CC BY
1
вмешательства (резекция патологических участков). Кроме этого, увеличение гериатрической популяции также способствует росту числа заболеваний опорно-двигательной системы.
Традиционно подходы к лечению дефектов критического размера включают использование ауто- и ал-лотрансплантатов [3, 4]. Аутотрансплантаты считаются «золотым стандартом» за счет наличия хорошей остеоиндуктивности, остеокондуктивности, остеоинтеграции, способствующей формированию ткани в месте дефекта [5, 6]. Однако использование аутотрансплантатов сопровождается рядом существенных недостатков, таких как увеличение объема оперативного вмешательства, ограниченный объем донорской ткани, возрастание риска возникновения постоперационных осложнений (инфицирование, кровотечение, повреждение нервно-сосудистой системы донорского участка). К недостаткам аллотрансплан-татов относятся низкая остеоиндуктивность, риск передачи инфекционных заболеваний от реципиента к донору, возможность развития реакции гистонесовместимости и хронического воспаления, а также этические и религиозные принципы [7-9].
В последние годы тканевую инженерию рассматривают перспективной альтернативой ауто- и алло-трансплантатам для лечения заболеваний и повреждений костной ткани [10, 11]. В концепцию тканевой инженерии входят три основных блока: клетки, скаффолд и остеоиндуктивные факторы роста [12, 13].
Благодаря своей биоинертности, пористые материалы на основе углерода могут быть кандидатными для использования в качестве скаффолдов. Сообщалось, что скаффолды на основе композита гидроксиапатит / пористый углерод способствуют адгезии и пролиферации MG-63 [14]. Однако, несмотря на это, использование пористых углеродных материалов в качестве скаффолдов ограничено, что связано с их незначительными прочностными характеристиками (например, прочность при сжатии углеродной пены Duacel® составляет 0,47 Мпа). В связи с тем, что имплантируемые скаффолды подвергаются различным механическим нагрузкам, включая сжатие, растяжение, кручение и сдвиг [1], крайне важной задачей является создание материала, способного выдерживать нагрузку в процессе регенерации.
Цель работы — оценить возможность применения композитных скаффолдов на основе стеклоуглерода в тканевой инженерии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Композитные скаффолды. В качестве углеродного прекурсора использован коммерчески доступный порошок фенолформальдегидной смолы марки СФП-012А2 (ООО «Метадинеа»). Порошок фенолформальдегидной смолы растворяли в этиловом спирте с получением раствора с концентрацией 30 масс. % для последующей импрегнации полимерных темплатов (Regicell® РР1 80). Импрегнацию образцов проводили путем погружения в спиртовой раствор фенолформальдегидной смолы при температуре 35-40 °С с обработкой в ультразвуковой ванне в течение 30 мин., после чего образцы извлекали и отжимом из них удаляли излишек импрегнирующего раствора. Пропитанные образцы сушили с применением принудительной конвекции в течение 15 мин. при температуре 70 °С. Затем сушку осуществляли в сушильном шкафу при температурах 70, 90, 120 °С. Отверждение проводили при температуре 150 °С в течение 4 ч. Пиролиз пен-прекурсоров проводили в атмосфере азота при температуре (1000 ± 50) °С, со скоростью подъема температуры 2,5 °С/мин и изотермической выдержкой в течение 30 мин. В результате пиролиза получали стеклоуглеродную пену, реплицирующую полимер предшественник. Затем проводили процесс осаждения пироуглерода на поверхность стеклоуглеродной пены методом СУ1. В качестве газа прекурсора использовали метан (чистота 99,9 %, АО «МГПЗ», Россия), температура процесса составляла (1050 ± 50) °С, продолжительность процесса — 20 ч.
Покрытие на основе гидроксиапатита. Для придания материалу остеоиндуктивных свойств его поверхность модифицировали гидроксиапатитом. Для этого проводили операции, описанные ниже.
Пористый углеродный скаффолд с пироуглеродным покрытием с геометрическими размерами 10 х 10 х 20 мм обезжиривали и очищали от механических примесей путем кипячения в этиловом спирте, после чего промывали дистиллированной водой до нейтрального pH. Очищенный скаффолд погружали в раствор электролита с концентрацией компонентов, обеспечивающей соотношение Ca/P — 1,67, pH поддерживали на уровне 3-5, время осаждения составляло 25 мин. при температуре 40 °С при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Образец углеродного скаффолда с пироуглеродным покрытием, выступающий в качестве катода, помещали в центр спиралевидного платинового анода. Для электрохимического осаждения использовали источник тока Matrix MPS-3020 (China). По окончании электролитического осаждения образец извлекали и сушили на воздухе до постоянной массы, после чего осуществляли удаление остатков электролита отмывкой в дистиллированной воде до нейтрального pH промывных вод. Отмытый образец подвергали сушке при температуре 140 °С до постоянной массы.
Образцы маркировали следующим образом: CF (англ.: carbon foam) — стеклоуглеродная пена, C (англ.: carbon coating) — пироуглеродное покрытие, HAP (англ.: hydroxyapatite) — гидроксиапатит.
Плотность и пористость. Объемная плотность образцов рассчитана как отношение массы к объему, объем определен измерением геометрических размеров образца с помощью цифрового штангенциркуля. Пикнометрия с использованием гелия осуществлена для установления истиной плотности углеродного «скелета» на приборе AccuPyc II 1340 [13].
Пористость Р (%) и объем пор VP (см3/г):
где pb — объемная плотность, г/см3; ps — истинная плотность, г/см3
Предел прочности при сжатии. Механические свойства скаффолдов исследовали при комнатной температуре на универсальной испытательной машине производства Zwick/Roell (Германия) при постоянной скорости перемещения активной траверсы 0,5 мм/мин.
Для проведения испытаний по определению предела прочности при сжатии использованы образцы формы параллелепипеда размерами 10 * 10 * 20 мм.
При подготовке (вырезке) образцов обращали внимание на обработку нагружных поверхностей. Торцы образцов изготавливали плоскопараллельными друг другу во избежание перекоса при нагружении. В противном случае разрушение могло произойти на торцах образца, предел прочности при этом был бы значительно ниже фактического. Для минимизации влияния перекоса испытания проводили с применением специальной плавающей опоры (рис. 1). Во время испытания производили запись диаграммы нагружения в координатах «Нагрузка-деформация», предел прочности асж рассчитывали по формуле:
°сж = Pmax / bh (3)
где: Pmax — максимальная нагрузка, Н; b — ширина образца, мм; h — толщина образца, мм.
Для статистической достоверности данных получено среднее значение, по меньшей мере, пяти различных измерений и вычислено стандартное отклонение.
Клеточная культура. При проведении исследования использовали первичную культуру мезенхимальных стромальных клеток из пульпы зуба человека (DPSC), фенотип которых (CD44+CD54+, CD90+, CD105+, CD34-, CD45-, HLA-DR-, CD31-, CD133-) соответствует МСК. Первичную культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека выделяли из зачатка третьего моляра, извлеченного по ортодонтическим показаниям (DPSC, Dental Pulp Stem Cells) у здорового пациента 16 лет. Асептически извлеченный зачаток зуба измельчали ножницами до размеров 1-2 мм3 и диссоциировали раствором 0,25 % трипсин — 0,02 % ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (ПанЭко, Россия) в течение 30 мин. при 37 °С. Выделенные клетки центрифугировали в течение 3 мин. при 200 g и помещали в среду для культивирования DMEM/F-12 (англ.: Dulbecco's modified Eagles medium, ПанЭко) в соотношении 1:1 с добавлением 10 % фетальной сыворотки крупного
(1) (2)
Рис. 1. Схема нагружения: 1 — плавающая опора, 2 — образец углеродного пористого материала
рогатого скота (ЭТС), переносили в 25 см2 флаконы и культивировали в атмосфере 5 % СО2 при 37 °C в среде DMEM (ПанЭко), содержащей 10 % ЭТС (HyClone), 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина с добавлением 2 мМ L-глютамина. При достижении субконфлюентного состояния клетки обрабатывали 0,25 % раствором трипсин-ЭДТА и переносили в 75 см2 флаконы, культивирование проводили в среде DMEM/F-12 10 % ЭТС, 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина и добавлением 2 мМ L-глютамина в соотношении 1:1 (Life technologies, США) при 37 °C в атмосфере 5 % СО2. По мере роста и достижения субконфлюентного состояния клетки обрабатывали 0,25 % раствором трипсин-ЭДТА и пассировали в новые флаконы в соотношении 1:2. Для проведения исследований использовали клетки на 3 пассаже.
Цитотоксичность. Исследование жизнеспособности клеток проводили с применением МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, растворимого в ди-метилсульфоксиде.
Спустя 2 сут. после внесения вытяжек материалов культуральную среду удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора МТТ 0,5 мг/мл в культуральной среде DMEM/F12 без сыворотки. После выдерживания в течение 3 час. при 37 °С в увлажненной атмосфере 5 % СО 2 жидкость удаляли, вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и, встряхивая планшеты при комнатной температуре в течение 10 мин., растворяли образовавшиеся соли формазана. Количество восстановленного формазана определяли по оптической плотности растворов на фотометре модели 680 (BIO-RAD, США) при длине волны 540 нм. Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна - Уитни (Mann - Whitney U-test). За ошибку принимали среднеквадратичное отклонение от среднего значения, за достоверные принимали различия по U-критерию Манна - Уитни при р < 0,05.
Жизнеспособность, адгезионная, пролиферативная и дифференцировочная активность МСК человека. Для проведения исследования жизнеспособности, адгезионной, пролиферативной и диф-ференцировочной активности МСК человека клетки высеивали на поверхности образцов с плотностью 40 тыс./см2 и культивировали в течение 14 сут., при этом объем среды составил 0,5 мл/лунку. Смену среды производили каждые 3-4 дня. Дифференцировочную активность клеток оценивали путем определения степени кальцификации и выявления активности в клетках щелочной фосфатазы. Для определения жизнеспособности клеток использовали метод флуоресцентного окрашивания смесью красителей SYTO 9, иодида пропидия и Hoechst 33342. Флуоресцентный краситель SYTO 9 в режиме исследования Хвозб = 450-490 нм, Хэмисс = 515-565 нм окрашивал в зеленый цвет ДНК и РНК живых и мертвых клеток. Интеркалирующий реагент иодид пропидия в режиме исследования Хвозб = 546 нм,
^эмисс 575 640 нм
окрашивал в красный цвет ядра погибших клеток. Флуоресцентный краситель Hoechst 33342 в режиме исследования Хвозб = 355 нм, Хэмисс = 460 нм окрашивал в синий цвет ДНК живых и мертвых клеток. Микрофотосъемку клеток проводили на микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).
Степень кальцификации определяли путем окрашивания отложений фосфорнокислого кальция красителем ализариновый красный (pH = 4,1). Для этого после окончания культивирования клетки промывали 0,01 М фосфатным буфером (рН = 7,4) и фиксировали в течение 20 мин. в 3,7 % забуференном растворе формальдегида. После удаления фиксатора и промывки деионизованной водой клетки были окрашены 2 % раствором ализаринового красного в течение 5 мин. для выявления образования минерализованного матрикса. Оценку морфологии клеток и количества кальцификатов проводили на микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).
Определение активности щелочной фосфатазы проводили с использованием набора реагентов (Alkaline phosphatase kit, Sigma 86-R) согласно инструкции производителя. Клетки фиксировали в течение 30 сек. цитрат-ацетон-формальдегидным фиксатором, промывали деионизованной водой и окрашивали в течение 15 мин. забуференным раствором, содержащим нафтол-АS-фосфат, fast red violet (хромогенный субстрат, используемый для определения активности щелочной фосфатазы). Промывали лунки деионизованной водой и в течение 2 мин. проводили докрашивание раствором гематоксилина. После трехкратной промывки деионизованной водой образцы подсушивали на воздухе. Оценку морфологии и окрашивания клеток проводили на микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).
По завершении культивирования проводили подготовку образцов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы промывали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН = 7,4) и фиксировали 12 час. при температуре 5 °C в 2,5 % забуференном растворе глутарового альдегида. После фиксации образцы промывали водой и дегидратировали при 4 °C последовательно в батарее водного раствора этанола возрастающей концентрации (50 %, 75 %, 80 %, 90 %) и в абсолютном этаноле на заключительном этапе. На каждой стадии образцы дважды погружали на 5 мин. в соответствующий раствор этилового спирта. Для удаления спирта образцы переносили на 30 мин. в гексаметилдисилазан
(HMDS), после чего высушивали на воздухе. Исследование микроструктуры образцов проводили на сканирующем электронном микроскопе с автоэмиссионным источником Tescan Vega II (TESCAN, Чехия) во вторичных электронах (детектор типа SE) при ускоряющем напряжении 20 кВ.
Фенотипический экспрессионный профиль культивируемых клеток оценивали методом ПЦР в реальном времени на 14-е сут. Исследовали экспрессию 22 генов-маркеров, отображающих процессы остеогенной дифференцировки. Анализируемые гены подбирали из базы данных http://www.sabiosciences.com/ для ПЦР-профилирования различных биологических процессов (табл. 1).
Уровень транскрипции генов нормировался по средним уровням экспрессии хаус-кипинг генов р-актина и rplpO (ribosomal protein, large, P0). Ген-специфические праймеры подбирали в программе Primer Express 3 (Applied Biosystems, США) (табл. 1). Для выделения общей матричной РНК из клеток применяли набор «Выделение полноразмерной поли (А) мРНК на магнитных частицах» (Силекс, Россия). Полученную мРНК использовали для синтеза комплементарной ДНК с помощью набора «Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» (Евроген, Россия). кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени, который проводили на приборе CFX 96 (BioRad, США), используя набор фирмы Евроген, содержащий интеркалирующий краситель SybrGreen. Для этого реакционную смесь размораживали и тщательно перемешивали. Смешивали компоненты реакции в следующей последовательности (на 25 мкл реакции): qPCRmix-HS SYBR — 5 мкл, ПЦР праймер 1 — 0,3 мкМ, ПЦР праймер 2 — 0,3 мкМ, кДНК матрица — 1 нг на реакцию и стерильная вода — до 25 мкл. Концентрация праймеров в реакциях по оптимизации составляла 0,05 пмоль/мкл, концентрация ионов Mg2+ составляла от 1,5 мМ, концентрация фермента от 0,2 ед. на 20 мкл реакции. Длина праймеров составляла в среднем 24 нуклеотида. Температура отжига 60 °C, длина амплифицируемого фрагмента 94-100 пар нуклеотидов.
Таблица 1
Гены, экспрессию которых оценивали в исследовании
Аббревиатура Название гена NCBI Reference Sequence
ALPL alkaline phosphatase, liver/bone/kidney NM 000478.4
BGLAP osteocalcin (bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein) NM 199173.4
BMP1 bone morphogenetic protein 1 NM 006129.4
BMPR1A bone morphogenetic protein receptor, type IA NM 004329.2
COL1A1 collagen, type I, alpha 1 NM 000088.3
COL3A1 collagen, type III, alpha 1 NM 000090.3
EGFR epidermal growth factor receptor NM 005228.3
FGF-2 fibroblast growth factor 2 (basic) NM 002006.4
FGFR1 fibroblast growth factor receptor 1 NM 015850.3
IGF1 insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) NM 000618.3
IGFR1 insulin-like growth factor 1 receptor NM 000875.3
IGF2 insulin-like growth factor 2 NM 000612
RUNX2 runt-related transcription factor 2 NM 004348.3
SMAD2 SMAD family member 2 NM 005901.5
SMAD4 SMAD family member 4 NM 005359.5
SMAD5 SMAD family member 5 NM 005903.6
SPP1 osteopontin-1 (secreted phosphoprotein 1) NM 000582.2
TGFBR1 transforming growth factor, beta receptor 1 NM 004612.2
TNF tumor necrosis factor NM 000594.3
VDR vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor NM 000376.2
BMP7 bone morphogenetic protein 7 NM 001719.2
TWIST1 twist family bHLH transcription factor 1 NM 000474.3
RPLP0 ribosomal protein, large, P0 NM 001002.3
ACTIN beta-actin XM_006715764.1
Реакцию проводили по следующей схеме: 1 цикл 95 °C — 5 мин; 2-40 циклы 95 °C — 30 сек, 60 °C — 40 сек; 1 цикл (стадия диссоциации) 95 °C — 15 сек, 60 °C — 1 мин, 95 °C — 15 сек. Для определения специфичности реакции продукты амплификации проверяли электрофорезом в 2 % агарозе. Также специфичность реакции определяли по кривым температурной диссоциации ампликонов с помощью программы CFX Manager 2.0 (BioRad, США). Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в реальном времени, производили по пороговой флуоресценции методом ДДС(Т), используя web ресурс для анализа PCR данных Oiagen (http://www.qiagen.com), построение тепловых карт экспрессии генов проводили с помощью программы Genesis (https://genome.tugraz.at/genesisclient/genesisclient_description.shtml).
Полученные данные экспрессии анализировали методом пороговой флуоресценции методом ДС(Т):
ДС(Т)гена = С(Т)гена - С(Т)хаус кипинг,
где С(Т)хаус кипинг — пороговая флуоресценция хаус кипинг гена.
Разницу между экспрессией гена в опыте и контроле вычисляли методом ДДС(Т):
ДДС(Т)гена = ДС(Т)гена опыт - ДС(Т)гена контр.
Относительный уровень экспрессии гена вычисляли по формуле:
Отн. экспр. = 2ДДС(Т)гена.
Для анализа массива данных использовали онлайн сервисы http://www.qiagen.com/, программу Mayday-2.14 (Center for Bioinformatics Tübingen, Германия) и программу Genesis (Sturn et al., 2002). Контролем служил образец без стадии обратной транскрипции. Учитывались лишь те результаты, для которых изменения уровня экспрессии генов наблюдали при p < 0,05.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin 8.1, за ошибку принимали среднеквадратичное отклонение от среднего значения, за достоверные принимали различия по U-критерию Манна - Уитни при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 2 и 3 представлены СЭМ-фотографии углеродных скаффолдов с различным типом модификации поверхности и без нее в сравнении с губчатой костью. Все исследуемые образцы имеют ячеистую структуру, состоящую из ячеек, сообщающихся между собой, по своей морфологии схожую с губчатой костью. Размер макропор находится в диапазоне от 150 до 200 мкм.
l^,'" '-.'^Р ■vi
\
ЙШ! ЯР »i \
¡як ■ м ™ Ф^Ш'ж
Рис. 2. Фото СЭМ микроструктуры: а — углеродного скаффолда;
б — углеродного скаффолда с пироуглеродным покрытием; в — углеродного скаффолда с пироуглеродным покрытием, модифицированного гидроксиапатитом; г — трабекулярной кости [15]. Увеличение *50
Рис. 3. Фото СЭМ поверхности скаффолдов на основе: а — стеклоуглеродной пены (увеличение * 400); б — стеклоуглеродной пены с пироуглеродным покрытием (увеличение * 300);
в — стеклоуглеродной пены с пироуглеродным покрытием, модифицированным гидроксиапатитом (увеличение * 500); г — стеклоуглеродной пены с пироуглеродным покрытием, модифицированным гидроксиапатитом (увеличение * 850)
По своим механическим характеристикам скаффолды, используемые в тканевой инженерии, должны быть сопоставимы с характеристиками замещаемой костной ткани (рис. 4).
Как видно из представленной зависимости, прочность при сжатии модифицированных скаффолдов составила ~ 3 МПа, что укладывается в диапазон значений для трабекулярной кости (2 ~ 10 МПа) [16]. Пористость исследуемых образцов находилась в диапазоне от 89 до 96 %.
На основании полученных данных для исследований in vitro отобраны образцы, получившие наилучшие результаты при проведении физико-механических испытаний, CF-C и CF-C-HAP.
Исследование метаболической активности МСК человека показало отсутствие токсического воздействия на клетки вытяжек из всех исследованных материалов (рис. 5).
Результаты исследования жизнеспособности, адгезионной и пролиферативной активности МСК человека при культивировании на поверхности углеродных скаффолдов, проведенного методами флуоресцентной микроскопии, приведены на рис. 6.
Метод дифференцированного флуоресцентного окрашивания основан на мониторинге жизнеспособных клеток в зависимости от целостности их мембраны. Краситель SYTO 9 окрашивает все клетки в культуре (зеленое окрашивание), в то время как нарушение целостности мембраны обеспечивает ее проницаемость для селективного ДНК-красителя пропидия иодида (красное окрашивание ядра). Hoechst 33342 является клеточным проницателем (синее окрашивание), окрашивает ДНК живых и мертвых клеток [17].
Рис. 4. Предел прочности при сжатии углеродных скаффолдов в зависимости от типа модификации поверхности
Рис. 5. Метаболическая активность МСК человека по результатам МТТ-теста при инкубации 48 ч с трехсуточными вытяжками из исследуемых материалов: 1 — CF-C; 2 — CF-C-HAP; 3 — контроль отрицательный (среда ДМЕМ / Fl2); 4 — контроль положительный (среда DMEM / F12 + 10 % ДМСО)
Рис. 6. Внешний МСК человека при культивировании на поверхности CF-C и CF-C-HAP на седьмые (а, д, и; в, ж, л) и четырнадцатые (б, е, к; г, з, м) сутки после посева. Окраска SYTO 9 (а, б, в, г); PI (д, е, ж, з); Hoechst 33342 (и, к, л, м). Линейка 100 мкм
Для контроля флуоресцентную микроскопию проводили на клетках, культивированных на покровное стекло (рис. 7).
г д е
Рис. 7. Внешний вид МСК человека при культивировании на поверхности покровного стекла (контроль) на седьмые (а, в, д) и четырнадцатые (б, г, е) сутки после посева. Окраска SYTO 9 (а, б); PI (в, г); Hoechst 33342 (д, е). Линейка 100 мкм
Также, с помощью СЭМ, анализировали морфологию клеток после культивирования в течение 14 дней (рис. 8).
Рис. 8. Внешний вид МСК человека при культивировании на поверхности: скаффолдов на основе CF-C (а — увеличение 1000, б — увеличение 5000), CF-C-HAP (в — увеличение *1000, г — увеличение *5000) и покровного стекла (д — увеличение *1000, е — увеличение *5000) на 14-е сутки после посева
Определение уровня экспрессии мРНК с использованием метода ПЦР в реальном времени.
В качестве контроля взят показатель МСК человека, культивируемых на покровном стекле в среде БМБМ ^12 с добавкой 10 % ЭТС, 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина.
Сравнение материалов с различной модификацией поверхности показало, что в культивируемых клетках наблюдаются преимущественно схожие паттерны экспрессии исследуемых генов (рис. 9, табл. 2). В целом при сравнении с контрольными образцами отмечали снижение транскрипционной активности всех исследуемых генов, но на образцах В1 и в клетках обнаружили увеличенное содержание транскриптов генов SPP1, VDR и ВМР7.
Таблица 2
Данные параметров изменений экспрессии генов из анализируемых образцов, выраженные через Log2
Гены А1 В1
ALPL -2,28 -3,80
BGLAP -1,11 -0,76
BMP1 -0,47 -1,21
BMPR1A -2,57 -1,14
COL1A1 -0,49 -2,50
COL3A1 -2,40 -3,33
EGFR -2,47 -1,79
FGF-2 -1,40 1,10
FGFR1 -1,95 -1,85
IGF1 -2,90 -1,60
IGFR1 1,14 1,77
IGF2 -1,75 -2,17
RUNX2 -1,85 -0,81
SMAD2 -1,44 -0,59
SMAD4 -1,46 -0,65
SMAD5 -2,05 -1,87
SPP1 -0,58 46,21
TGFBR1 -2,08 -2,23
TNF -2,49 -1,88
VDR -2,09 17,51
BMP7 1,44 1,62
TWIST1 -0,73 -0,95
Рис. 9. Паттерны экспрессии генов в клетках, растущих на образцах А1 (CF-C), В1 (CF-C-HAP), в виде тепловых карт. На диаграммах: черный цвет — уровень экспрессии сравним с контролем, градации цвета от черного до зеленого отражают степень ингибирования экспрессии генов, градации от черного до красного цвета — уровень стимуляции относительно контроля
Остеоиндуктивный потенциал пористых матриксов на основе углерода. Начальные этапы остео-генной дифференцировки МСК анализировали с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США), оценивая гистохимическое выявление в клетках активности щелочной фосфатазы. Щелочная фос-фатаза, эктофермент, секретируемый зрелыми остеобластами, является ранним фенотипическим маркером остеогенной дифференцировки МСК [18-20]. Активность щелочной фосфатазы обычно отмечают in vitro на седьмой день после начала остеоиндукции и визуализируют при окрашивании на 14 день.
