CC BY
71
ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОК СТРОМАЛьНО-ВАСКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ
из жировой ткани для замещения сегментарного
ДЕФЕКТА ГРЕБНЯ АЛьВЕОЛЯРНОГО ОТРОСТКА ЧЕЛЮСТИ СОБАКИ:
экспериментальный случай
А.Р. Хайрутдинова 1, Ф.А. Хафизова 1, М.З. Миргазизов 1, И.Р. Хафизов 3, ЕЮ. Закирова 1, М.А. Сергеев 2, И.И. Салафутдинов 1, Г.А. Масгутова 1, Р.Ф. Масгутов 14, А.А. Ризванов 1, М.А. Багманов 2, Р.М. Миргазизов 1, Р.Г. Хафизов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанская государственная академия ветеринарной медицины, Казань, Россия
3 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия 4Республиканская клиническая больница, Казань, Россия
Use of stromal vascular fraction cells from adipose tissue to replace segmental defect of dog's alveolar crest: experimental case
A.R. Khairutdinova 1, FAKhafizova 1, MZ. Mirgazizov1,I.R. Khafizov 3, E.Y.Zakirova 1, M.A. Sergeev 2, I.I. Salafutdinov1, GA. Masgutova 1, R.F. Masgutov14, A.A. Rizvanov1, MA. Bagmanov 2, R.M. Mirgazizov1, R.G. Khafizov1
1 Kazan Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan state academy of veterinary medicine, Kazan, Russia
3 Kazan state medical university, Kazan, Russia
4 Republio Clinical Hospital, Kazan, Russia, Russia
В статье представлен случай применения аутогенных клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани для наращивания объема костной ткани в зонах дентальной имплантации В качестве матрикса для клеток мы использовали пористые никелид-титановые гранулы, которые укладывались в зону дефекта альвеолярного отростка челюсти до достижения требуемого объема . На протяжении всего эксперимента проводили аблюдение за животным, а также производили гистологическое исследование
По результатам наблюдений и данных гистологических исследований следует сделать вывод, что применение предлагаемого способа костной пластики является целесообразным и высокоэффективным в практической ветеринарии
Ключевые слова: клетки стромально-васкулярной фракции, жировая ткань, остеокондуктивные материалы, направленная тканевая регенерация, никелид-титановые гранулы
Введение
Одной из важнейших задач в современной биологии и медицине является внедрение клеточных технологий в клиническую практику [1]. Мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) взрослого человека из костного мозга (КМ) представляют собой доступную и относительно хорошо охарактеризованную популяцию стромальных клеток [2]. Однако достаточно ограниченный ресурс данной популяции клеток и наличие технических трудностей при их получении не позволяет использовать их с высокой эффективностью без предварительного культивирования
Особый интерес биологов и врачей вызывают клетки стромально-васкулярной-фракции, получаемые из жировой ткани (СВФЖТ) [3, 4]. Это обусловлено в первую очередь доступностью материала для выделения клеток, поскольку одним из способов их получения является косметическая липосакция Популяция свежевыделенных клеток жировой ткани гетерогенна и характеризуется высоким содержанием клеток, экспрессирующих антиген CD34 .
e-mail: implantstom@bk. ru
The paper presents a case of using autologous stromal-vascular fraction of adipose tissue to increase bone volume in the areas of dental implantation . As the matrix for cells we used nikelid-porous titanium granules which fit into the defect area alveolar with giving required volume . Throughout the experiment conducted observation of animals, accompanied by histological studies .
According to the results of histological studies and observations it can be concluded that the application of the proposed method of bone plastic is advisable and highly effective in the practice of medicine
Keywords: stromal vascular fraction cells, adipose tissue, osteoconductive materials, directed tissue regeneration, stromal-vascular fraction, nikelid-titanium granules
В процессе культивирования наблюдается обогащение популяции клетками, несущими маркеры, идентичные ММСК КМ - Сй29, Сй44, Сй71, Сй90, Сй105, СР106, СР166 . Поэтому в ряде случаев СВФЖТ могут представлять собой альтернативу ММСК из КМ, получение которых связано с определенными техническими и медицинскими проблемами [5].
Считается, что некоторые стволовые клетки способствуют регенерации после практически любого повреждения тканей, стимулируя внутренние резервы организма к восстановлению [6]. Однако сегодня внимание сфокусировано главным образом на возможности стромальных клеток стимулировать регенерацию костной ткани . Известно большое количество способов пластики костных дефектов альвеолярного отростка челюстей, однако, применяемые материалы не всегда удовлетворяют предъявляемым к ним требованиям [7].
В нашей работе в качестве матрикса для клеток использовался биосовместимый мелкогранулиро-ванный пористый никелид титана с размерами пор
от 0,1—1000 мкм, полученный методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза (СВС) . Структура матрикса из пористого проницаемого никелида титана представляет собой трехмерное поровое пространство, морфологическое строение которого типично для высокопористых материалов Пористый материал имеет большую удельную поверхность, обусловленную наличием в нем системы открытых и взаимосвязанных пор . Поверхность стенок пор очень развита, она рельефная и шероховато-микропористая
Развитая шероховато-микропористая поверхность пор и наличие большого количества мелкихпор в стенках крупных пор, где всегда есть питательная среда, являются подходящими условиями для роста и размножения клеток . Таким образом, пористый проницаемый матрикс из никелида титана является биосовместимым носителем клеточных культур тканей организма, а стромально-васку-лярная фракция не только стимулирует процессы регенерации, но и подавляет воспаление в зоне имплантации за счет присутствия в ней М2 поля-ризированных макрофагов, а также способствует процессам реваскуляризации за счет эндотели-альных предшественников
Частичное отсутствие зубов является одним из самых распространенных заболеваний: по данным Всемирной организации здравоохранения, им страдают до 75% населения в различных регионах земного шара . Лечение таких пациентов осложняется тем, что у них наиболее часто встречаются изменения параметров альвеолярных отростков челюстей В последнее время применяются различные методы, направленные на увеличение и оптимизацию параметров альвеолярных отростков . Наращивание же костной ткани в зоне сегментарного дефекта челюстей с использованием остеокондуктивных материалов, насыщенных стромально-васкулярной фракцией жировой ткани является перспективной методикой увеличения кости в объеме .
Наше исследование нацелено на изучение особенностей формирования костной ткани альвеолярных отростков челюстей при использовании остеокондуктивных материалов, насыщенных стро-мально-васкулярной фракцией жировой ткани .
Материал и методы
Исследования проведены в экспериментальной лаборатории кафедры патологии мелких животных и оперативной хирургии Казанской академии ветеринарной медицины им . Н . Э . Баумана . Выделение стромально-васкулярной фракции, а также гистологические исследования производилось в Институте фундаментальной медицины и биологии и НОЦ фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета
Объектом исследования служила собака Возраст 4 года, масса тела 12—13 кг . Животному предварительно (за полгода) создавался дефект альвеолярного отростка челюсти, путем удаления премоля-ров и моляров Наркоз: внутримышечно аминазин 1,0 мл и 2% раствор рометара (2% раствор кси-лазина гидрохлорида) из расчета 0,1 мл/кг; внутривенно 1% водная эмульсия пропофола из расчета 0,6 мл/кг . Местно в области планируемой операции проводили проводниковую анестезию 4% раствором артикаина — 1,8 мл.
