CC BY
131
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Применение линий перевиваемых клеток в вакцинологии и медицине
Л.Л. Миронова, В.Д. Попова, О.И. Конюшко
ГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, Москва ([email protected])
Резюме
Для успешной реализации Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» от 1998 года и обеспечения эпидемического благополучия населения РФ по управляемым инфекциям требуется большое количество соответствующих вакцин. Авторы данной публикации предлагают использовать для создания противовирусных препаратов две установленные и аттестованные на безопасность линии - 4647 и М-22, а также другие линии из криобанка - диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека (М-7, М-20, М-23, М-27) и гетероплоидных клеток животных (455, 4179, 4921, 4184, Таурус-1). Этим решается вопрос перевода производства всех противовирусных вакцин с первичных культур клеток на линии перевиваемых клеток, что рекомендовано ВОЗ и ГУ ГНИИСиК МИБП Роспотребнадзора им. Л.А. Тарасевича еще в конце прошлого века.
Ключевые слова: линии перевиваемых клеток, биотехнология, противовирусные вакцины, Календарь профилактических прививок
Abstraot
Application of Lines of Intertwined Cages in Vaccinology and Medicine
L.L. Mironova, V.D. Popova, O.I. Konushko
Chumakova Institute of Poliomyelitis and Viral encephalitis ([email protected])
The successful implementation of the Federal Law «On immuno-prophylaxis of infectious diseases» of the 1998 epidemic and the welfare of the population of Russia managed to infection requires a large number of relevant vaccines. The authors of this paper proposes to use for the creation of antiviral agents, two established and certified in security lines - 4647 and M-22, as well as other lines of cryobanks - diploid cells of the skin and muscles of human embryos (M-7, M-20, F-23, M-27) and heteroploid cells of animals (455, 4179, 4921, 4184, Taurus-1). It deals with the transfer of the production of antiviral vaccines in primary cultures of cells on the transplantable cells that recommended by WHO and the State Control Institute of medical and biological preparations.
Key words: lines of transplantable cells, biotechnology, anti-viral vaccines, Calendar of preventive vaccinations
Целью данной публикации является привлечение внимания исследователей, работающих в области создания медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), к более широкому использованию в биотехнологии отечественных линий перевиваемых клеток.
Разработка новых технологий, в том числе и нанотехнологии, не исключает применения метода культивирования клеток вне организма. Потребности здравоохранения в противовирусных вакцинах велики, и в целях реализации Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» разработан Национальный календарь профилактических прививок. Мы обратим внимание исключительно на противовирусные препараты.
Первая прививка в рамках Национального календаря - против гепатита В, в первые 24 часа жизни новорожденного, вторая прививка против этой инфекции - через три месяца, третья - через шесть месяцев, и в 13 лет вакцинируют ранее не привитых (для детей, входящих в группу риска, предусмотрена другая схема). Вакцина против гепатита В - генно-инженерный препарат, содержащий белок HBsAg, включенный в геном обычных пекарских дрожжей.
Против полиомиелита вакцинируют детей в 3, 4,5 и 6 месяцев. Ревакцинацию осуществля-
ют в возрасте 18, 20 месяцев и в 14 лет. По приказу Минздравсоцразвития России № 673 от 30.10.2007 года первые три прививки проводят инактивированной вакциной Имовакс По-лио, последующие - оральной полиомиелитной вакциной (ОПВ). Для получения ОПВ вакцинные штаммы вируса полиомиелита трех типов размножают в первичных культурах клеток почек обезьян, Имовакс Полио производится на клеточной линии Vero.
Против кори, эпидемического паротита, краснухи вакцинируют в 12 месяцев и ревакциниру-ют в 6 лет (неболевшие и непривитые или привитые однократно: против краснухи прививают детей от года до 17 лет и девушек от 18 до 25 лет, против кори - подростков и взрослых до 35 лет). Вакцины против кори и эпидемического паротита готовят на первичных культурах клеток японских перепелов.
Против гриппа вакцинируют детей, посещающих детские дошкольные учебные заведения, и можно вакцинировать уже с шестимесячного возраста.
