Применение мультиплексного флуоресцентного иммуноанализа на биочипах для скрининга в аллергодиагностике: сопоставление результатов с тест-системами mast-cla и allerg-o-liq

Смолдовская О.В.; Волошин С.А.; Фейзханова Г.У.; Арефьева А.С.; Филиппова М.А.; Масленников В.В.; Резников Ю.П.; Заседателев А.С.; Рубина А.Ю.

Смолдовская О.В.1, Волошин С.А.1, Фейзханова Г.У.1, Арефьева А.С.1, Филиппова М.А.1, Масленников В.В.2, Резников Ю.П.2, Заседателев А.С.1, Рубина А.Ю.1

ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА НА БИОЧИПАХ ДЛЯ СКРИНИНГА В АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКЕ: СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ С ТЕСТ-СИСТЕМАМИ MAST-CLA И ALLERG-O-LIQ

1ФГБУ Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), 119991, г Москва; 2ФГБУ Центральная клиническая больница с поликлиникой Управления делами Президента РФ, 119359, г Москва

В предлагаемом исследовании проведено сравнение прототипа тест-системы аллерго-биочип, разработанной в ИМБ РАН, с двумя коммерческими тест-системами: реверсивным аллергосорбентным тестом ALLERG-O-LIQ (Specific IgE REAST, Dr. Fooke Laboratorien GmbH, Германия) и мультиплексным аллергосорбентным тестом MACT-CLA (Hitachi, США). На аллерго-биочипах был проведен анализ 205 образцов сывороток крови пациентов, охарактеризованных с помощью ALLERG-O-LIQ, и 221 образца сыворотки крови, охарактеризованных с помощью MAST-CLA. При сопоставлении результатов анализа на биочипе с результатами, полученными на ALLERG-O-LIQ, линейный взвешенный коэффициент согласия каппа Коэна (к) был равен 0,718, площадь под ROC-кривой - 0,943. При сравнении полученных данных на аллерго-биочипе относительно MAST-CLA к равен 0,586, площадь под ROC-кривой - 0,813. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что аллерго-биочип может быть использован для мультиплексного скрининга широкой панели специфических IgE к аллергенам и их компонентам наряду с другими коммерческими тест-системами.

Ключевые слова: гидрогелевые микрочипы; аллергодиагностика; аллерген-специфические IgE; мультиплексный in vitro анализ.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(6): 358-362.

Smoldovskaya O.V.1, Voloshin S.A.1, Feyzkhanova G.U.1, ArefievaA.S.1, FilippovaM.A.1, Maslennikov V.V.2, Reznikov Yu.P.2, Zasedatelev A.S.1, Rubina A.Y.1

APPLICATION OF MULTIPLEX FLUORESCENT IMMUNOASSAY BIOCHIPS FOR SCREENING IN ALLERGO-LOGICAL DIAGNOSTICS: COMPARISON OF RESULTS WITH TEST SYSTEMS MAST-CLA AND ALLERG-O-LIQ 'Y A. Engelgardt Research Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences (1MB RAS), 119991, Moscow; 2Cen-tral Clinical Hospital with Polyclinic, Administrative Department of the President of Russian Federation, 119359, Moscow We have compared the prototype of Allergobiochip test system (developed at IMB RAS) with two commercial test systems: ALLERG-O-LIQ reverse allergosorbent test (Specific IgE REAST, Dr. Fooke Laboratorien GmbH, Germany) and MAST-CLA multiplex allergosorbent test (Hitachi, USA). The analysis of 205 human serum samples, characterized by ALLERG-O-LIQ, and 221 serum samples, characterized by MAST-CLA, has been carried out on the allergochips. Comparison of biochip analysis results with the results obtained on ALLERG-O-LIQ test-system showed that linear weighted Cohen's kappa (к) coefficient of concordance was equal to 0.718, the area under the ROC-curve (AUC) — 0.943. When comparing the data obtained on allergochips with MAST-CLA results: к was equal to 0.586, the AUC — 0.813. The data obtained suggest that the allergochips along with other commercial test-systems could be used for multiplex screening of a broad panel of specific IgE to allergens and their components.