Для оценки влияния скаффолдов на остеогенную дифференцировку клетки культивировали на поверхность покровного стекла, CF-C, CF-C-HAP (рис. 10).
а б в
Рис. 10. Активность щелочной фосфатазы МСК человека, культивированных в течение 14 дней на поверхности образцов материалов: покровное стекло (а), CF-C (б); CF-C-HAP (в). Среда БМЕМ/Т-12. Линейка 100 мкм
Одним из количественных методов определения минерализации во время остеогенной дифференциации является окрашивание ализариновым красным. Внешний вид МСК, культивированных в течение 14 сут., показан на рис. 11.
а б в
Рис. 11. Внешний вид МСК, культивированных в течение 14 суток в среде DMEM/F-12 (а) и в присутствии образцов материалов CS (б); CS-HAP (в). Окрашивание ализариновым красным. Линейка 100 мкм
ОБСУЖДЕНИЕ
Одной из основных задач тканевой инженерии является разработка скаффолда, имитирующего трехмерную архитектуру, для остеогенных прогениторных клеток внутри скаффолда с возможностью взаимодействия клеток с соответствующими химическими и физическими стимулами естественной кости [21]. Несмотря на значительное количество исследований, проводимых в данном направлении, требования к конструкции скаффолдов для тканевой инженерии до конца не сформулированы. При этом выделяют ряд ключевых структурных характеристик, определяющих возможность межклеточного взаимодействия внутри скаффолда. Известно, что размер пор, степень канальной взаимосвязанности, а также общая пористость играют решающую роль в регулировании морфологии и поведения различных типов клеток [1, 22-25]. Пористость и размер пор вносят большой вклад в способность скаффолда поддерживать клеточную адгезию, что, в свою очередь, влияет на плотность заселения клеток в объеме скаффолда, а также их распространение и миграцию [24, 26]. Размеры пор, необходимые клеткам различного типа, существенно варьируют, но в среднем для эффективного роста, миграции клеток, а также проникновения питательных веществ и удаления продуктов жизнедеятельности приемлемым является диапазон размера пор 100-500 мкм. Увеличение размера пор скаффолда приводит к снижению площади поверхности, ограничению адгезии клеток и предотвращению образования белково-клеточных мостиков. Помимо этого, механические свойства скаффолда ухудшаются за счет увеличения объема пустот, что является еще одним критическим параметром в конструкции [17, 22]. У скаффолдов, предназначенных для регенерации костной ткани, размер пор в диапазоне 150-400 мкм является оптимальным для стимуляции остеогенеза и васкуляризации вглубь тканево-инженерной конструкции [22, 27].
В настоящем исследовании мы предлагаем технически простой и недорогой метод получения скаффолдов, имитирующих структуру трабекулярной костной ткани человека. В качестве основы композитного скаффолда выбрана стеклоуглеродная пена. Стеклоуглеродная пена на основе полиурета-нового темплата представляет собой трехмерную структуру с размером пор 150-200 мкм, открытой пористостью, преимущественно состоящую из углерода. Поры в данном диапазоне способствуют инфильтрации клеток, участвующих в пролиферации, миграции и васкуляризации in vivo [27].
Благодаря сетчатой структуре, а также биоинертности, стеклоуглеродные пены подходят для применения в качестве скаффолдов в тканевой инженерии [28, 29]. Наиболее значимыми характеристиками материала для использования в качестве скаффолдов являются пористость, прочность, отсутствие токсичности, остеоиндуктивность и остеокондуктивность [22, 30]. Материал скаффолда должен обладать прочностью, сопоставимой с прочностью замещаемой ткани. В связи с тем, что стеклоуглеродные пены являются хрупкими материалами, их прочностные характеристики оценивают по пределу прочности при сжатии [28]. Предел прочности при сжатии и модуль упругости стеклоуглеродных пен зависят, прежде всего, от таких параметров, как объемная плотность и пористость. Для скаффолдов чрезвычайно важно сохранить высокую открытую пористость, поскольку это благоприятствует адгезии и пролиферации клеток [27, 31]. Одним из путей повышения прочностных характеристик является модификация поверхности путем нанесения покрытий различной природы. Осаждение пироуглерода позволило повысить предел прочности при сжатии до ~3 МПа, при сохранении общей пористости на уровне 93 %. Высокая пористость скаффолда за счет значительной площади поверхности обеспечивает большее взаимодействие с внеклеточным матриксом [32], что, в свою очередь, способствует прорастанию костной ткани и васкуляризации [32]. Кроме того, постоянный контакт скаффолда с внеклеточным матрик-сом со временем приводит к окклюзии пор, в связи с чем высокая пористость скаффолда обеспечивает достаточную проницаемость для транспорта питательных веществ и биомолекул [32].
Для улучшения остеоиндуктивных свойств скаффолда поверхность дополнительно модифицировали гидроксиапатитом [27, 33]. Исследование СЭМ показало, что получаемое покрытие формируется как на внешних, так и на внутренних поверхностях скаффолда, является однородным и преимуще-
ственно состоит из пластинчатых кристаллов гидроксиапатита. Нанесение покрытия гидроксиапатита привело к незначительному повышению прочностных характеристик, что согласуется с результатами, полученными в работе S.F. Rahman [27].
