îs jdery- ыяьпжи iimdn.11111 p.e i"
12 i ч iripecjo Г ::
JJ i.v m ùhvij?nniii.i^ : г и 1 _ : v J : - h г г^г. Ш ît
s.îp 1ЛИЙТ1М lEEfnili
ji.t ■!."" ^=jvjiekiii<1< *-[-'.-|ie II
:Î :s.-l j.r s"
: * 3 £■ 6 41 fiiirjiH 1 'л: к 7.! т\рл i
h ч л г*"
,,, AJVE-nn II -1.: ЕЫЯ I ï pt
3g -, 30 î0 ja ai^ K*|o>jiirii Г.РЗ-. âinjjiujée 1 h T.y. .■■ .■.■:■ h- : : .j.-. ; t-AT- £43 Bftl sj
¡: vc flî ЕП E 2 lùhjû ::
35 ;s,j a.ip йшаинлллллпззэ^выипш 1
3" 34 3 5 JEU rlillll lï «3
Коэлгктрофорел Гимциня/Овинина
Вмдоспецнфлчныв х pîltifiiriCiibii Gï.nhn
Рисунок 4. Эталонная 2D электрофореграмма колбасы вареной «Докторская», выработанной по ГОСТ Р 52196-2003.
Красным цветом обозначены белки, идентифицированные как свиные (Sus scrofa), синим цветом белки коровьего происхождения (Bos Taurus), номерами обозначены:1 - миоглобин, 2 - бета-енолаза, 3- легкая цепь миозина, 4- тропонин I, 5- триозофосфатизомераза .
ции возрасти до 1%. При этом, по данным ряда исследователей [3, 16], образующиеся в сыфокопченыгх и сыфовяленыгх мясных продуктах БАЛ обладают ангигипертензивной активностью. При этом ингибитор-ная активность по отношению к АСЕ у ферментированных мясных продуктах выше, нежели у нефер-ментированных. Ферментативная тендеризация мясного сырья - это еще один способ обогащения продукта БАЛ.
Применение секвенирования белков позволило понять структуры биоактивных пептидов, выделенных из животного сырья. Известны БАЛ, выщеленные из мышечноткан-ныгх белков цыплят, например, Leu-Lys-Ala; Leu-Lis-Pro; Phe-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg; Phe-Lis-Gly-Arg-Туг-Туг-Рго и тяжелых цепей миозина - Asn-Pro-Pro-Lys; 1к-ТЫ--ТЫ--А8П-РГО.
К числу наиболее известных БАЛ, выщеленныгх из мышечной
ткани, относятся карнозин и ансе-рнн (эндогенные пептиды с антиокислительными свойствами), L карнитин (дипептид Lys -Met).
В последнее время некоторым биоактивным пептидам также придается значение как пребиотикам. К их числу относятся гидролизаты молочного белка, например, которые, по мнению Brody (2000), способствуют росту молочнокислых и би-фидобактерий. Такими же свойствами, по мнению Арихары, обладают и гидролизаты актомио-зина скелетных мышц свиней, обработанных папаином. В их числе, трипептид Gly-Leu-Met.
В настоящее время экспериментально доказано участие нутриентов (углеводы, амино- и жирные кислоты, витамины, железо и пр.) в регуляции генетической экспрессии в ответ на изменение состава пищи. Каждый человек, столкнувшись с изменениями в рационе питания, из-за индивидуальной комбинации ге-
нетических полиморфизмов может отреагировать на них по-разному, даже если это приведет к одному и тому же состоянию гомеостаза [17].
Фальсификация пищевого продукта предполагает незаконные действия, изменяющие состав мяса и мясных продуктов. Одни характеристики (например, фальсификацию химичес-кого состава) можно выявить рутинными методами, для других (жирнокислотный состав) требуются более сложные методы анализа, для третьих требуются высокоточные и чувствительные методы. К последним относятся методы выделения и идентификации пептидных маркеров видовой или тканевой специфичности. Учитывая тот факт, что последовательность аминокислот в пептидах намного более устойчива к воздействию технологической обработки, чем ДНК, возможна разработка метода проте-омного исследования не столько мясного сырья, сколько готовых мясных продуктов, прошедших глубокую переработку.
Для протеомных исследований наиболее эффективен впервые опубликованный в 1975 году О'Фарреллом метод 2D электрофореза [18]. Преимуществом метода принято считать использование изоэлектрофокусирования в тонких колонках полиакриламид-ного геля.
