CC BY
12УДК 633.1:631.531.1+632.4
ПРИМЕНЕНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЕМОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ СЕМЯН ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР, ИНФИЦИРОВАННЫХ
FUSARIUM CULMORUM
А.В. Воробей*, С.В. Пинчук*, С.Ф. Буга**
*Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск **Институт защиты растений НАН Беларуси, п/о Прилуки
Изучена возможность применения фотосенсибилизируемого воздействия с использованием протопорфирина IX и тетраметилпиридилпорфина для обеззараживания семян зерновых культур от Fusarium culmorum (W.G.Smith) Sacc. Установлено, что фотосенсибилизируемая обработка инфицированных семян эффективно подавляет поверхностное развитие фузариоз-ной инфекции при прорастании семян. Положительно заряженный тетраметилпиридилпорфин по сравнению с гидрофобным протопорфирином IX проявляет более высокую активность в сенсибилизации фотоинактивации конидий. Показано, что фотосенсибилизируемое воздействие в инактивирующих споры дозах не снижает жизнеспособность семян, физиологические и биохимические показатели их проростков.
Ключевые слова: фотосенсибилизация, порфирины, инактивация конидий, F. culmorum, семена.
Болезни сельскохозяйственных растений, вызванные патогенными грибами, приводят к существенному снижению продуктивности культур и ухудшению качества урожая. Несмотря на огромные затраты на защиту растений от патогенов фитосанитарное состояние посевов сельскохозяйственных культур в Белоруссии остается тревожным. Возможен рост отдельных грибных заболеваний до эпифитотийного уровня и временного прекращения выращивания некоторых культур.
Одним из основных путей распространения инфекции является использование инфицированных семян. Поэтому разработка эффективных методов снижения зараженности семян грибной инфекцией является актуальной в растениеводстве. В настоящее время фун-гицидная обработка семян проводится, как правило, с использованием химических протравителей, применение которых не всегда освобождает семена от инфекции и может индуцировать появление резистентных форм патогенов (Буга, 2000). Ранее (Пинчук и др., 2006; Воробей, Пинчук, 2008) нами было показано, что в суспензиях конидий грибов рода Fusarium гидрофобный краситель протопорфирин IX (ПП) и положительно
заряженный 5,10,15,20-тетракис(4^-метилпиридил)порфин (ТМПП) связываются с конидиями и при действии света видимого диапазона ингибируют их прорастание в питательной среде. Это является следствием фотосенсиби-лизируемого окисления мембранных ли-пидов и белков. Полученные результаты свидетельствуют, что фотосенсибилизи-руемое воздействие (ФСВ) может являться одним из перспективных способов достижения фунгицидного эффекта. Известны данные об успешном применении ФСВ в медицине для подавления вирусной (Moor et al., 1999; Квачева и др., 2003), бактериальной (Maisch et al., 2004; Demidova, Hamblin, 2005) и грибной (Страховская и др., 2002, Calzavara-Pinton et al., 2005) инфекций. Однако возможность использования ФСВ для обеззараживания семян сельскохозяйственных культур от патогенных микроорганизмов до настоящего времени практически не исследована. Цель настоящей работы - изучение физиологических и биохимических показателей проростков, выросших из инфицированных конидиями F. culmorum семян ячменя и пшеницы, необработанных и подвергнутых ФСВ с использованием ПП и ТМПП.
Методика исследований
В работе использовали ПП и ТМПП фирмы Sigma, остальные реактивы - отечественного производства "хч" или "чда".
Объектами исследования являлись конидии гриба F. culmorum, выделенного из пораженных зерновок ярового ячменя. Инфицирование семян ячменя (сорт Гонар) и пшеницы (сорт Капылянка) проводили методом инокуляции. Семена помещали в чашки Петри (по 100 шт) бороздками вверх и на их поверхность наносили 10 мкл суспензии конидий F. culmorum (106 конидий/мл) в 0.05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7.4) или 10 мкл буфера (контроль). Далее семена высушивали при комнатной температуре в течение суток.
