CC BY
49
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Тишин А.Н., Покровский М.В., Тишина О.М., Сернов Л.Н., Степченко А.А., 2017 DOI:10.23888/PAVLOVJ20174551-564
ПРИМЕНЕНИЕ ЭНТЕРОСОРБЕНТА НА ОСНОВЕ МОНТМОРИЛЛОНИТА
ПРИ ОСТРОЙ ДИАРЕЕ (экспериментальное исследование)
А.Н. Тишин1, М.В. Покровский2, О.М. Тишина3, Л.Н. