CC BY
90
БОЛЕЗНИ ЛОШАДЕЙ
ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ СУХОЖИЛИЙ ЛОШАДИ
MESENCHYMAL STEM CELLS IN THE THERAPY OF TENDON AND LIGAMENT LESIONS IN HORSES
КОВАЧ М.1, АЛИЕВ Р.1, СТАВИЦКИй С.2, ЕРЕМИН П.С.3, ПУЛИН А.А.3, ЕРЕМИН И.И.22 3,
1 Ветеринарная клиника «Новый Век» 2 Центр ветеринарной клеточной медицины, г. Москва 3 ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой» Управления делами президента Российской Федерации
yflK 617.3
KOVAC M.1, ALIEV R.1, STAVICKIY S.2, EREMIN P.S.3, PULIN A.A.3, EREMIN I.I.2' 3,
1 Veterinary Clinic - New Century, Moscow
2 Center for Veterinary Medicine of the cell, Moscow
3 FGBI "CDB Polyclinic" Office of Presidential Affairs of the Russian Federation
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА / KEY WORDS:
мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, I mesenchymal stem cells, tendon injury, стволовые клетки, тендинит, десмит, лошади I ligament injury, horses
АННОТАЦИЯ
В период с 2008 по 2016 гг. было проведено местное введение аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) у 32 лошадей с острым и хроническим повреждением сухожилия поверхностного сгибателя пальца и среднего межкостного мускула. Материал для выделения и культивирования ММСК у лошадей получали из жировой ткани (23 лошади) и из костного мозга (9 лошадей). У 25 лошадей после введения ММСК наблюдалось полное возвращение к предыдущему уровню спортивной нагрузки (78%), без рецидива повреждения. У 4 лошадей после возвращения к интенсивному тренингу и нагрузкам наблюдалась повторная травма сухожилия. Наиболее быстрый и выраженный клинический эффект наступал у лошадей с острой травмой по сравнению с хроническим процессом. Также было отмечено, что наиболее полноценная регенерация сухожилия наблюдалась у лошадей с травмой поверхностного пальцевого сгибателя, в сравнении с повреждением среднего межкостного мускула.
SUMMARY
A retrospective study of 32 horses with acute and chronic superficial digital flexor tendon and suspensory ligament lesions evaluated their return to athletic function following treatment with adipose- (23 cases) and bone marrow derived stem cell therapy (9 cases) . Of horses with acute injuries, 25 horses (78 %) were able to return to their previous athletic performance. It was also noted that the most complete regeneration was observed in horses with superficial digital flexor tendon injury, compared with the suspensory ligament lesions.
ВВЕДЕНИЕ
Острое или хроническое повреждение сухожилий (тендинит) и связок (десмит) являются наиболее распространенными причинами ортопедических заболеваний лошадей, вызывающими хромоту [9, 10]. У лошадей наиболее часто встречается повреждение сухожилия по-
верхностного и/или глубокого сгибателей пальца, а также среднего межкостного мускула [9].
Основными причинами травм сухожилий у лошадей являются: внезапное растяжение сухожилий при резком сокращении мышц, ранний высокий уровень физической нагрузки и гипертермия сухожилия (до 45 0С) [11,
i Je
I \
Iii и fc
Забор костного мозга для культивирования мезенхимальных стволовых клеток
16]. Тендинит характеризуется микротравмой, разрывом сухожильных волокон и фибрилл, внутрисухожильными микрокровотечениями, приводящими к гибели теноци-тов и развитию асептического воспалительного процесса. Через несколько недель на месте поврежденных фибрилл образуется грануляционная фиброзная ткань (рубец), состоящая, в основном, из коллагена III типа [3, 18].