Keywords: hydrogel microchips; allergy diagnostics; allergen-specific IgE, sIgE; multiplex in vitro analysis; microarray.

citation: Immunologiya.2015; 36(6): 358-362.

Ранее была показана актуальность создания метода in vitro аллергомониторирования, способного достойно заменить радиоаллергосорбентный тест (РАСТ), и по возможности лишенного присущих РАСТ недостатков [1].

В настоящей работе представлены результаты первого этапа адаптации технологии мультиплексного анализа на основе использования трехмерных гидрогелевых биочипов для ал-лергодиагностики. Ряд приложений для лабораторной диагностики на основе данной технологии уже внедрены в практику [2, 3]. В отличие от технологии планарных микрочипов, технология трехмерных гидрогелевых биочипов дает возможность проводить иммобилизацию как рекомбинантных белков, так и полнобелковых экстрактов аллергенов, что позволяет уменьшить число ложноотрицательных результатов.

Нами проведено сравнение прототипа тест-системы аллерго-биочип, разработанной в ИМБ РАН с двумя коммерческими тест-системами: реверсивным аллергосорбентным тестом ALLERG-O-LIQ (Specific IgE REAST, Dr. Fooke Labo-

Для корреспонденции: рубина А.Ю., [email protected] For correspondence: Rubina A.Yu., [email protected]

ratorien GmbH, Германия) и мультиплексным аллергосорбентным тестом MACT-CLA (Hitachi, США).

Материал и методы

В работе использованы реактивы: поливинилпирролидон 360 000 Да, поливиниловый спирт 50 000 Да, Tween-20, се-фадекс G-25 coarse (Sigma, США), Bind Silane (Amersham Pharmacia Biosciences, США), N-гидроксисукцинимидный эфир Cy5 (GE Healthcare, Великобритания). Экстракты аллергенов, антитела IgE, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса Е (anti-IgE), набор калибровочных проб Quantitative Reference system for Spec. IgE-FL получены от Dr. Fooke Laboratorien GmbH, Германия. Химические реагенты были получены из коммерческих источников и использовались без дополнительной очистки.

Использованы следующие буферные растворы: PBS (0,01 M фосфатный буфер, pH 7,2, 0,15 М NaCl), PBST (PBS, 0,1% Tween-20). Растворы готовили, используя деионизован-ную воду MilliQ (Millipore, США).

Для изготовления биочипов использованы стеклянные подложки фирмы Corning, США (Corning 2947 Micro Slides), обработанные Bind Silane.

Рис. 1. Схема расположения антигенов на биологических микрочипах.

а - аллерго-биочип 1; б - аллерго-биочип 2; в - калибровочный биочип. 1-40 - экстракты аллергенов и рекомбинантные белки (см. табл. 1), Е - антивидовые апй-^Е, G - гелевые ячейки, не содержащие белков, М - маркерные ячейки.

Очистку конъюгатов антител проводили на хроматогра-фических колонках Micro Bio-Spin Laboratories (Bio-Rad, США).

Образцы сывороток крови охарактеризованы с помощью тест-системы MAST-CLA (панели «Российская I расширенная» или «Российская II короткая») или с использованием наборов для определения sIgE ALLERG-O-LIQ.

Изготовление биочипов

Изготовление биочипов проводили по разработанной в ИМБ РАН методике [4]. В работе использовали биочипы с иммобилизованными аллергенами для анализа образцов сывороток крови (аллерго-биочип 1 и аллерго-биочип 2) (табл. 1), а также калибровочные биочипы с гелевыми элементами, содержащими антитела anti-IgE, для анализа калибровочных проб (образцов, содержащих известное количество общего IgE) и построения калибровочной кривой. Каждый белок был иммобилизован в 4 повторах с целью повышения воспроизводимости анализа (рис. 1).

Анализ образцов с помощью коммерческих тест-систем

Анализ сывороток крови с использованием тест-систем MAST-CLA и ALLERG-O-LIQ был проведен по методикам, описанным в инструкциях производителей: 205 образцов сывороток крови были охарактеризованы с помощью ALLERG-O-LIQ и проанализированы на аллерго-биочипе 1; 221 образец сывороток крови охарактеризован с помощью тест-системы MAST-CLA и проанализирован на аллерго-биочипе 2.