Освещение семян проводили в 0.05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7.4), содержащем 4-10"6М ПП или ТМПП. галогеновой лампой, 150 Вт/м2, обеспечивающей свет видимого диапазона. Перед освещением семена помещали в чашку Петри (50 шт), добавляли 20 мл содержащего фотосенсибилизатор раствора и выдерживали при температуре 20°С в темноте в течение 1 часа. Доза освещения семян в присутствии ПП - 800 кДж/м2, ТМПП -300 кДж/м2. В процессе освещения семена перемешивали каждые 10 мин.
Проращивание семян осуществляли в пластмассовых контейнерах (15x30 см) с использованием в качестве влажной основы двойной марли. После посева семена накрывали влажной фильтровальной бумагой и выдерживали в течение 3 (пшеница) и 4 (ячмень) суток в темноте при комнатной температуре. Далее семена проращивали в условиях освещения (2 люминесцентные лампы ЛД-20) в следующем режиме: 10 часов свет (7-8 кЛк) и 14 часов темнота.
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в проростках определяли с использованием ТБК-теста (Лукаткин, Голованова, 1988). Экстракцию пигментов фотосинтетического аппарата из проростков проводили в 100% ацетоне. Для
этого 200 мг листьев (использовали среднюю часть листа) растирали в фарфоровой ступке, заливали 5 мл ацетона и экстрагировали в течение 12 часов в темноте при комнатной температуре. Перед измерением экстракты разводили ацетоном в 4-5 раз. Расчет содержания хлорофилла и каротиноидов проводили по следующим формулам (Шлык, 1965):
Схл(а+в) = 5.134xD662 + 20.436xD644 (1)
Скар = 4.695xD440.5 - 0.268x Схл(а+в), (2) где С - концентрация в мг/л, D - оптическая плотность раствора при указанных длинах волн.
Для определения количества связывающегося с семенами ПП или ТМПП в чашки Петри помещали по 10 семян ячменя или пшеницы, добавляли 4 мл 0.05 М натрий-фосфатного буфера, содержащего красители в концентрации 410 -6 М, и инкубировали при температуре 20°С в темноте в течение 2 часов. Связывание порфиринов определяли по снижению их концентрации в среде инкубации, для чего к 0.2 мл среды добавляли 1.8 мл 1.5 н HCl и фотометрировали. Содержание красителей в отобранных образцах определяли по калибровочной кривой зависимости поглощения ПП (407 нм) и ТМПП (448 нм) в среде от концентрации порфиринов.
Потребление кислорода зародышами семян ячменя и пшеницы определяли амперометрическим методом с использованием полярографической ячейки конструкции Шольца (Шольц, Островский, 1975). С помощью скальпеля и препаровальной иглы из зерен выделяли 15-20 зародышей и перед измерением помещали на 30 мин в 2 мл дистиллированной воды. Измерения проводили при температуре 20°С. Установку калибровали по выборке кислорода из среды ферментативной системой глюко-за+глюкозаоксидаза (концентрация реагентов 0.5 и 0.05 мг/мл соответственно). Для определения сухой массы зародышей их после регистрации дыхания высушивали на фильтровальной бумаге в течение суток.
Результаты исследований
При заражении семян F. culmorum низации патогенными грибами, в част-
снижается их всхожесть, масса проро- ности рода Fusarium (Пшибытко и др.,
стков и корней на 7-8 сутки проращива- 2006; Крючкова и др., 2007). Развитие
ния. У проростков инфицированных се- окислительного стресса у проростков мян наблюдаются также нарушения в семян при фузариозной инфекции под-
функционировании фотосинтетического тверждается увеличенным отношением аппарата: содержание хлорофилла и содержания в них каротиноидов (соеди-
каротиноидов снижается по сравнению с нения с выраженными антиоксидантны-
контролем на 20-41 и 11-31% соответст- ми свойствами) к хлорофиллу (Hendry,
венно (табл. 1 и 2). Приведенные в таб- Price, 1993).