Исследование метаболической активности МСК человека показало отсутствие токсического воздействия на клетки вытяжек из всех исследованных материалов. При этом отмечено некоторое увеличение оптической плотности раствора, в который добавлена вытяжка из CF-C-HAP (рис. 5), что может свидетельствовать о наличии в ней водорастворимых факторов, стимулирующих активность клеток. Однако статистический анализ результатов исследования метаболической активности клеток DPSC, проведенный с использованием непараметрического U критерия Манна - Уитни, не показал значимых различий с контролем при воздействии на клетки вытяжек из всех материалов. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии цитотоксичности у всех исследуемых материалов и отсутствии водорастворимых компонентов, негативно воздействующих на жизнеспособность МСК человека.
Исследования жизнеспособности, адгезионной и пролиферативной активности МСК показали, что на всех сроках наблюдения для CF-C и CF-C-HAP выявлены адгезированные клетки, динамика плотности расположения которых увеличивалась в течение сроков наблюдения. На 14 день после инкубации наблюдается плотное расположение клеток, как на поверхности, так и внутри трехмерных скаффолдов (рис. 6).
СЭМ-анализ прикрепления и морфологии клеток показал, что клетки активно пролиферировали на поверхности скаффолдов, модифицированных и пироуглеродом, и гидроксиапатитом. Модификация поверхности углеродных скаффолдов приводит к появлению шероховатости (рис. 2, б, в), что, в свою очередь, является одним из факторов, стимулирующих остеогенез [34].
Клетки образуют плотный монослой, прорастающий через поры внутри трехмерного углеродного скаффолда. По своей морфологии клетки — удлиненные с плоской поверхностью, наблюдаются обширные филоподии (рис. 8, а, б), что свидетельствует о сильной клеточной адгезии и росте.
Определение уровня экспрессии мРНК с использованием метода ПЦР в реальном времени показало (табл. 2), что у клеток, культивированных на CS-C-HAP, через 14 сут. наблюдается экспрессия генов. VDR кодирует рецептор витамина D3, регулирующий активность генов минерального обмена и контролирующий гомеостаз кальция и фосфора [35, 36]. BMP7 является стимулятором дифференцировки остеобластов, который необходим для дифференцировки преостеобластов в зрелые остеобласты [37]. IGFR1 выступает важным регулятором гомеостаза костной ткани, который, вероятно, стимулирует репликацию и дифференцировку остеобластов [38, 39], а также увеличивает экспрессию коллагена I типа в остеобластах и снижает транскрипцию матриксной металлопротеиназы (ММП)-13 [40], которая разрушает коллагеновые волокна и кости [41]. SPP1 — гликопротеин, участвующий в остеогенезе [42-44], усиливает дифференцировку и пролиферацию остеобластов [42, 44, 45], модулирует как формирование костной ткани, так и ее резорбцию за счет прикрепления остеокластов к минерализованному костному матриксу [45]. На основании данных об увеличении экспрессии генов, ассоциированных с остеогенезом, можно сделать вывод, что разрабатываемые материалы обладают остеогенным потенциалом.
Остеогенез — это процесс образования новой кости, включающий кальцификацию предкостного матрикса и дифференциацию остеобластов, предшественников костной ткани, в зрелые остеоциты. Минерализация матрикса или кальцификация в МСК, подвергающихся остеоиндукции, может быть обнаружена с помощью определения активности ЩФ и окрашивания ализариновым красным. После индукции в течение 14 дней небольшое количество положительных на Щф клеток наблюдалось на поверхности CF-C. Клетки, культивированные на поверхности CF-C-HAP (рис. 10, в), демонстрировали более высокую по сравнению с поверхностями покровного стекла и CF-C (рис. 10 а, б) активность ЩФ. Окрашивание культивированных клеток ализариновым красным показало, что в случае контроля (рис. 11, а) отсутствовала спонтанная дифференцировка клеток в остеогенном направлении. Окрашивание культуры МСК в присутствии CF-C дало отрицательный результат, аналогичный контролю, что свидетельствует об отсутствии минерализации и дифференцировки в остеогенном направлении (рис. 11, б). В присутствии CF-C-HAP (рис. 11, в) наблюдаются скопления клеток в виде узелков остеобластов и отложения внеклеточного матрикса, выявленного гистохимически окрашиванием ализариновым красным как кальцификаты, что свидетельствует о его способности индуцировать диффе-ренцировку МСК в остеогенном направлении и продуцировать кальцийсодержащий матрикс.
Результаты наших исследований по изучению активности фосфатазы и окрашивания ализариновым красным показали, что скаффолд CF-C-HAP стимулирует дифференцировку остеобластов in vitro в остеогенном направлении, а также процессы внутриклеточной минерализации в остеобластах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Углеродные скаффолды на основе стеклоуглеродной пены с поверхностью, модифицированной гидроксиапатитом, обладают высокой пористостью, развитой поверхностью, а также воспроизводят архитектуру трабекулярной костной ткани. Нанесение покрытия на основе пиролитического углерода способствует увеличению прочностных характеристик и снижает гидрофобность углеродного скаффолда. Модификация гидроксиапатитом значительно повышает шероховатость материала, что оказывает положительное влияние на адгезию и прикрепление клеток. Все исследуемые в работе углеродные скаффолды показали отсутствие цитотоксичности.
Установлено, что скаффолды, модифицированные гидроксиапатитом, обладают остеоиндуктивностью, способны индуцировать дифференцировку МСК в остеогенном направлении, продуцировать кальцийсодержащий матрикс и увеличивают экспрессии генов, ассоциированных с остеогенезом.
Разработанный материал является перспективным для использования в тканевой инженерии.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Источник финансирования. Работа выполнена за счет средств ГК «Росатом». Этическая экспертиза. Не требуется. Информированное согласие. Не применимо.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Садовой М.А., Ларионов П.М., Самохин А.Г., Рожнова О.М. Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы. Хирургия позвоночника. 2014;2:79-86. doi: 10.14531/ss2014.2.79-86.
2. Phadke A, Hwang Y, Kim SH, et al. Effect of scaffold microarchitecture on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Eur Cell Mater. 2013;25:114-129. doi: 10.22203/ecm.v025a08.