Получение конъюгатов антивидовых антител с красителем Cy5

К 75 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в 0,01 М би-карбонатном буфере, рН 9,5) добавляли 1 мкл раствора N-гидроксисукцинимидного эфира Су5 (2 мг/мл в диметил-формамиде). Реакцию проводили при 22°С в течение 1 ч в темноте при перемешивании (550 об/мин). Очистку конъю-гата антител с Cy5 от непрореагировавшего красителя проводили гельфильтрацией на Micro Bio-Spin колонке, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной PBS буфером.

а

• »

• • • •

j

п

# *

Рис. 2. Пример флуоресцентного изображения аллерго-биочипа 2 после анализа сывороток крови здорового донора (а) и пациента с аллергическим заболеванием (б).

9 30 1

Аллергены, входящие в состав аллерго-биочипов

1 10 Концентрация, МЕ/мл

100

Рис. 3. Калибровочная кривая для расчета концентрации sIgE в образцах сывороток крови на биочипе.

Каждая калибровочная проба была проанализирована трижды, точки на графике соответствуют среднему арифметическому значению сигналов флуоресценции, полученных при анализе соответствующей калибровочной пробы.

Мультиплексный анализ образцов на биологических микрочипах

60 мкл сыворотки крови инкубировали на аллерго-биочипе или 60 мкл калибровочной пробы с известной концентрацией общего ^Е инкубировали на калибровочном биочипе 20 ч при 37°С. После отмывки в PBST (20 мин) на ячейки наносили 50 мкл раствора конъюгата апй-^Е - Су5 (рабочая концентрация 10 мкг/мл), инкубацию проводили при 37°С в течение 1 ч в темноте. После финальной отмывки в PBST (30 мин) регистрировали сигналы флуоресценции.

Измерение сигналов флуоресценции

Измерение сигналов флуоресценции Су5 конъюгирован-ного с проявляющими антителами проводили с помощью портативного флуоресцентного анализатора биочипов (ИМБ РАН, Москва) с лазерным возбуждением с использованием фильтров 650/670 нм [5].

Обработка и интерпретация результатов анализа

Обработку и интерпретацию результатов анализа проводили с помощью разработанного в ИМБ РАН программного обеспечения «ImageAssay» [6].

После получения флуоресцентного изображения биочипа (рис. 2) проводили расчет интенсивностей сигналов флуоресценции от каждой ячейки [6]. Результирующие значения ин-тенсивностей флуоресценции от ячеек с иммобилизованными аллергенами и антителами рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов.

Определения концентраций sIgE проводили пересчетом сигналов флуоресценции от ячеек с иммобилизованными аллергенами по калибровочной кривой (рис. 3). Построение калибровочной кривой проводили на основе значений интен-сивностей флуоресценции, полученных при анализе калибровочных проб.

Статистическая обработка данных

Расчет линейного взвешенного коэффициента согласия каппа Коэна к [7] и построение ROC-кривой проводили с по-

Классы

Концентрация, МЕ/мл <

10111 2 1 3 1 4 | 5 1 6 | ALLERG-O-LIQ

10111 2 | 3 4 П MAST CLA

|—Н—1-1-1-1-► Аллерго-биочил

Аллерген Аллерго- Аллерго-

Код Название биочип i биочип 2

t2 Ольха серая x x (I)

t3 Береза белая x x (I)

bet vi Рекомбинантный аллерген березы белой x x

bet v2 Рекомбинантный аллерген березы белой x x

t4 Лещина обыкновенная (орешник) x

t7 Дуб белый x

w5 Полынь горькая x

w6 Полынь обыкновенная x x (I,II)*

w8 Одуванчик лекарственный x (I)

g2 Свинорой пальчатый (бермудская трава) x

g3 Ежа сборная x (I)

g4 Овсяница луговая x (I)

g5 Райграс пастбищный (плевел) x

g6 Тимофеевка луговая x x (I)

phl pi Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой x

phl p5 Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой x

phl p7 Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой x

phl p12 Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой x

g12 Рожь посевная x x

ei Кошка (эпителий) x x (I,II)

fel di Рекомбинантный аллерген кошки (эпителий) x x

e5 Собака (эпителий) x x (I,II)

di Dermatophagoides pteronyssinus x x (I,II)

der pi Цистеиновая протеаза Dermatophagoides pteronyssinus x x

d2 Dermatophagoides farinae x x (I,II)

der fi Цистеиновая протеаза Dermatophagoides farinae x x

m6 Alternaria tenuis x

fi Яичный белок x x (I,II)**

f2 Коровье молоко x x (I,II)

f76 а-лактальбумин коровьего молока x

f77 ß-лактоглобулин коровьего молока x

f78 Казеин коровьего молока x

f3 Треска атлантическая x (I,II)

f4 Пшеничная мука x x (I)

fi3 Арахис x x

ara h2 Конглютин арахиса x

fi7 Фундук x x (I)

f3i Морковь x (I)

mal di PR-Ш-подобный белок яблока x (I)***

i6 Рыжий таракан (пруссак) x (I,II)

Рис. 4. График соответствия классов ALLERG-O-LIQ, MAST CLA и концентрации, выраженной в МЕ/мл.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Уровни sIgE к аллергенам, входящим в состав аллерго-биочип 1, определены на системе ALLERG-O-LIQ. Уровни sIgE к отмеченным аллергенам, входящим в состав аллерго-биочип 2, определяли с помощью MAST-CLA: I - отмечены аллергены, входящие в состав панели «Российская I расширенная» MAST-CLA, I, II - аллергены, входящие в состав панелей «Российская I расширенная» и «Российская II короткая» MAST-CLA.

* - Уровень sIgE к аллергену w6 аллерго-биочипа 2 сравнивается с уровнем sIgE к аллергену «полынь - смесь», присутствующему на панелях MAST-CLA, ** - уровень sIgE к аллергену f1 аллерго-биочипа 2 сравнивается с уровнем sIgE к аллергену «яйцо цельное», присутствующему на панелях MAST-CLA, *** - уровень sIgE к mal d1 аллерго-биочипа 2 сравнивается с уровнем sIgE к аллергену «яблоко», присутствующему на панелях MAST-CLA.

Аллерго-биочип, класс

ALLERG-O-LIQ, класс 0 1 2 3 4 5 6

0 289 45 24 1

1 10 11 15 1

2 12 24 71 39 5

3 4 3 42 78 18 1 1

4 2 23 30 1 9

5 3 17 8

6 5 11 11

100 4

¡3 о г

т

20 40 60 80 100%-специфичность, %

100

Рис. 5. Сравнение прототипа тест-системы аллерго-биочип 1 для мультиплексного определения специфических IgE и реверсивного аллерго-сорбентного теста ALLERG-O-LIQ (Specific IgE REAST, Германия).

а - распределение по классам результатов анализа сывороток на набор специфических IgE; б - ROC-кривая.

мощью программы MedCalc version 15.2.2. Интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с классификациями, приведенными в [8] и [9].

результаты и обсуждения

При изготовлении аллерго-биочипов были использованы экстракты аллергенов, рекомбинантные аллергены и проявляющие антитела, полученные от компании Dr. Fooke Laboratorien GmbH, поэтому тест-система ALLERG-O-LIQ производства компании Dr. Fooke Laboratorien GmbH была нами выбрана в качестве основного референсного метода.

В качестве второй системы сравнения была выбрана MAST-CLA, поскольку данная тест-система является одним из наиболее распространенных и коммерчески доступных методов мультиплексной аллергодиагностики в России.

Для проведения исследований было изготовлено три типа биочипов: аллерго-биочип 1, содержащий 21 иммобилизованный аллерген; аллерго-биочип 2, содержащий 38 иммобилизованных аллергенов и калибровочные биочипы, содержащие иммобилизованные антивидовые антитела против иммуноглобулинов класса Е (anti-IgE). Калибровочные биочипы использовали для построения калибровочной кривой -графика зависимости сигнала флуоресценции от концентра-

ции ^Е в калибровочной пробе, по которому рассчитывали концентрации sIgE, определяемые на аллерго-биочипах 1 и 2 (см. рис. 1). Перечень аллергенов, входящих в состав биочипов, приведен в табл. 1.

В качестве метода анализа нами был выбран сэндвич-иммуноанализ с флуоресцентной регистрацией сигналов. В процессе инкубации сыворотки на биочипе в ячейках с иммобилизованными аллергенами происходит образование специфических комплексов антиген - sIgE. Одновременное определение совокупности образовавшихся комплексов всех присутствующих в образце sIgE с соответствующими им аллергенами проводили после инкубации биочипа с антивидовыми антителами anti-IgE, несущими флуоресцентную метку (краситель цианиновый-5, Су5). Сигналы флуоресценции тройных комплексов аллерген - sIgE - anti-IgE-Cy5 детектировали с помощью разработанного в ИМБ РАН анализатора биочипов. Расчеты концентраций sIgE проводили по калибровочной кривой (см. рис. 3) с помощью специального разработанного в ИМБ РАН программного обеспечения <Лт-ageAssay». Пример флуоресцентного изображения биочипов после анализа представлен на рис. 2.

На аллерго-биочипе 1 был проведен анализ 205 образцов сывороток крови, охарактеризованных с помощью ALLERG-O-

а

Аллерго-биочип, класс

8 со 0 1 2 3 4

0 2910 156 17 6

5 1 180 50 7 3 1

о 1- сп < 2 52 26 14 5

3 14 18 5 11 3

4 11 22 25 57 67

б

100%-специфичность, %

Рис. 6. Сравнение прототипа тест-системы аллерго-биочип 2 для мультиплексного определения специфических IgE и множественного аллер-госорбентного теста с применением хемилюминесцентного анализа (МА8Т-^А, США). а - распределение по классам результатов анализа сывороток на набор специфических IgE; б - ЯОС-кривая.

LIQ. Результаты анализа образцов были распределены по классам в зависимости от измеренной концентрации sIgE: 0 класс

- менее 0,35 ME/мл, 1 класс - 0,35-0,7 МЕ/мл, 2 класс - 0,7-3,5 МЕ/мл, 3 класс - 3,5-17,5 МЕ/мл, 4 класс - 17,5-50 МЕ/мл, 5 класс - 50-100 МЕ/мл, 6 класс - более 100 МЕ/мл (рис. 4).

Распределение по классам для аллерго-биочипа 1 и AL-LERG-O-LIQ приведено на рис. 5, а. Взвешенный коэффициент согласия к равен 0,718 (стандартное отклонение: 0,012, 95% доверительный интервал: 0,694-0,743), что соответствует хорошей степени согласия [8] между тест-системами. Площадь под ROC-кривой (см. рис. 5, а) оказалась равной 0,943, что дало право заключить об отличном качестве диагностического теста [9].

Для качественной оценки работы системы были рассчитаны значения чувствительности и специфичности аллерго-биочипа относительно ALLERG-O-LIQ. Они составили 94 и 80% соответственно.

Незначительные отличия в полученных результатах мы объяснили разными схемами анализа: принцип реверсивного ИФА анализа, используемый в системе ALLERG-O-LIQ, подразумевает первичное взаимодействие специфических IgE из сыворотки с anti-IgE антителами, сорбированными в лунке планшета. Дальнейшая инкубация с биотинилированными аллергенами позволяет обеспечить их связывание исключительно с sIgE. Аллерго-биочип - прямая система, в которой сначала происходит связывание специфических иммуноглобулинов всех классов с экстрактом аллергена, иммобилизованным в ячейке, а затем образование комплекса sIgE - anti-IgE-Cy5, который в дальнейшем и детектировался прибором. Такой порядок связывания не исключает взаимную конкуренцию между аллерген-специфическими IgE и иммуноглобулинами других классов.

Во второй тест-системе сравнения MAST-CLA результаты измерения выражались в люминесцентных единицах (LU) и распределялись по 4 классам: класс 0 (менее 0,35 МЕ/мл) -0-26 LU, класс 1 (0,35-0,7 МЕ/мл) - 27-65 LU, класс 2 (0,7-3,5 МЕ/мл) - 66-142 LU, класс 3 (3,5 - 17,5 МЕ/мл) - 143-242 LU, класс 4 (более 17,5 МЕ/мл) - 243-300 LU (см. рис. 4).

С помощью аллерго-биочипа, содержащего расширенную панель аллергенов (аллерго-биочип 2), нами был проанализирован 221 образец сыворотки крови пациентов, 145 из которых были также охарактеризованы с помощью панели «Российская I расширенная» MAST-CLA, а 76 - с помощью панели «Российская II короткая» MAST-CLA. При расчете параметров сравнения двух тест-систем учитывали данные, полученные для общих аллергенов, присутствующих как в панелях MAST-CLA, так и на биочипе (см. табл. 1). Перевод из МЕ/мл в классы для аллерго-биочипа проводили в соответствии с классификацией, принятой для MAST-CLA (см. рис. 4).

Полученное распределение результатов анализа на двух системах по классам представлено на рис. 6, б. Рассчитанная по полученным данным чувствительность и специфичность аллерго-биочипа относительно MAST-CLA составила 56 и 94% соответственно, взвешенный коэффициент согласия к равен 0,586 (стандартное отклонение 0,017; 95% доверительный интервал 0,552-0,620), что говорит об умеренной степени согласия между тестами. Результаты ROC-анализа (рис. 6, а) свидетельствуют о хорошем качестве теста (площадь под кривой 0,813).

Как видно из приведенных данных, результаты анализа образцов на аллерго-биочипе лучше согласуются с результатами, полученными на ALLERG-O-LIQ, чем с результатами, полученными для MAST-CLA, что неудивительно, поскольку в системах аллерго-биочип и ALLERG-O-LIQ использованы исходные материалы от одного производителя.

Известно, что результаты аллергодиагностики in vitro и in vivo могут не совпадать [1]. Так, например, по данным [10] для ингаляционных аллергенов чувствительность MAST-CLA меняется в диапазоне от 67 до 100%, а специфичность

- от 36 до 81% для разных аллергенов по сравнению с результатами кожного тестирования.

Проведенные нами исследования позволяют сделать вывод о том, что мультиплексное определение панели аллерген-специфических IgE с помощью биологических микрочипов

открывает перспективу выявить максимально возможный их спектр в малом объеме образца, при этом достоверность получаемых результатов во многом зависит от качества используемого сырья.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-50-00060).

ЛИТЕРАТУРА

1. Резников Ю.П., Масленников В.В., Полякова В.И., Игнатьева Г.А. In vitro аллергомониторирование: к оценке чувствительности методов. Иммунология. 2015; 2.

2. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V., Nasedkina T., Rubina A., Savvateeva E. et al. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. Expert Review of Molecular Diagnostics. 2011; 11(8): 839-53.

3. Feyzkhanova G.U., Filippova M.A., Talibov V.O., Dementieva E.I., Maslennikov V.V., Reznikov Y.P. et al. Development of hydrogel biochip for in vitro allergy diagnostics. J. Immunol. Methods. 2014; 406: 51-7.

4. Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E. et al. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. BioTechniques. 2003; 34: 1008-22.

5. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A. et al. Fluorescence data analysis on gel-based biochips. J. Biomol., Screening. 2002; 7: 247-57.

6. Zubtsova Z.I., Zubtsov D.A., Savvateeva E.N., Stomakhin A.A., Chechetkin V.R., Zasedatelev A.S. et al. Hydrogel-based protein and oligonucleotide microchips on metal-coated surfaces: enhancement of fluorescence and optimization of immunoassay. J. Biotechnol. 2009; 144(2): 151-9.

7. Altman D.G. Practical statistics for medical research. London: Chapman and Hall; 1991.

8. Landis J.R., Koch G.G. An application of hierarchical kappa-type statistics in the assessment of majority agreement among multiple observers. Biometrics. 1977; 33: 363-74.

9. http://www.basegroup.ru/library/analysis/regression/logistic

10. Nepper-Christensen S., Backer V., DuBuske L.M., Nolte H. In vitro diagnostic evaluation of patients with inhalant allergies: summary of probability outcomes comparing results of CLA- and CAP-specific immunoglobulin E test systems. Allergy. AsthmaProc. 2003; 24: 253-8.

Поступила 21.04.15

REFERENCES

1. Reznikov Yu.P., Maslennikov V.V., Polyakova V.I., Ignat'eva G. A. In vitro alargamientodepene: to assess the sensitivity of the methods. Immunologiya. 2015; 2.