Лечение тендинита у лошадей зависит от возраста и пола, от времени и степени травмы, а также от уровня нагрузки. Классические методы лечения тендинита включают физиотерапию, применение высоких энергий ультразвуковых волн, медикаментозную терапию (нестероидные противовоспалительные, кортикостероидные препараты, гиалуроновая кислота, гликозаминогликаны) и хирургическое лечение [11]. К сожалению, ни один из перечисленных методов лечения не приводит к полному восстановлению поврежденного сухожилия. Кроме того, высока вероятность повторного развития заболевания [16]. В дополнение к традиционным методам лечения, в течение последних 20 лет в мире интенсивно применяются технологии регенеративной медицины, основанные на использовании собственных клеток из различных источников (костный мозг, жировая ткань, слизистые оболочки, периферическая кровь), которые вырабатывают биологически активные вещества и активируют процессы регенерации [1, 6, 9, 12].
В 2008 г. ветеринарная клиника «Новый Век» в сотрудничестве с «Центром ветеринарной клеточной медицины» впервые в Российской Федерации начала применять аутологичные ММСК при ортопедических заболеваниях лошадей. В этой статье описывается наш многолетний опыт и результаты применения ММСК при тендините и десмите лошадей.
Материалы и методы
В период с 2008 по 2016 гг. на базе ветеринарной клиники «Новый век», г. Москва, было осуществлено местное введение ММСК у 19 полукровных лошадей с острым или хроническим тендинитом поверхностного сгибателя пальца, а также у 13 лошадей с травмой среднего межкостного мускула. Диагноз травмы сухожилия и связки устанавливался на основании клинического и ультразвукового обследований животного. Степень тяжести и локализация травмы классифицировались на основе рекомендаций AAEP (American Association Equine Practitioners) [16].
Источником для выделения ММСК была жировая ткань (23 лошади) или костный мозг (9 лошадей). Подкожную жировую клетчатку объемом 2 см3 получали иссечением под местной анестезией седатированного животного в области основания хвоста (рис. 1). После чего немедленно помещали ее в специальную стерильную пробирку, заполненную транспортной средой (DMEM F12, 2% FBS (Bioind., США), 2 мМ L-глутамина (StemCeLL Technology, США), 200 ед/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина (Stem Cell Technology, США), 200 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл гентамицина) (см. рис. 1).
Костный мозг получали путем стернальной пункции между 4-6-й реберной вырезкой грудины специальной иглой (англ. Jamshidi needle) под седацией с соблюдением правил асептики (рис. 2). Объем эксфузии составлял около 10 мл костного мозга. Забор проводился в стерильную пробирку с 1 мл гепарина. Сразу после забора биоматериала (жир или костный мозг) стерильно упакованные пробирки направляли в лабораторию Центра ветеринарной клеточной медицины, где в течение 14-28 дней проводилось культивирование ММСК с целью получения терапевтической дозы. Выделение клеток проводилось по стандартной методике [22].
Взятие жировой ткани для культивирования мезенхимальных
стволовых клеток
Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток в лаборатории Центра ветеринарной клеточной медицины, г. Москва
Жировую ткань промывали стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (PBS (StemCeLL Technology, США) 0, обрабатывали раствором коллагеназы II типа (Sigma, США) в концентрации 0,15% 30 минут при 37 °С (рис. 3). По окончании инкубации ферментированную жировую ткань 2 раза промывали раствором Хартмана (Hemofarm, Сербия).
Мононуклеарные клетки костного мозга были получены центрифугированием разведенного в 3-5 раз эксфузата в градиенте плотности. Кольца ядросодер-жащих клеток собирали в одну пробирку и несколько раз промывали стерильным раствором фосфатно-соле-вого буфера (PBS). Полученный в результате клеточный осадок ресуспендировали средой для культивирования (MesenCult (StemCeLL Technology, США), 2мМ L-глутамина (StemCeLL Technology, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (StemCeLL TechnoLogy, США)), подсчитывали количество клеток и высевали в культу-ральные флаконы в плотности 3*105 ядросодержащих клеток на см2. Культивирование клеток проводили в течение 14-28 дней, при 37 °С, 5% СО2. Смену среды осуществляли каждые 3 дня. При достижении 70-80% конфлюэнтности клетки пассировали.