3. Taylor B, Indano S, Yankannah Y, et al. Decellularized Cortical Bone Scaffold Promotes Organized Neovascularization In Vivo. Tissue Eng Part A. 2019;25(13-14):964-977. doi: 10.1089/ten.TEA.2018.0225.
4. Sohn HS, Oh JK. Review of bone graft and bone substitutes with an emphasis on fracture surgeries. Biomater Res. 2019;23:9. doi: 10.1186/s40824-019-0157-y.
5. Chiarello E, Cadossi M, Tedesco G, et al. Autograft, allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 2013;25 Suppl 1:S101-S103. doi: 10.1007/s40520-013-0088-8.
6. Hatzenbuehler J, Pulling TJ. Diagnosis and management of osteomyelitis. Am Fam Physician. 2011 Nov 1;84(9):1027-1033.
7. Wang W, Zhang Y, Liu W. Bioinspired fabrication of high strength hydrogels from non-covalent interactions. Prog Polym Sci. 2017;71:1-25. doi: 10.1016/j.progpolymsci.2017.04.001.
8. Zamborsky R, Svec A, Bohac M, et al. Infection in bone allograft transplants. Exp Clin Transplant. 2016;14(5):484-490. doi: 10.6002/ ect.2016.0076.
9. Oakley MJ, Smith WR, Morgan SJ, ey al. Repetitive posterior iliac crest autograft harvest resulting in an unstable pelvic fracture and infected non-union: case report and review of the literature. Patient Saf Surg. 2007;1(1):6. doi: 10.1186/1754-9493-1-6.
10. Gao Y, Ma O. Bacterial infection microenvironment-responsive porous microspheres by microfluidics for promoting anti-infective therapy. Sm^rt Med. 2022;1(1):e20220012. doi: 10.1002/SMMD.20220012.
11. Zhu Y, Kong B, Liu R, Zhao Y. Developing biomedical engineering technologies for reproductive medicine. Smart Med. 2022;1(1):e20220006. doi: 10.1002/SMMD.20220006.
12. Dixon DT, Gomillion CT. Conductive Scaffolds for Bone Tissue Engineering: Current State and Future Outlook. J Funct Biomater. 2021;13(1):1. doi: 10.3390/jfb13010001.
13. Perez JR, Kouroupis D, Li DJ, et al. Tissue Engineering and Cell-Based Therapies for Fractures and Bone Defects. Front Bioeng Biotechnol. 2018;6:105. doi: 10.3389/fbioe.2018.00105.
14. Liu H, Xia L, Dai Y, et al. Fabrication and characterization of novel hydroxyapatite/porous carbon composite scaffolds. Materials Letters. 2012;66(1):36-38. doi: 10.1016/j.matlet.2011.08.053.
15. Guillen T, Ohrndorf A, Tozzi G, et al. Compressive fatigue behavior of bovine cancellous bone and bone analogous materials under multi-step loading conditions. Advanced Engineering Materials. 2012;14(5):B199-B207. doi: 10.1002/adem.201180060.
16. Ramaswamy G, Bidez MW, Misch CE. Bone response to mechanical loads. In: Misch CE. Dental Implant Prosthetics (Second Edition). Mosby; 2015:107-125. doi: 10.1016/B978-0-323-07845-0.00006-3.
17. Попов А.Л., Татарникова О.Г., Шекунова Т.О. и др. Исследование воздействия нанокристаллического диоксида церия, допи-рованного гадолинием (Ce1-xGdxO2-y), на функциональное состояние и жизнеспособность клеток линии NCTC clone L929. Вестник Томского государственного университета. Химия. 2017;(8):68-87. doi: 10.17223/24135542/8/6.
18. Wutticharoenmongkol P, Pavasant P, Supaphol P. Osteoblastic phenotype expression of MC3T3-E1 cultured on electrospun polycaprolactone fiber mats filled with hydroxyapatite nanoparticles. Biomacromolecules. 2007;8(8):2602-2610. doi: 10.1021/ bm700451p.
19. Tsukamoto Y, Fukutani S, Mori M. Hydroxyapatite-induced alkaline-phosphatase activity of human pulp fibroblasts. J Mater Sci: Mater Med. 1992;3:180-183. doi: 10.1007/bf00713446.
20. Lao L, Wang Y, Zhu Y, et al. Poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite nanofibrous scaffolds fabricated by electrospinning for bone tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 2011;22(8):1873-1884. doi: 10.1007/s10856-011-4374-8.
21. Chung S, King MW. Design concepts and strategies for tissue engineering scaffolds. Biotechnol Appl Biochem. 2011;58(6):423-438. doi: 10.1002/bab.60.
22. Saberi A, Kouhjani M, Mohammadi M, Hosta-Rigau L. Novel scaffold platforms for simultaneous induction osteogenesis and angiogenesis in bone tissue engineering: a cutting-edge approach. JNanobiotechnology. 2023;21(1):351. doi: 10.1186/s12951-023-02115-7.
23. He X, Zhao O, Zhang N, et al. Impact of a staggered scaffold structure on the mechanical properties and cell response in bone tissue engineering./Appl Biomater Funct Mater. 2023;21:22808000231181326. doi: 10.1177/22808000231181326.
24. Abbasi N, Hamlet S, Love RM, Nguyen NT. Porous Scaffolds for Bone Regeneration. J Sci: Adv Mater Dev. 2020;5(1):1-9. doi: 10.1016/j. jsamd.2020.01.007.
25. Aghali A. Craniofacial Bone Tissue Engineering: Current Approaches and Potential Therapy. Cells. 2021;10(11):2993. doi: 10.3390/ cells10112993.
26. Persson M, Lehenkari PP, Berglin L, et al. Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in a 3D woven scaffold. Sci Rep. 2018;8(1):10457. doi: 10.1038/s41598-018-28699-x.
27. Rahman SF, Ghiffary MM, Tampubuluon JY, et al. Effect of graphite, graphene oxide, and multi-walled carbon nanotubes on the physicochemical characteristics and biocompatibility of chitosan/hyaluronic acid/hydroxyapatite scaffolds for tissue engineering applications. J Sci: Adv Mater Dev. 2024;9(2):100719. doi: 10.1016/j.jsamd.2024.100719.