По эпидемическим показаниям вакцину против клещевого энцефалита вводят с четырех лет, против желтой лихорадки - с девяти месяцев. Эти вакцины производят с использованием куриных эмбрионов.
Вакцинация против гепатита А по эпидемическим показаниям назначается с трех лет. Используемый при этом препарат - единственная вакцина, которая производится на отечественной линии перевиваемых клеток почек обезьян 4647 [9]. В 1986 году она прошла национальное лицензирование в качестве вакцинного субстрата.
Вакцину против бешенства готовят на первичных культурах клеток сирийских хомяков.
Парадокс - при том, что в России вакцины против вирусных инфекций требуются в большом количестве, они до сих пор готовятся в основном на первичных культурах клеток животных. Всемирная организация здравоохранения еще в 1982 году рекомендовала при изготовлении вакцин осуществить переход на линии диплоидных клеток человека в качестве вакцинного субстрата, а с 1986 года - на линии гетероплоидных клеток животных. С этого момента за рубежом началось производство вакцин против полиомиелита, кори, паротита, краснухи и многих других инфекций на линии Wi-38 и позднее - MRC-5.
В последние годы широко применяется линия гетероплоидных клеток почек зеленой мартышки Vero. Наибольших успехов в использовании этой линии при культивировании клеток в промышленных ферментерах добились французские исследователи. Ими в больших количествах производятся серии вакцин против полиомиелита и бешенства.
По данным Л.Б. Эльберта, М.Н. Матрасовича, А.А. Мовсесянц, на линии Vero получены экспериментальные серии вакцин против клещевого энцефалита (КЭ) и японского энцефалита (ЯЭ), желтой лихорадки [19]. На клетках Vero В были приготовлены вакцины против вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов [2].
Нами в 1974 году создана аналогичная по происхождению линии гетероплоидных клеток Vero линия 4647 из почки взрослой зеленой мартышки. На ней были получены экспериментальные серии вакцин против полиомиелита и бешенства, а также производственные серии препарата Вакчум - вакцины против чумы плотоядных.
М.С. Балаян с сотрудниками разработали на линии 4647 вакцину против гепатита А, которую теперь под названием «Геп-А-ин-Вак» выпускает ГНЦ ВБ «Вектор». Вакцина нереактогенна, иммуноген-на, специфически безопасна [1, 17].
На линии клеток 4647 Л.Б. Эльбертом с сотрудниками получена вакцина против КЭ со штаммом «Софьин». Обработка инактивированных вирусных взвесей протаминсульфатом с последующей гель-хроматографией обеспечивала очистку от клеточной ДНК до приемлемого количества [19].
Линия 4647 обладает широким спектром чувствительности к вирусам различных групп: адено-, арена-, герпес-, лейко-, миксо-, парамиксо-, раб-до-, рота-, флави- и энтеровирусам [13].
По сообщениям М.О. Скарновича, И.Ф. Радаева, Г.В. Вдовиченко и др., линия 4647 пригодна для из-
готовления бивакцины против натуральной оспы и гепатита В [15].
В нашем криобанке находятся и другие культуры клеток, которые могут представлять большой интерес для исследователей. В частности, три культуры клеток - из почек, мозга и семенника новорожденной зеленой мартышки: 2688П, 2688М и 2688С -чувствительны к заражению вакцинными штаммами полиовируса. Последняя линия оказалась также высокочувствительной к заражению вакцинным штаммом ЭШЧ вируса кори, максимальный титр которого достигал 6,40 ^ БОЕ/мл [10].
На линии перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 получены экспериментальные серии вакцин против бешенства и чумы плотоядных. Линия чувствительна к заражению вирусами из групп рабдо-, рота-, рино-, энтеро-, парамиксо- и флавивирусов.
На линии клеток сердца и языка эмбриона зеленой мартышки 4179 изготовлены диагностикумы КЭ, ЯЭ, лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ).
Линии диплоидных и гетероплоидных клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 4921Д и 4921 пригодны для изготовления диагностикумов КЭ, ЯЭ и ЛХМ.