После достижения необходимого количества клетки снимали с культуральных флаконов с использованием раствора трипсин-ЭДТА (StemCeLL TechnoLogy, США), отмывали, концентрировали и ресуспендировали в финальном объеме 5 мл физиологического раствора в концентрации 1-5*106 клеток в 1 мл.
Перед выдачей клеточного продукта для применения проводили все необходимые тесты для подтверждения биологической безопасности препарата. Часть культуры оставляли на ответственное хранение в жидком азоте при температуре -196°C. Клеточный продукт стерильно упаковывался и вместе с индивидуальным паспортом достав-
лялся в ветеринарную клинику «Новый Век». Введение клеточного продукта проводилось под ультразвуковым контролем в область поврежденного сухожилия (рис. 4).
Лошади после введения ММСК назначался режим покоя и контролируемые нагрузки (сначала шаг на поводе, потом постепенно рысь и галоп) в течение 3-6 месяцев. В период реабилитации проводились регулярные клинические и ультразвуковые исследования (через 3, 6 и 12 месяцев после лечения). Степень нагрузки в реабилитационный период корректировалась в зависимости от степени восстановления сухожилия по данным ультразвукового исследования.
Результаты
В результате введения аутологичных ММСК в область поврежденного сухожилия не было отмечено побочных реакций и нежелательных явлений.
У двух лошадей при ультразвуковом исследовании были обнаружены мелкие оссификаты (патологические скопления кальция) около 1-2 мм в месте инъекции.
У 25 лошадей после введения ММСК наблюдалось полное возвращение к предшествующему травме уровню спортивной нагрузки, без рецидивов повреждения. Спустя 3 месяца после инъекции на ультразвуковом исследовании у большинства лошадей визуализировали частично заполненный дефект сухожилия (рис. 5). Через 6 месяцев дефект сухожилия у большинства лошадей мало чем отличался от интактного.
Необходимо отметить, что, по нашим данным, более быстрый и выраженный терапевтический эффект наблюдался у лошадей с острой травмой по сравнению с хроническим процессом. Также нами было отмечено, что наиболее быстрая и полноценная регенерация сухожилия наблюдалась у лошадей с травмой поверхностного пальцевого сгибателя в сравнении с повреждениями среднего межкостного мускула.
Было отмечено, что эффективнее и быстрее происходит заживление травмы сухожилия поверхностного сгибателя пальца в зоне 1А-2В по сравнению с повреждениями этого сухожилия в зоне 3А-3С (на уровне путового сустава). Другим словами, травма сухожилия, покрытого сухожильным влагалищем, является неблагоприятным прогностическим признаком. Не было отмечено никаких связей между исходом лечения и возрастом спортивной лошади, а также количеством вводимых ММСК и источником их получения (костный мозг или жировая ткань). Очевидно, что самое быстрое исчезновение хромоты и лучшая степень восстановления повреждений наблюдались у лошадей с наименьшей степенью травмы сухожилия и низкой степенью изначальной хромоты.
У двух лошадей с высокой степенью хронических травм среднего межкостного мускула и у одной лошади
с повреждением сухожилия поверхностного сгибателя пальца оставалась хромота по истечении одного года от момента применения ММСК.
У 4 лошадей после возвращения к интенсивному тренингу и нагрузкам наблюдалась повторная хроническая травма сухожилия (рецидив). У двух лошадей после исчезновения хромоты и возвращения в спорт было выявлено другое ортопедическое заболевание (киста копытной кости, артроз путового сустава), ввиду этого, для них невозможно в полной мере оценить эффективность применения ММСК.
