CC BY
64
УДК 616-035
С. В. Низкодубова, Т. В. Ласукова, С. А. Легостин
ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПИДОВ САПРОПЕЛЯ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЗМА ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ТОКСИКО-ХИМИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
Приводятся экспериментальные данные о гепатостимулирующем и адаптогенном эффекте аппликаций суммарного липидного экстракта сапропеля и его полярной фракции в процессе развития токсико-химическо-го гепатита.
Ключевые слова: липиды сапропеля, фосфолипиды, энергетический метаболизм, токсико-химический гепатит.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из задач современной физиологии и курортологии является коррекция секреторной функции пищеварительного тракта, в том числе гепато-билиарной системы путем применения природных лечебных грязей, а также исследование нейрогумо-ральных механизмов их действия на организм. В этом аспекте особое значение придают преформи-рованию природных лечебных сред (пелоидов, минеральных вод) с целью выяснения роли отдельных классов химических соединений в механизме их лечебных эффектов. Такие исследования перспективны в плане создания новых препаратов на основе природного некондиционного сырья с дальнейшим использованием во внекурортных условиях.
В работах ряда авторов показано, что лечебный эффект пелоидов определяется преимущественно органическими и неорганическими компонентами их жидкой фазы, к числу которых относятся гуми-новые и фульвовые кислоты [1, 2]. Однако более глубокие исследования физико-химических свойств лечебных грязей различного происхождения (сульфидные, морские, торфяные, сапропели) показали наличие органических биологически активных соединений в их липидорастворимой фракции. Некоторые из этих веществ обнаруживали бактерицидные, противовоспалительные свойства [3, 4]. В то же время роль этих соединений в механизмах общего и специфического действия пелоидов, в частности сапропелевых грязей, практически не изучена.
В связи с этим цель настоящей работы заключалась в исследовании гепатопротективных эффектов липидных экстрактов сапропеля на модели ток-сико-химического гепатита.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 90 белых крысах-самцах линии Вистар массой 180-240 г, которых содержали в стандартных условиях вивария. В соответствии с поставленной целью животные были разделены на 6 групп: 1 - интактные (фон); 2 - острое отравление СС14 (гепатит); 3 - гепатит без последующего воздействия в течение 10 дней (контроль); 4 - гепатит с аппликациями 1 % масляного
раствора хлороформной (полярной) фракции липидной фракции экстракта сапропеля; 5 - гепатит с аппликациями 0,3 % масляного раствора гексано-вой (неполярной) фракции липидного экстракта; 6 - гепатит с аппликациями 2 % масляного раствора суммарного липидного экстракта сапропеля. Токси-ко -химический гепатит моделировали путем 3-кратного подкожного введения 50 % СС14 в вазелиновом масле в течение 10 дней в дозе 0,45 мл/г массы [5]. Продолжительность ежедневных аппликаций растворами липидов сапропеля составляла 20 мин, исследуемое вещество наносили на выстриженную поверхность спины подопытных крыс.
По окончании эксперимента животных декапи-тировали под эфирным наркозом. Из образцов ткани печени выделяли митохондрии методом дифференциального центрифугирования при 2-4 °С в средах, содержащих 0,145 М КСІ и 0,25 М сахарозу при рН 7,4. В полученной митохондриальной фракции определяли активность сукцинатдегидро-геназы СДГ (КФ 1.3.99), НАД-зависимой малатде-гидрогеназы - МДГ (КФ 1.1.1. 37), НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы - ГДГ (КФ 1.4.1.3). В тканевом гомогенате определяли содержание суммарных фосфолипидов и соотношение их фракций. Общее содержание фосфолипидов, экстрагированных по методу Фолча [6], оценивали по концентрации окрашенного комплекса с роданидом железа. Фракции фосфолипидов получали методом одномерной тонкослойной хроматографии в системе хлоро-форм-метанол-вода-н-гептан (65 : 25 : 4 : 9) на пластинах «Силуфол-254» (20 х 20 см). Хроматографию проводили в стеклянной камере, насыщенной парами растворителя, до высоты фронта 16 см. Полученные хроматограммы проявляли с помощью 10 % раствора фосфомолибденовой кислоты в ацетоне [7]. В гомогенатах печени определяли содержание малонового диальдегида [8], в сыворотке крови - активность глутатионредуктазы [7].