Стерильно, с помощью портативной бормашины, дисков, под непрерывным водяным охлаждением, производили распил зубов . Затем зубы расшатывались раскачивающими движениями элеватором, удалялись щипцами Спустя полгода в области атрофированного участка нижней челюсти, предварительно сделав рентгеновский снимок, делался разрез по гребню альвеолярного отростка, отслаивался слизсто-надкостничный лоскут . Клетки СВФЖТ в комбинации с остеокондуктивными материалами (пористые никелид-титановые гранулы) помещали в зону дефекта альвеолярного отростка, сверху укладывалась мембрана-ксеногенный костный матрикс и рана ушивалась (рис 1) В последующем после операции, через 1, 3 и 6 мес выполняли рентгеновские снимки, для изучения динамики роста костной ткани
Рис. 1. Альвеолярный отросток нижней челюсти собаки через 6 мес. после операции с использованием остеокондуктивных и остеоиндуктивных материалов (N¡7.1 гранулы, стромально-васкулярная фракция выделенная из жировой ткани) : внешний вид и рентгенограмма
Забор жировой ткани проводился под общим наркозом . Образец ткани был доставлен в лабораторию в стерильном контейнере с физиологическим раствором в течение 1 ч Все манипуляции по выделению СВФЖТ проводились в стерильных условиях при ламинарном токе воздуха . СВФЖТ была получена в результате ферментативной обработки гомогенези-рованной жировой ткани собаки 0,2% раствором коллагеназы краба (Биолот, Россия) в DPBS (Пан-Эко, Россия) при 37°С в течение 1 ч . на качающейся платформе . После чего из суспензии отдельных клеток путем центрифугирования выделяли осадочную фракцию клеток стромально-васкулярного фенотипа Супернатант удаляли, осадок трехкратно промывали физиологическим раствором (Биолот, Россия), осаждая центрифугированием
Забор материала из альвеолярного отростка собаки после проведения операции по восстановлению дефекта, проводили через 1, 3, 6 мес следующим образом: стерильно под наркозом отслаивали сли-зисто-надкостничный лоскут при помощи боров, охлаждая физ раствором, распиливали костный блок, помещали материал в 10-процентный формалин
Для морфологического исследования процессов, протекающих вокруг костных блоков, предварительно удаляли пористый порошок, используя методику глубокого травления (раствор со следующими ингредиентами: 40% раствор плавиковой кислоты 220 г; металлический цинк 100 г; этиленгликоль 800 г, опускают в приготовленный раствор костный блок из титана и никелид-титана, выдерживают 7 дней) [8], препараты костных блоков декальцинировали, делали парафиновые срезы и окрашивали гемато-
ксилином и эозином и по Ван Гизону . Далее проводили радиовизиографические исследования В основе методики радиовизиографии лежит оценка плотности костных структур: одномоментная регистрация на пластинке датчика отображения исследуемой области экспериментального материала с материнской костью и дальнейшее исследование на мониторе компьютера [9]. Определяется нормированный индекс плотности I, равный отношению денситометрических показателей визиографа, регистрируемых в исследуемой области и в области материнской кости (I = 1н/1к) . Изучение плотности исследуемой новообразованной ткани проводили с пористым никелид-титановым материалом и после его удаления с помощью метода глубокого травления [10] из препаратов.
Результаты и обсуждение
Гистологические исследования кости показали, что через 1 мес в подмембранном пространстве отмечается формирование зрелой волокнистой соединительной ткани Фиброзная ткань на границе с мембраной начинала замещаться грубо-волокнистой костью, балки которой заполняли пространство вокруг никелид-титановых структур . Дефект челюсти был заполнен ретикулофиброзной костной тканью с балочным строением, по периферии выявлялись гигантские многоядерные клетки, в межбалочных пространствах выявлялись кровеносные сосуды
Через 3 мес . происходит перестройка грубо-волокнистой кости в зрелую компактную, наблюда-
ются пластинчатые костные структуры, которые имели ячеистый вид вокруг никелид-титановых структур на границе с мембраной . Наблюдается формирование зрелой кости и восстановление мягких тканей с нормальным многослойным плоским неороговева-ющим эпителием . Новообразованная костная ткань имеет ячеистый вид, поскольку образовалась вокруг гранул никелид-титанового порошка, удаленных путем глубинного травления
Через 6 мес в подмембранном пространстве выявляется зрелая пластинчатая костная ткань с гавер-совыми каналами и кровеносными сосудами, плотно связанная мембраной в виде ячеек Имеет место заживление костной раны путем формирования пластинчатых костных структур с хорошо развитой системой гаверсовых каналов (рис . 2).
В препаратах с интегрированными никелид-ти-тановыми гранулами (до глубокого травления) показатели нормированного индекса плотности кости к 6 мес . выше единицы, что объясняется влиянием плотности пористого никелид-титанового материала . В препаратах, где никелид-титановые гранулы удаляли по методу глубокого травления, индекс плотности костной ткани к 6 мес близок к единице (табл , рис 3)
Сканирующая электронная микроскопия через 6 мес показывает полное восстановление костной ткани в подмембранном пространстве
Проведенное экспериментальное исследование демонстрирует, что заживление раны и восстановление полноценной гистологической структуры мягких и костных тканей происходит быстрее при применении
Ш
Рис. 2. Структура костного блока на месте имплантации: А — через 1 мес.; Б — через 3 мес.; В — через 6 мес. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.х200
Таблица. Индекс плотности костной ткани до и после глубокого травления
Срок 1 мес. 3 мес. 6 мес.