Обсуждение
Сегодня наиболее хорошо изученными и наиболее широко применяемыми аутологичными клетками взрослого организма являются ММСК. Впервые описанные в костном мозге А.Я. Фриденштейном [23], впоследствии они были найдены и в жировой ткани [22], и в других тканях и органах. Клетки, по своим свойствам схожие с ММСК костного мозга, описаны в стенке капилляров (перициты) и адвентиции более крупных сосудов (суп-раадвентициальные стромальные клетки). Повсеместное присутствие ММСК в организме ставит вопрос об их функции. На настоящий момент большинство ученых сходятся во мнении, что ММСК - универсальные регуляторы регенерации, и необходимы для поддержания гомеостаза [5]. ММСК являются уникальными секреторными клетками, которые вырабатывают огромное количество биологически активных веществ (цитокины и ростовые факторы) и компонентов межклеточного матрикса. Спектр биологического действия веществ, вырабатывае-
Введение культуры мезенхимальных стволовых клеток
в поврежденное сухожилие под ультразвуковым контролем
мых ММСК, очень широк - они стимулируют образование новых капилляров (неоангиогенез), рост нервных окончаний, модулируют воспалительный и иммунный ответы, предотвращают клеточную гибель (апоптоз), стимулируют рост и дифференцировку резистентных стволовых клеток и клеток-предшественниц, вырабатывают вещества с антибактериальной активностью.
ММСК активно используются в клинических исследованиях для лечения различных заболеваний, таких как реакция «трансплантат против хозяина», ишемия нижних конечностей, сердечная недостаточность и ИБС, хроническая почечная и печеночная недостаточности и пр. Некоторые клеточные продукты находятся на финальных стадиях клинических испытаний (Osiris Therapeutics) или уже представлены на рынке США и Европы.
Согласно нашим результатам, применение ММСК у лошадей с тендинитом и десмитом дает положительные эффекты примерно в 80% случаев, с низкой частотой рецидивов заболевания. После введения ММСК в поврежденное сухожилие они за счет выработки специфических цитокинов подавляют процессы воспаления и апоптоза, запускают процессы дифференцировки в тено-циты, усиливают выработку коллагена I типа и снижают выработку коллагена III типа [2]. Как известно, коллаген типа III в сухожилии имеет значительно более низкий уровень организации (cross Linking), а также низкую степень эластичности по отношению к коллагену типа I [3]. Вероятно, что за счет изменения соотношения коллагенов I и III типов в зоне повреждения и более полного процесса регенерации по сравнению с формированием рубцовой ткани при стандартной терапии, после применения ММСК снижается вероятность рецидива травмы.
Полученные нами данные согласуются с опубликованными в литературе результатами аналогичных клинических исследований - применение ММСК позволяет добиться полной регенерации сухожилий в 70-90% случаев, в то время как процент рецидивов (ретравматизм) не превышает 18-27%. В то же время при классическом медикаментозном лечении частота рецидивов достигает 56% [8, 14, 17, 18]. Таким образом, ММСК сокращают время регенерации сухожилий незначительно, но при этом процесс регенерации проходит в полном объеме без формирования рубцов, что обуславливает значительное снижение рисков повторного повреждения [11, 16].
В исследовании VidaL и соавт. (2012) было показано, что ММСК костного мозга имеют более выраженный терапевтический эффект по сравнению с ММСК жировой ткани [21]. По нашим данным, такой разницы не наблюдается. По-видимому, описанный авторами эффект связан с различными условиями культивирования. Используемые Центром ветеринарной клеточной медицины протоколы для культивирования клеток полностью
Ультразвуковой снимок сухожилия поверхностного сгибателя пальца до и через 3 месяца после введения культуры мезенхимальных стволовых клеток.
соответствуют международным рекомендациям и основываются на использовании специально предназначенных для культивирования ММСК сред и сывороток. Все это позволяет гарантировать стабильное качество клеточных продуктов, содержащих ММСК, независимо от источника их получения, и их безопасность.