Для электронно-микроскопического исследования фрагменты печени фиксировали в охлажденном до 4 °С 2,5 % растворе глутарового альдегида в фосфатном буфере (рН 7,4). После обработки осмием обезвоженные образцы печени заливали в
аралдит. Полутонкие срезы окрашивали щелочным раствором толуидинового синего, ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на электронном микроскопе «1еш-100 СХ» и фотографировали при увеличении в 35 000 раз.
Статистическую значимость различий полученных результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического ^-критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Применение СС14 сопровождалось развитием тяжелого токсико-химического гепатита с выраженными изменениями активности митохондриальных ферментов. Из представленных в таблице данных видно, что активность СДГ возросла в 2,8 раза, а МДГ снизилась в 2,75 раза по сравнению с фоном. Особенно заметным оказалось угнетение активности ГДГ - в 35 раз.
Относительное содержание суммарных фосфолипидов снижалось в среднем на 20 %. Характерные изменения наблюдались и в составе фракций фосфолипидов. Так, доля кислых фосфатидов (ли-зофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, кардиолипин) возросла с 20,1 до 51,3 %. При этом относительное содержание нейтральных фосфатидов (сфингомиелин, фосфа-тидилхолин, фосфатидилэтаноламин) сократилось почти в 2 раза (рис. 1).
Результаты электронно-микроскопического исследования позволили следующим образом охарактеризовать картину отравления СС14 (рис. 2).
Токсическое воздействие выражалось резким расширением цистерн эндоплазматической сети (ЭПС), снижением количества прикрепленных рибосом и полирибосом (рис. 2). Митохондрии бес-структурны, их наружные мембраны повреждены, кристы почти не видны, в матриксе - миелиноподобные структуры. Описанное состояние митохондрий характеризуется как слабосопряженное [9].
Подвергаясь метаболизму в микросомальной системе печени, СС14 инициирует цепь реакций свободнорадикального окисления в структурах клеточных мембран, что приводит к нарушению их липидного бислоя. Развивается так называемый «синдром цитолиза», который сопровождается высвобождением лизосомальных ферментов, нарушением структуры трансмембранных ферментов, разобщением процессов дыхания и окислительного фосфорилирования, инактивацией микросо-мальной системы электронного транспорта [10].
В контрольной группе животных состояние паренхимы печени характеризовалось рядом особенностей, которые можно расценивать как компенсаторно-приспособительные. Наряду с выраженным угнетением активности ГДГ и стойким снижением содержания суммарных фосфолипидов регистрировалось двукратное возрастание активности МДГ и
Динамика активности митохондриальных ферментов и содержание продуктов ПОЛ при применении суммарного липидного экстракта липидов сапропеля и его фракций на фоне токсико-химического
гепатита
Группа животных СДГ, нмоль сукци-ната/(мин ■ мг белка) МДГ ГДГ Малоновый диальдегид Глутатион- редуктаза
нмоль НАД+/(мин ■ мг белка) нмоль/мг белка МЕ/мл
Фон 9,18 ± 0,84 614 ± 80 930 ± 49 6,9 ± 0,171 28,4 ± 4,2
СС14-гепатит 25,9 ± 2,22 223 ± 37 26,6 ± 4,1 5,6 ± 0,4 160 ± 28
P <0,001 <0,01 <0,001 <0,05 <0,01
Контроль 15,9 ± 1,56 476 ± 36 21,3 ± 3,3 14,3 ± 0,3 118,2 ± 20
р <0,01 <0,05 <0,001 <0,05 <0,01
р2 <0,02 <0,01 >0,2
СС14-гепатит +
полярные липиды 7,32 ± 1,50 657 ± 76 30,9 ± 4,6 7,9 ± 0,16 43,3 ± 7,2
р >0,3 >0,5 <0,002 0,5 <0,05
р1 <0,01 <0,05 >0,1 <0,02 <0,01
СС14-гепатит +
неполярные липиды 16,3 ± 1,78 523 ± 42 27,3 ± 4,6 - -
р <0,01 >0,1 <0,001
р1 >0,5 >0,5 >0,3
СС14-гепатит + суммарные липиды р р1 11,8 ± 2,34 >0,5 <0,05 600 ± 71 >0,5 <0,05 731 ± 49 <0,02 <0,001 9,8 ± 0,24 >0,1 <0,05 57 ± 7,1 <0,05 <0,01
Примечание. р - достоверность по отношению к фону; р1 - достоверность по отношению к контролю; р2 - достоверность отличий группы контроля от группы «СС14-гепатит».