Линия перевиваемых клеток почек эмбриона овцы 4184 чувствительна к заражению вирусами чумы плотоядных, кори, бешенства, КЭ и ЯЭ [8]. На ней изготовлены экспериментальные серии вакцин против ЯЭ, а также диагностикумы КЭ и ЯЭ [4].
Установлено несколько сублиний перевиваемых клеток почки теленка - Таурус-1, -2, -3, -4. Все они являются тест-системами для работы с вирусами гриппа, парагриппа, аденовирусами. Линия Таурус-1 использована для изготовления диагно-стикума аденовирусной инфекции животных, а также для тестирования сывороток крупного рогатого скота на ростовые свойства и на присутствие кон-таминантов [12].
В 1985 году первой прошла национальное лицензирование в качестве вакцинного субстрата полученная нами линия диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-22. Она была разрешена для изготовления любых вакцин медицинского назначения. На этой культуре приготовлены экспериментальные серии вакцин против полиомиелита, кори, краснухи, КЭ [11, 18].
Остальные линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека с символом «М» прошли полный контроль на безопасность в нашем институте в соответствии с требованиями национальных и международных организаций к вакцинным субстратам. С использованием линии клеток М-7 получены крупные серии полиовакцины по утвержденной нормативно-технической документации. Линия М-20 является тест-системой, которая позволяет заменить лабораторных животных при оценке токсичности медицинских препаратов. Линия М-23 оказалась высокочувствительной к заражению ци-томегаловирусом (ЦМВ), и на ней был приготов-
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
лен соответствующий диагностикум. Линии клеток М-19, М-21 и М-27 широко применяются в разных учреждениях для работы с интерфероном.
Небезынтересно отметить использование метода культур клеток в клинической медицине. Линия М-22 успешно применена в Ожоговом центре Института хирургии им. А.В. Вишневского и в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского для лечения ожогов большой поверхности тела. Это особенно важно в связи с тем, что ожоговую травму получают в год около полумиллиона человек, из которых 125 тыс. пострадавших требуется стационарное лечение.
На подложке из кремнийорганических соединений полимерной пленки «Карбосил-П», покрытой коллагеном, выращивают фибробласты до получения конфлюэнтного слоя. Подготовленное раневое покрытие накладывают на поврежденную поверхность, что приводит к быстрой - за 5 - 7 дней - эпители-зации ожоговых ран II - Ша степени, а при обычной повязке с левомеколем их эпителизация занимает 20 - 22 дня. При этом тип заживления раны во втором случае - с формированием гипертрофического рубца, а в первом случае - без рубца [3].
Наши линии диплоидных клеток нашли применение в стоматологии, терапии, косметологии [5 - 7].
В заключение следует сказать, что применение линий гетероплоидных клеток для изготовления МИБП началось, но это не исключает возможности производить вакцины и на других культурах клеток. Мы считаем, что будущее за линиями перевиваемых клеток, которые имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с первичными культурами. Многолетняя работа с различными видами культур клеток убеждает нас в целесообразности дальнейшего изучения и применения линий 4647 и М-22. Для создания экспериментальных образцов МИБП из нашего криобанка могут быть применены линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7, М-20, М-23, М-27, из линий гетероплоидных клеток животных - 455, 4179, 4921, 4184, Таурус-1. Для экспериментальной работы пригодны линии М-10, М-21 и дериваты линии 4647 - РАМТ, дефектной по гену фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), ТК" и внутрилинейный гибрид РАМТ х 4647 ТК. Установленные линии мутантных клеток сохраняют биологические свойства родительских клеток, что позволяет рассматривать производные линии 4647 как перспективные модели для различных областей биотехнологии. Особенно важным свойством этих дериватов является отсутствие чувствительности к заражению микоплазмами.
Литература
1. Балаян М.С. Экспериментальные разработки вакцин против гепатита А // Вопр. вирусол. 1988. № 1. С. 5 - 11.
2. Бархалеева О.А., Воробьева М.С., Ладыжинская И.П. и др. «Витагер-павак» - вакцина на перевиваемой линии клеток Vero B - препарат для профилактики рецидивов заболеваний, вызываемых ВПГ 1-го и 2-го типов // Тез. Всерос. науч.-практ. конф. «Вакцинология-2008». -М., 2008.