лице 1 данные свидетельствуют также После освещения обработанных
об увеличении содержания продуктов ТМПП инфицированных семян иссле-
ПОЛ в проростках инфицированных се- дуемые показатели проростков практи-
мян ячменя, что согласуется с литера- чески не отличаются от контрольных
турными данными о развитии окисли- (неинфицированных) семян. После ФСВ
тельного стресса в растениях при коло- обеспечивается густота и высота проро-
стков, снижается накопление в них окисленных липидов (табл. 1).
Содержание хлорофилла и кароти-ноидов в проростках, их всхожесть, масса проростков и корней у семян
Вестник защиты растений, 4, 2010 пшеницы, подвергнутых ФСВ в присутствии ТМПП, достигают значений, характерных для неинфицированных семян, а у ячменя даже превышают их (табл. 1 и 2).
Таблица 1. Влияние ФСВ на всхожесть, ростовые и физиологические характеристики _8-дневных проростков ячменя, инокулированных конидиями F.culmorum_
Масса Масса корней, мг Хлоро- Кароти- Кароти-
Варианты Всхо-жесть,% проростков, мг филл (а+в), мг/гр ноиды (а+в), мг/гр ноиды /хлорофилл ТБК-пр, нмоль/гр
Контроль 88.0+1.0 87.3+1.8 90.5 + 1.5 1.23+0.09 0.37+0.03 0.30 21.3+0.5
Е.сЫтотт 68.0+2.0 79.0+2.0 70.0+2.0 0.98+0.06 0.33+0.03 0.34 25.1+0.3
Е^то/тыт + ПП 77.0+2.0 88.5+1.3 77.0+2.5 1.05+0.05 0.33+0.03 0.31 23.8+0.3
Е.сЫтотт +
ТМПП 93.0+2.0 92.5+1.5 105.0+2.5 1.32+0.07 0.40+0.02 0.30 22.0+0.4
Таблица 2. Влияние ФСВ на всхожесть, ростовые и физиологические характеристики _7-дневных проростков пшеницы, инокулированных конидиями ЕсЫтотат_
Варианты
Всхо- Масса про- Масса кор- Хлорофилл Каротиноиды Каротиноиды
жесть, % ростков, мг ней, мг (а+в), мг/гр (а+в), мг/гр /хлорофилл
Контроль 96.0±1.0 473+18 40.1±1.5 1.90±0.10 052+0.03 027
F.culmorum 57.5+1.5 34.2+2.1 24.5 + 1.8 1.11+0.06 0.36+0.03 0.32
Е^то/тт + ПП 67.5+1.5 41.5 + 1.8 27.0+1.7 1.38+0.08 0.41+0.03 0.30 F.culmorum +
ТМПП 94.0+2.0 46.8+1.5 38.8+1.4 1.87+0.07 0.51+0.02 0.27
Вероятно, это связано с ингибирова-нием прорастания локализованных на них конидий Е. суХтотт. Необходимо отметить, что проращивание инфицированных семян ячменя и пшеницы выявило их разную чувствительность к фуза-риозной инфекции: изменения физиологических и биохимических показателей проростков пшеницы по отношению к контролю значительно больше выражены по сравнению с семенами ячменя (табл. 1 и 2). Тем не менее, применение ФСВ с использованием ТМПП оказалось высокоэффективным при освещении семян обеих культур. Кроме того, близкие показатели исследуемых параметров проростков контрольных семян и инфицированных семян, подвергнутых ФСВ в присутствии ТМПП, свидетельствуют также, что использование данного катионного порфирина не влияет на физиологические свойства самих семян. В то же время исследуемые показатели проростков инфицированных семян, освещенных в
присутствии ПП, занимают промежуточное положение между контрольными и инфицированными (без последующего ФСВ). Данный результат может быть следствием либо недостаточного подавления развития фузариозной инфекции, либо иных причин.