снижение активности СДГ в 1,6 раза относительно серии с острым отравлением СС14. Отмечалось заметное (до 41,8 %) уменьшение доли кислых фосфолипидов. Аналогичная картина выявлена и при электронно-микроскопическом исследовании. Наряду с массивными каплями жира и бесструктурными участками цитоплазмы видна заметно активированная гранулярная ЭПС, встречаются митохондрии измененной формы. В то же время в просвете желчных канальцев видны миелиноподобные структуры, присутствие которых свидетельствует о наличии выраженного холестаза. Пластинчатый аппарат был редуцирован.
Рис. 1. Хроматограмма фракций фосфолипидов печени крыс при отравлении СС14 и курсовом применении полярной фракции липидного экстракта сапропеля. Окраска фосфорномолибденовой кислотой. С - старт; Ф - фронт. Римскими цифрами обозначены группы животных. НЛ - нейтральные липиды; ЖК - жирные кислоты
Курсовое применение аппликаций масляных растворов липидного экстракта сапропеля и его фракций на фоне гепатита сопровождалось весьма разнообразными эффектами. Так, аппликация по-
лярной фракции (серия 4) способствовала нормализации активности СДГ и МДГ до фоновых значений, в то время как активность ГДГ практически не изменялась (таблица). Содержание суммарных фосфолипидов также оставалось достоверно сниженным, в то время как соотношение кислых и нейтральных фосфолипидов возвращалось к норме (таблица, рис. 1). Структура гепатоцитов также восстанавливалась, причем большая часть клеток уже не отличалась от нормы. Количество митохондрий при визуальной оценке представлялось увеличенным, мембраны сохраняли свою целостность, хотя кристы часто были фрагментированы. Такое состояние митохондрий характеризовалось как лабильно сопряженное (рис. 3, А).
Аппликация неполярной фракции, напротив, мало способствовала стабилизации процесса. В этой группе чаще, чем в контрольной, встречались митохондрии с различными вариантами деструкций, отсутствовали признаки компенсаторно-приспособительных реакций (таблица, рис. 3, Б).
Курс аппликаций суммарных липидов сапропеля сопровождался нормализацией почти всех рассматриваемых показателей. Исключением была ГДГ, активность которой оставалась достоверно сниженной относительно фона на 19-21 %. Уль-траструктура гепатоцитов почти полностью восстанавливалась, хотя в части клеток сохранялись расширенные цистерны ЭПС (рис. 3, В).
Таким образом, в процессе развития токсико-химического гепатита весьма уязвимыми оказываются митохондрии. Ферменты, участвующие в энергообразовании, как правило, являются мембраносвязанными, а их каталитическая активность в значительной степени определяется физико-химическим состоянием мембран [11]. Кроме того, по нашим данным, в полярных фракциях липидного экстракта пелоидов различного генеза (рис. 4)
А Б В
Рис. 2. А, Б - ультраструктурные изменения в гепатоцитах при остром отравлении СС14. А - деструкция митохондрий и просветление матрикса (а), миелинизация матрикса (б), расширение межклеточных пространств (в). Б - резкое расширение цистерн ЭПС (а), сглаживание гранулярного эндоплазматического ретикулума (б). В - ультраструктура нормального гепатоцита: митохондрии (а) и гранулярный
эндоплазматический ретикулум (б) в активном состоянии. Ув. 35000
— 9б —
А Б В
Рис. 3. Ультраструктура гепатоцита после курсового применения липидного экстракта сапропеля на фоне СС14 гепатита; А - аппликация 1 % полярной фракции: восстановление наружной и внутренней мембран (а), частичная деструкция крист (б), умеренное просветление матрикса митохондрий (в); Б - аппликация 0,3 % неполярной фракции: миелинизация (а), деструкция (б) и просветление матрикса (в) митохондрий; В - аппликация 2 % суммарного липидного экстракта сапропеля: почти полная нормализация структуры гепатоцита, расширенные цистерны ГЭР (а), умеренная плотность матрикса митохондрий (б). Ув. 35000.