28. Bagal R, Bahir M, Lenka N, Patro TU. Polymer derived porous carbon foam and its application in bone tissue engineering: a review. Int J Polymer Mater Polymer Biomat. 2022;72(12):909-924. doi: 10.1080/00914037.2022.2066669.
29. Islam M, Sadaf A, Gomez MR, et al. Carbon fiber/microlattice 3D hybrid architecture as multi-scale scaffold for tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;126:112140. doi: 10.1016/j.msec.2021.112140.
30. Dong J, Ding H, Wang Q, Wang L. A 3D-Printed Scaffold for Repairing Bone Defects. Polymers (Basel). 2024;16(5):706. doi: 10.3390/ polym16050706.
31. Lee DJ, Kwon J, Kim YI, et al. Effect of pore size in bone regeneration using polydopamine-laced hydroxyapatite collagen calcium silicate scaffolds fabricated by 3D mould printing technology. Orthod CraniofacRes. 2019;22 Suppl 1(Suppl 1):127-133. doi: 10.1111/ ocr.12261.
32. Koushik TM, Miller CM, Antunes E. Bone tissue engineering scaffolds: function of multi-material hierarchically structured scaffolds. AdvHealthcMater. 2023;12(9):e2202766. doi: 10.1002/adhm.202202766.
33. Cao J, Lian R, Jiang X, Rogachev AV. In vitro degradation assessment of calcium fluoride-doped hydroxyapatite coating prepared by pulsed laser deposition. Surface and Coatings Technology. 2021;416:127177. doi: 10.1016/j.surfcoat.2021.127177.
34. Zhang Y, Chen SE, Shao J, van den Beucken JJJP. Combinatorial Surface Roughness Effects on Osteoclastogenesis and Osteogenesis. ACS Appl Mater Interfaces. 2018;10(43):36652-36663. doi: 10.1021/acsami.8b10992.
35. Meyer MB, Goetsch PD, Pike JW. Genome-wide analysis of the VDR/RXR cistrome in osteoblast cells provides new mechanistic insight into the actions of the vitamin D hormone. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(1-2):136-141. doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.02.011.
36. Li Y, Zhao P, Jiang B, et al. Modulation of the vitamin D/vitamin D receptor system in osteoporosis pathogenesis: insights and therapeutic approaches. J Orthop Surg Res. 2023; 18(1):860. doi: 10.1186/s13018-023-04320-4.
37. Ott SM, Elder G. Osteoporosis associated with chronic kidney disease. In: Marcus R, Feldman D, Dempster DW, et al. (eds). Osteoporosis. 4th ed. Elsevier Pub.; 2013:1387-1424. doi: 10.1016/B978-0-12-415853-5.00058-3.
38. Yakar S, Rosen CJ. From mouse to man: redefining the role of insulin-like growth factor-I in the acquisition of bone mass. Exp Biol Med (Maywood). 2003;228(3):245-252. doi: 10.1177/153537020322800302.
39. Fang J, Zhang X, Chen X, et al. The role of insulin-like growth factor-1 in bone remodeling: A review. Int J Biol Macromol. 2023;238:124125. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.124125.
40. Canalis E, Rydziel S, Delany AM, et al. Insulin-like growth factors inhibit interstitial collagenase synthesis in bone cell cultures. Endocrinology. 1995;136:1348-1354. doi: 10.1210/endo.136.4.7895645.
41. Brennan-Speranza TC, Rizzoli R, Kream BE, et al. Selective osteoblast overexpression of IGF-I in mice prevents low protein-induced deterioration of bone strength and material level properties. Bone. 2011;49(5):1073-1079. doi: 10.1016/j.bone.2011.07.039.
42. Denhardt DT, Noda M. Osteopontin expression and function: Role in bone remodeling. J Cell Biochem. 1998;72 Suppl 30-31(S30-31): 92-102. doi: 10.1002/(SICI)1097-4644(1998)72:30/31+<92::AID-JCB13>3.0.m;2-A.
43. Choi ST, Kim JH, Kang EJ, et al Osteopontin might be involved in bone remodelling rather than in inflammation in ankylosing spondylitis. Rheumatology (Oxford). 2008;47(12):1775-1779. doi: 10.1093/rheumatology/ken385.
44. Martín-Márquez BT, Sandoval-García F, Corona-Meraz FI, et al. Osteopontin: A Bone-Derived Protein Involved in Rheumatoid Arthritis and Osteoarthritis Immunopathology. Biomolecules. 2023;13(3):502. doi: 10.3390/biom13030502.
45. Singh A, Gill G, Kaur H, et al. Role of osteopontin in bone remodeling and orthodontic tooth movement: a review. Prog Orthod. 2018;19(1):18. doi: 10.1186/s40510-018-0216-2.
Статья поступила 18.07.2024; одобрена после рецензирования 26.09.2024; принята к публикации 10.12.2024.
The article was submitted 18.07.2024; approved after reviewing 26.09.2024; accepted for publication 10.12.2024.
Информация об авторах:
Елена Игоревна Тимощук — кандидат технических наук, начальник управления конструкционных материалов, [email protected], https://orcid.org/0009-0003-4162-1196;
Дарья Владимировна Пономарева — заместитель начальника управления — начальник отдела конструкционных графитов, [email protected], https://orcid.org/0009-0009-4886-1436;
Артур Радикович Гареев — кандидат технических наук, заместитель директора по науке и инновациям, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5934-8456.
Information about the authors:
Elena I. Timoshchuk — PhD in Engineering, Head of Structural Materials Department, [email protected], https://orcid.org/0009-0003-4162-1196;
Darya V. Ponomareva — Deputy Head of Department — Head of Structural Graphite Department, [email protected], https://orcid.org/0009-0009-4886-1436;
Artur R. Gareev — PhD in Engineering, Deputy Director for Science and Innovation, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5934-8456.
Вклад авторов:
Тимощук Е.И. — концептуализация, исследование, написание — первоначальный вариант, написание — рецензирование и редактирование, контроль.
Пономарева Д.В. — исследование, написание — рецензирование и редактирование, визуализация. Гареев А.Р. — написание, рецензирование и редактирование.