Сохранение посевных качеств семян после ФСВ является важным условием применимости данного вида воздействия для обеззараживания посевного материала сельскохозяйственных культур от микопатогенов. Проведенные исследования показали, что замачивание семян ячменя и пшеницы в течение 2 часов в 0.05М натрий-фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии ПП или ТМПП в эффективных для оказания фотофунгицидного действия на конидии Е. сптотпт концентрациях (410-6 М) приводит к связыванию 6.0 нмоль/г семян ПП и 23.0 нмоль/г семян ТМПП. Следовательно, последующее освещение может индуцировать деструктивные окислительные
Вестник защиты, растений, 4, 2010 процессы в самих семенах и, как следствие, снизить их посевные качества. Несмотря на меньшее связывание с семенами ПП по сравнению с ТМПП его ФСВ на семяна может оказаться более выраженным, так как молекулы катионного и гидрофобного порфиринов, очевидно, будут иметь различную локализацию в семенах. Для выявления возможных отрицательных последствий ФСВ на семена мы исследовали влияние ФСВ в эффективных для подавления фузариозной инфекции дозах на такой физиологический показатель семян, как дыхание зародышей. Ранее (Авторское свидетельство, 2008) нами было установлено наличие положительной корреляции между жизнеспособностью семян злаковых растений и дыханием выделенных из них зародышей.
На рисунке представлены данные о скорости поглощения кислорода зародышами, выделенными из контрольных (замачивание с порфиринами в течение 2 часов без последующего освещения) и подвергнутых ФСВ семян ячменя и пшеницы. Зародыши контрольных семян ячменя и пшеницы поглощают 0.94±0.03 и 1.18±0.01 нмоля 02 в минуту на 1 мг сухого веса соответственно. После замачивания семян в присутствии ПП и освещения в дозе 800 кДж/м2 скорость поглощения кислорода зародышами составляет, соответственно, 0.94±0.05 и 1.19±0.03, то есть не изменяется по сравнению с дыханием зародышей контрольных семян. ФСВ на семена ячменя и пшеницы в присутствии ТМПП (300 кДж/м2) также не изменяет дыхание зародышей: скорость поглощения кислорода зародышами составляет 0.96±0.03 и 1.18±0.03 нмоля 02 в минуту на 1 мг за-
родышей соответственно. Полученные данные указывают на то, что освещение в присутствии как гидрофобного ПП, так и положительно заряженного ТМПП в дозах, вызывающих подавление грибной инфекции на семенах, не оказывает влияния на дыхание зародышей семян ячменя и пшеницы и, следовательно, на жизнеспособность семян.
1,5
1
0,5
О
Ячмень Пшеница
Рис. Влияние ФСВ с использованием ПП и ТМПП на скорость поглощения кислорода зародышами семян ячменя и пшеницы.
В целом результаты работы свидетельствуют о том, что ФСВ на инфицированные си1тогит семена пшеницы и ячменя эффективно подавляет развитие инфекционного начала при прорастании семян. Положительно заряженный ТМПП по сравнению с гидрофобным ПП проявляет более высокую активность в сенсибилизации фотоинактивации локализованных на семенах конидий си1тогит. ФСВ в дозах, инактивирую-щих инфекционное начало на семенах, не снижает жизнеспособность семян, физиологические и биохимические показатели полученных из них проростков.
Авторское сидетельство, BY (11) 11331, МПК А 01С 1/00, 2008.
Буга С.Ф., Радына A.A., Боярчук В.Е. Мониторинг чувствительности популяций гриба Fusarium nivale к фун-дазолу // Микология и фитопатология, 2000, 34, с.63-67.
Воробей A.B., Пинчук С.В. Сенсибилизируемые про-топорфирином IX фотоповреждения спор грибов рода Fusarium // Биофизика, 2008, 53, с. 797-801.