присутствуют основные классы фосфолипидов, аналогичные фосфолипидам млекопитающих, ответственные за структурную целостность внутриклеточных мембран. Возможно, именно они способствуют более быстрому восстановлению нативной структуры мембран гепатоцитов, создавая тем самым благоприятные условия для действия эндогенных антиоксидантов и функционирования мембранных ферментов, что, в свою очередь, ведет к стимуляции процессов репарации и регенерации печени.
Рис. 4. Хроматограмма полярных фракций липидных экстрактов пелоидов различного генеза. Окраска фосфорномолибденовой кислотой. ФТ - фосфолипиды сульфидной грязи (оз. Тухлое);
ФК - фосфолипиды сапропеля (оз. Кирек); ФС - фосфолипиды сыворотки крови человека; СТ - стероидные соединения
С другой стороны, выраженный гепатопротек-тивный эффект от применения аппликаций суммарного липидного экстракта сапропеля и его полярной фракции мог быть связан со способностью входящих в их состав ингибиторов ПОЛ гасить цепные реакции пероксидации. Известно, что в
развитии патологических состояний, сопровождающихся формированием синдрома цитолиза, ключевая роль принадлежит активации процессов ПОЛ. Данный механизм реализуется при отравлении тетрахлорметаном. Основным патогенетическим звеном его токсического действия является пе-рекисное окисление полиеновых жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов [12]. При окислении тетрахлорметана в НАДФ-за-висимой дыхательной цепи эндоплазматического ретикулума при участии цитохрома Р-450 образуется чрезвычайно реакционноспособный трихлорме-тильный радикал СС13-. Повреждающее действие последнего в конечном итоге приводит к развитию цитолиза и гибели гепатцитов, нарушению нормального функционирования печени [10-13]. Исходя из этих представлений, исследовано влияние липидных экстрактов сапропеля как потенциальных антиоксидантов на развитие острого токсического СС14 гепатита. С указанной целью определяли содержание малонового диальдегида (МДА) в ткани печени и активность глутатионредуктазы (ГР) в сыворотке крови крыс. Полученные данные представлены в таблице. Установлено, что острое отравление СС14 сопровождается увеличением содержания малонового диальдегида в 2,4 раза, активности глутатионредуктазы - 2-4 раза (таблица). В контрольной группе животных скорость накопления продуктов ПОЛ имела тенденцию к росту по отношению к серии «гепатит». Возможно, это было связано с активацией эндогенных антиокси-дантных систем. Наиболее выраженный антиокси-дантный эффект наблюдался при аппликации 1 % раствора полярной фракции липидов сапропеля. В этой серии концентрация МДА практически нормализовалась, а активность ГР в крови лишь на 30-40 % превышала значения фона (таблица). Ап-
пликация 2 % суммарного экстракта липидов давала более умеренный эффект. Так, значения исследуемых показателей снизились лишь на 30-60 % относительно контроля (таблица). Полученные данные свидетельствуют о наличии прямого антиоксидантного эффекта суммарного липидного экстракта и его полярной фракции. В пользу такого предположения говорит тот факт, что в результате проведенных ранее исследованиях в липидах сапропеля было обнаружено большое количество ингибиторов ПОЛ. Более умеренный антиоксидантный эффект суммарных липидов мог быть связан с тем,
что основной пул ингибиторов ПОЛ кумулирован в полярной фракции.
Таким образом, характер гепатопротективного действия липидной составляющей сапропеля включает, с одной стороны, наличие прямого ингибирующего действия на процессы ПОЛ за счет значительного содержания антиоксидантов в полярной фракции. С другой стороны, установленный факт идентичности состава фосфолипидов сапропеля и печени, по-видимому, способствует более быстрому восстановлению структуры внутриклеточных мембран.