3. Бочарова В.С., Хватов В.Б., Смирнов С.В. и др. Применение линий диплоидных клеток эмбриона человека М-22 в медицине в качестве источника аллогенных фибробластов / Медицинская вирусология: Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова. Т. XXIV. - М., 2007. С. 237- 240.
4. Бочкова Н.Г., Погодина В.В., Левина Л.С. и др. Применение штамма вируса японского энцефалита с высокой репродуктивной активностью в линии гетероплоидных клеток 4184 для изготовления МИБП/ Медицинская вирусология: Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова. Т. XXIV. -М., 2007. С. 35 - 37.
5. Грудянов А.И., Ерохин А.И., Миронова Л.Л. и др. Лабораторное исследование активности фибробластов в сочетании с различными видами подсадочных материалов in vitro // Цитология. 2001. Т. 43. № 9.
6. Кассин В.Ю., Абоянц РК., Миронова Л.Л. и др. Экспериментальное изучение реакции соединительной ткани на имплантацию гидрогелей с инкорпорированными фибробластами // Биотехнология. 2004. № 6. С. 71 - 75.
7. Кассин В.Ю., Николаев М.П., Миронова Л.Л. и др. Экспериментальное изучение влияния некоторых биологически активных веществ на рост фибробластов // Российская оториноларингология. 2004. № 5 (12). С. 85 - 88.
8. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Попова В.Д. и др. Штамм культивируемых клеток почки овцы для размножения вирусов. Патент РФ № 1559700 кл. С 12 № 5/00, 1993.
9. Миронова Л.Л., Грачев В.П., Кузнецова Н.В., Попова В.Д. Способ культивирования вирусов. Патент РФ № 770195, С 12 № 7/00/ (C12N7/00, d2R1/91) 1993.
10. Миронова Л.Л., Попова В.Д., ^лодина З.И. и др. Получение и применение различных видов культур клеток органов и тканей эмбрионов, новорожденных и взрослых африканских зеленых мартышек // Биотехнология, 1999. № 4. С. 15 - 20.
11. Миронова Л.Л., Преображенская KK., Грачев В.П. и др. Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемых для культивирования вирусов. Патент РФ № 1317020 кл. С 12 № 5/00, 1993.
12. Миронова Л.Л., Преображенская KK., Шитикова Г.С. и др. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка - субстрат для биотехнологии // Биотехнология. 1998. № 5. С. 25 - 31.
13. Миронова Л.Л., Попова В.Д., ^нюшко О.И. и др. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике // Биотехнология. 2000. № б. С. 41 - 47.
14. Мовсесянц А.А., Полюшкина Г.С., Бутырский А.Ю. Оценка иммуноген-ной активности кандидата в VI международный стандарт антирабиче-ской вакцины в коллаборативном исследовании ВОЗ // Тез. Всерос. науч.-практ. конф. «Вакцинология-2008». - М., 2008. С. 8б, 87.
15. Скарнович М.О., Радаева И.Ф., Вдовиченко Г.В. и др. ^льтура клеток 4б47 для производства рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В // Вопр. вирусол. 2007. № 2. С. 37- 40.
16. Шалунова Н.В., Петручук Е.М., Бердникова З.Е. и др. ^нтроль культур клеток, пригодных для производства иммунобиологических препаратов / Тез. Всерос. науч.-практ. конф. «Вакцинология-2008». - М., 2008. С. 125.
17. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Ершова О.Н. и др. Эффективность вакцинации против гепатита А для профилактики и купирования вспышек этой инфекции / Тез. Всерос. науч.-практ. конф. «Вакцинология-2008». - М., 2008. С. 12б.
18. Чумаков М.П., Миронова Л.Л., Попова В.Д. и др. Разработка технологии изготовления живой коревой вакцины с использованием штамма ЭШЧ и линии диплоидных клеток человека М-22 // Биотехнология. 1998. № 3. С. 40 - 42.
19. Elbert L.B., Terletskaya E.N., Timofeev A.V. et al. Inactivated vaccine against tick-borne encephalitis (TBE) derived from heteroploid continuous monkey cell line // Vaccine. 1989; 7: 477.