Квачева З.Б., Шуканова H.A., Вотяков В.И. и др. Фо-
тодинамическое ингибирование инфекции, вызванной устойчивыми к лекарственным препаратам вариантами вируса простого герпеса первого типа // Бюлл. эксп. биологии и медицины, 2003, 135, с.450-454.
Крючкова JI.A., Маковейчук Т.И., Драговоз И.В., Курчий Б. А. Активация окислительных процессов в растениях озимой пшеницы под воздействием Fusarium graminearum // Физиол. и биохимия культ, растений, 2007, 39, с. 522-530.
Лукаткин A.C., Голованова B.C. Интенсивность пере-кнсного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений // Физиол. растений, 1988,35, с. 773-780.
Пинчук C.B., Артемова О.В., Буга С.Ф. Сенсибилизированное порфиринами фотоповреждение грибов Fusarium culmorum в культуре // Сборник статей Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. VII съезд БООФиБ (21-23 июня 2006 г.. Минск). Право и экономика, 2006, 2, с. 89-91.
Пшибытко H.JL, Зеневич JI.A., Кабашникова Л.Ф. Состояние фотосинтетического аппарата в процессе фузари-озного увядания томатов // Физиол. растений, 2006, 53, с. 31-37.
Страховская М.Г., Жуховицкий В.Г., Миронов А.Ф. и др. Фунгицидная активность хлориновых фотосенсибилизаторов // ДАН. 2002. 384. с. 263-2669.
Шлык A.A. Метаболизм хлорофилла в зеленом растении. Мн.. Наука и техника. 1965. 396 с.
Шольц Х.Б.. Островский Д.Н. Ячейка для амперомет-
рического определения кислорода // Методы современной биохимии: СПб. М, Наука. 1975. с. 52-58.
Calzavara-Pinton P.O.. Venturini М.. Sala R. A comprehensive overview of photodynamic therapy in the treatment of superficial limgal infections of the skin // J. Photochem. Photobiol.. В.. 2005. 78. p. 1-6.
Demidova T.N.. Hamblin M.R. Photodynamic inactivation of Bacillus spores, mediated by phenothiazinium dyes // Appl. Environ. Microbiol.. 2005. 71.'p. 6918-6925.
Hendry. G.A.F. Price A.H.. Stress indicators: chlorophylls and carotenoids // In: Methods in comparative plant ecology. Eds. Hendry G.A.F.. Grime J.P. London. Chapman and Hall. 1993. p.148-152.
Maisch Т.. Szeimies R-M.. Jori G.. Abels C. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology // Photochem. Photobiol. Sci.. 2004. 3. p. 907-917.
Moor A.C.E. van der Veen A.. Dubbelman T.M.A.R et al. Photodynamic sterilization of red cells and its effect on contaminating white cells: viability and mechanism of cell death // Transfiision. 1999. 39. p. 599-607.
DISINFECTION OF GRAIN CROP SEEDS INFECTED WITH FUSARIUM CULMORUM USING PHOTOSENSITIZING ACTION A.V.Vorobey, S.V.Pinchuk, S.F.Buga The possibility of application of photosensitizing action with use of Protoporphyrin IX and Tetramethylpyridylporphyn for disinfection of grain crop seeds infected with Fusarium culmorum-was studied. It was established that photosensitizing treatment of seeds infected with spores of F. culmorum effectively suppressed the development of fusarium infection at the stage of seed germination. Positively charged Tetramethylpyridylporphyn showed higher activity in sensitization of spore photoinactivation in comparison with hydrophobic Protoporphyrin IX. It was shown that photosensitizing action in doses causing inactivation of spores did not reduce the viability of seeds, as well as the physiological and biochemical parameters of their sprouts.
Keywords: photosensitization, porphyrins, spore inactivation, Fusarium culmorum,
А.В.Воробей, к.б.н., [email protected] С.В.Пинчук, к.б.н., [email protected] С.Ф.Буга, д.с.-х.н., проф., тел. +375-(17) 509-23-55