Полученные нами данные позволяют считать применение ММСК для лечения травм сухожилий у лошадей безопасным и клинически эффективным методом, основным результатом которого является полное восстановление структуры поврежденного сухожилия без образования рубцовой ткани и снижение риска повторной травмы.
ЛИТЕРАТУРА
1. De Mattos A. Use of adipose tissue derived mesenchymal stem cells for experimental tendinitis therapy in equines. Journal of Equine Veterinary Science January 2011; 31 (1): 26-34.
2. Barrachina L., Remacha A.R. Priming Equine Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells with Proinflammatory Cytokines: Implications in Immunomodulation-Immunogenicity Balance, Cell Viability, and Differentiation Potential. Stem Cells Dev. Nov 3, 2016.
3. Dahlgren L.A. Cloning and expression of type III collagen in normal and injured tendons of horses. Am J Vet Res. 2005; 66: 266-270.
4. De Schauwer C., Meyer E., Van de Walle G.R., Van Soom A. Markers of stemness in equine mesenchymal stem cells: a plea for uniformity. Theriogenology. 2011; 75 (8): 1431-43.
5. Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981; 292 (5819): 154-6.
6. Geburek F., Stadler P. Regenerative therapy for tendon and ligament disorders in horses. Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere. 2011; 39 (6): 373-3.
7. Georg R., Maria C., Gisela A., Bianca C. Autologous conditioned plasma as therapy of tendon and ligament lesions in seven horses. J Vet Sci. 2010; 11 (2): 173-5.
8. Godwin E.E., Young NJ., Dudhia J., Beamish I.C., Smith R.K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 2012; 44(1): 25-32.
9. Kovac M., Nowak M., Tambur Z. Frequency of orthopedic diseases in horses: A retrospective study. Vet Glasnik. 2002; 56 (5-6): 307-319..
10. Юэвач M. Новые методы диагностике и лечение заболеваний сухожилий лошади. Конный мир. 2009; 1-2.
11. Юэвач M. Ортопедические заболевания лошадей - современные методы диагностики и лечения. Королевский издательский дом, 2013.
12. tovac М., Сучков M., Алиев R. Применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, при лечении повреждения сухожилия глубокого сгибателя пальца лошади. Современная ветеринарная медицина. 2014; 1: 48-50.
13. Penny J., Harris P., Shakesheff K.M., Mobasheri A. The biology of equine mesenchymal stem cells: phenotypic characterization, cell surface markers and multilineage differentiation. Front Biosci. 2012; 17: 892-908.
14. Reed S.A., Leahy E.R. Stem cell therapy in equine tendon injury. J Anim Sci. 2013; 91 (1): 59-65.
15. Ricco S., Renzi S., Del Bue M. Allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in combination with platelet rich plasma are safe and effective in the therapy of superficial digital flexor tendonitis in the horse. Int J Immunopathol Pharmacol. 2013; 26(1 Suppl): 61-8.
16. Ross M.W., Dyson SJ. Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. 2003 Elsevier Inc.
17. Smith R.K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendi-nopathy. Disabil Rehabil. 2008; 30 (20-22): 1752-8.
18. Smith R. et al. Advances in the understanding of tendi-nopathies: a report on the Second Havemeyer Workshop on equine tendon disease. Equine Vet J. 2014; 46 (1): 4-9.
19. Torricelli P., Fini M., Filardo G., Tschon M. Regenerative medicine for the treatment of musculoskeletal overuse injuries in competition horses. Int Orthop. 2011; 35 (10): 1569-76.
20. Wouters G. Stem cell therapy in horses.Tijdschr Dierge-neeskd. 2012; 137 (12): 816-7.
21. Vidal M.A. et al. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem Cells Dev. 2012; 21 (2): 273-83.
22. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002 Dec; 13 (12): 4279-95.
23. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куралесова А.И. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротропных трансплантатов костного мозга. Цитология. 1968; 5: 557-67.