1к, % 1н, % I 1к, % 1н, % I 1к, % 1н, % I
До травления 100 57 0,57 100 85 0,85 100 117 1,17
После травления 100 45 0,45 100 73 0,73 100 98 0,98
1,4 1,2
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
□ До травления ■ После травления
Рис. 3. Индекс плотности костной ткани до и после глубокого травления
1 мес.
3 мес.
6 мес.
СВФЖТ в комбинации с никелид-титановыми гранулами, по сравнению с вариантом, когда СВФЖТ не использовалась [6]
Заключение
Применение клеток СВФЖТ в стоматологии открывает широкие возможности для использования клеточных технологий в челюстно-лицевой хирургии, пародонтологии и имплантологии . По результатам проведенного экспериментального исследования с использованием СВФЖТ в комбинации с нике-лид-титановыми гранулами и пористой мембраной создаются благоприятные условия для регенерации костной ткани в подмембранном пространстве и открываются новые возможности наращивания костной ткани по заданной высоте и анатомической форме гребня альвеолярного отростка при тканеде-фицитных состояниях
Таким образом, полученные результаты демонстрируют целесообразность применения предлагаемого способа костной пластики для устранения
дефектов кости Способ характеризуется малой инвазивностью, иммунологической и онкогенной безопасностью, не требует существенных материальных затрат и может быть применен в практической ветеринарии
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 15-04-07527_а. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Грудянов А . И ., Зорин В . Л ., Зорина А . И ., Степанова И . И . . Клеточные технологии в пародонтологии . Стоматология 2009; 1: 71-3 .
2 . Фролова Е . Н . , Мальгинов Н . Н ., Григорьян А . С . и др . Заживление костного дефекта в челюсти кроликов под влиянием ксено-генных мезенхимных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановых носителях . Российский стоматологический журнал 2008; 3: 12-4 .
3 . Масгутов Р . Ф . , Ризванов А.А., Салафутдинов И . И . и др . Коррекция дефекта мягких тканей лица с применением аутогенной жировой ткани, обогащенной клетками стромально-васкулярной фракции Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 3: 177-9 .
4 . Масгутов Р . Ф ., Салихов Р . З ., Плаксейчук Ю . А. и др . Применение клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани при ложном суставе бедренной кости: клинический случай Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 3: 116-8 .
5 . Кулаков А .А ., Григорян А . С ., Киселева Е . В . Устранение критических костных дефектов с помощью биоинженерной конструкции на нерезорбируемой полимерной основе с использованием аутоген-
ных мультипотентныхстромальных клеток из жировой ткани . Стоматология 2010; 3: 9-12 .
6 . Азизова Д .А . Экспериментально-клиническое обоснование применения пористых материалов на основе сплава никелида титана для наращивания объема костной ткани в зонах дентальной имплантации . Автореф . дис . ...канд . мед . наук . Казань . 2012 .
7 . Хафизов Р . Г ., Азизова Д .А ., Миргазизов М . З . и др . Особенности изготовления пористой мембраны из сплава никелида титана для направленной тканевой регенерации . Ученые записки КГАМ им . Н . Э . Баумана 2012; 209: 330-5 .
8 . Миргазизов М . З ., Хафизов Р . Г., Лунин В . Г . и др . Способ адресной доставки остеопластических материалов, содержащих факторы роста и регенерации костной ткани . Патент на изобретение RUS 2469676 от 31. 05 . 2011.
9 Хафизов Р Г , Миргазизов М З , Азизова Д А и др Особенности восстановления сегментарного дефекта альвеолярной части нижней челюсти у собак . Ученые записки КГАМ им . Н . Э . Баумана 2012; 209: 335-9 .
10 . Миргазизов М . З ., Миргазизов Р . М ., Хафизова Ф .А и др . Метод глубокого травления Патент на изобретение RUS2464646 от 31 05 2009
Поступила: 08.11.2015