Список литературы
1. Лиштван И. И., Капуцкий Ф. Н., Янута Ю. Г. Гуминовые кислоты торфа и препараты на их основе // Природопользование. 2004. Вып. 10. С. 114-119.
2. Федько И. В., Гостищева М. В., Исматова Р. Р. Медицинские аспекты использования биологически активных гуминовых кислот // Химия растительного сырья. 2005. № 1. С. 41-44.
3. Назаров П. В., Исаев М. А. Состав липидов лечебных грязей // Вопр. курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2003. № 5. С. 46-47.
4. Чаков В. В., Завгорудько В. Н. Торфяные ресурсы Приамурья и их использование в пелоидотерапии. Хабаровск: ИВЭП ДВО РАН, 2008. 127 с.
5. Frenzel H., Heidenreich T., Gellert J. Protective effect of CO2 induced hyperventilation on the hepatotoxity elicited by carbon tetrachloride // Liver. 1982. V. 45, N 2. P. 376-384.
6. Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. V. 226. P. 497-509.
7. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000. Т. 2. 463 с.
8. Yagi K. A simple fluorimetric assay for lipoperoxide in blood plasma // Biochem. Medicine. 1976. V. 15. Р. 212- 216.
9. Козырева Е. В., Митюшин В. М. О взаимосвязи ультраструктуры и функционального состояния митохондрий печени крыс / Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии. М.: Мир, 1971. С. 113-118.
10. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсического действия. Л.: Медицина, 1986. 280 с.
11. Уайт А. Основы биохимии М.: Мир, 1981. Т. 1. 534 с.
12. Manno M., De Matteis F., Jon K. The mechanism of suicidal reductive inactivation of microsomal cytochrome P-450 by carbon tetrachloride // Biochem. Pharmacol. 1988. V. 37, N 10. P. 1981-1990.
13. Безручко Н. В., Васильков В. Г., Келина Н. Ю., Осинькин Д. В., Рубцов Г. К. Программа клинико-лабораторного мониторинга биохимических маркеров оценки эндогенной интоксикации при хроническом и остром холецистите // Вестн. Том. гос. пед. ун-та. 2011. № 8 (110). С. 115-119.
Низкодубова С. В., доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой. Томский государственный педагогический университет.
Ул. Киевская, 60, Томск, Россия, 634061.
E-mail: [email protected]
Ласукова Т. В., доктор биологических наук, профессор кафедры. Томский государственный педагогический университет.
Ул. Киевская, 60, Томск, Россия, 634061.
E-mail: [email protected]
Легостин С. А., кандидат медицинских наук, доцент кафедры. Томский государственный педагогический университет.
Ул. Киевская, 60, Томск, Россия, 634061.
E-mail: [email protected]
Материал поступил в редакцию 29.04.2013.
S. V Nizkodubova, T. V Lasukova, S. A Legostin
CORRECTION OF ENERGY METABOLISM IMPRAIMENTS IN TETRACHLORMETHANE-POISONED RAT LIVER
TISSUE BY MEANS OF SAPROPEL LIPIDS
Energy metabolism was studied in poisoned rat liver tissue after application of sapropel lipid extracts and its fractions. Total extract and its polar fractions affected distinctly the energy metabolism and ultrastructure of hepatocytes. The restoring influence of sapropel lipids appears to occur due to hoth their chemical composition and adaptogenic effect on intracellular reparation.
Key words: liver, sapropel, lipids, ultrastructure of hepatocytes.
Nizkodubovа S. V.
Tomsk State Pedagogical University.
Ul. Kievskaya, 60, Tomsk, Russia, 634061.
E-mail: [email protected]
Lasukova T. V.
Tomsk State Pedagogical University.
Ul. Kievskaya, 60, Tomsk, Russia, 634061.
E-mail: [email protected]
Legostin S. A.
Tomsk State Pedagogical University.
Ul. Kievskaya, 60, Tomsk, Russia, 634061.
E-mail: [email protected]