С помощью протеомных технологий проведено изучение нескольких образцов вареной колбасы «Докторская», изготовленных тремя заводами-производителями, а также образцов мясного сырья, используемого при приготовлении вареных колбас и некоторых видов белковых добавок. На типичных двумерных электрофорегаммах (рис.4) выывлено несколько десятков белковых фракций, которые по электрофоретическим свойствам и данным масс-спектрометрии соответствовали основным мышечным белкам [19].
Можно предположить следующие направления развития постгеномных технологий для изучения мясного сыфья и мясопродуктов: применение протеомики для изучения механизмов формирования качества мясного сырья и идентификация биомаркеров качества, управление функционально-техноло-
№ 6 декабрь 2012 ВСЁ 0 МЯСЕ
37
0
ГЛАВНАЯ ТЕМА / Знаковое в науке
гическими свойствами мяса, управление безопасностью мяса, окисление белков и связь со здоровьем человека. «-Омные» технологии стано-
вятся в мясной промышленности надежным инструментом улучшения и контроля качества, безопасности и соответствия.
Контакты:
Ирина Михайловна Чернуха +7(495)676-7211
Литература
1. Шишкин С.С., Ковалев Л.И. и др. Полиморфизм мышечных белков человека // М., РУДН, 2011. - 571 с.
2. Сердюк И.Н. Физические методы в структурной молекулярной биологии в начале XXI века //Успехи биологической химии, 2002, т.42. - с.3-28.
3. Pognan F. Genomics, proteomics and metabonomics in toxicology: hopefully not "fasionomics"/ Pharmacogenomics, 2004. v.5. N7. p.879-893.
4. http://www.innovanews.ru/info/glossary/transkriptomika/
5 Davis Howard. A role for "omics" technologies in food safety assessment// Food control, 2010, v.21. p.1601-1610
6 Bhuian M.S.A. et al. Single nucleotide polymorphism analysis of bovine candidate genes for carcass and meat quality traits / 53 ICoMST Proceedings, 2007, pp.79-80
7. Cue R.-A. et al. Variations in expression of CYP2E1 and COUP-TF1 proteins between Large White and Duroc cross-breeds/ 53 ICoMST Proceedings, 2007, pp.29-30.
8. Доусон Карл A. Нутригеномика в свиноводстве: кормление для реализации генетического потенциала воспроизводства - материалы конференции «Питание и репродукция у свиней: новые подходы» (20 октября 2005 г., Дублин, Ирландия), р.3.
9. Wiel Dick F.M. van de, Zhang Wei Li. Indentification of pork quality parameters by proteomics. Meat science, 2007, p. 46-54.
10. Suman S.P., Josef P. et al. Proteomics of muscle-specific beef color stability // J. of Agricultural and food chemistry, 2012, v.60. p.3196-3203,
11. Chernukha I, Usanova O, GrishenkoV. Changes in fractional composition of sarcoplasmic and miofibrillar pork proteins in the process of long-term storage at low positive temperatures // Tehnologija mesa. - 2009. - №3-4, с.223-226.
12. Марри Р., Греннер Д., Мейес П.и Родуэлл В. «Биохимия человека», т. 1-2, Москва, «Мир», 2004г. - 381 с.
13. Arihara K. Strategies for designing novel functional meat products/ Meat Sci., 2006. v.74. issue 1. p.219-229.
14. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия // Москва, "Медицина", 1998. - 743 с.
15. Котенкова Е.А., Федулова Л.В., Чернуха И.М. Разработка функциональных продуктов питания, обладающих антиатерогенными свойствами, модифицированных добавлением измельченных тканей сердец и аорт молодых бычков// Научно-инновационные аспекты при создании продуктов эдорового питания-Сб.материалов всероссийской научно-практической конференции, Углич, 2012, стр. 120-123
16. Timon M.L., Andres A.I., et al. 57ICoMST Proceedings, 2011. - P.123.
17. Corthesy-Theulaz I., Dunnen Johan T. den, Ferre Pascal, et.al Nutrigenomics: the impact of biomics technology on nutrition research // Annales of Nutrition and Methabolism, 2005/ v.49. - N 6. - pp.355-365.
18. O'Farrell P.H. High resolution two dimensional electrophoresis of proteins // J.Biol.Chem., 1975. V.250. - p.4007-4021
19. Ковалева М.А., Иванов А.В., Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Хряпова Е.В., Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Вострикова Н.Л. Протеомные технологии в исследованиях белкового состава вареных колбасных изделий.// Все о мясе. 2012. № 2. С.48-53.
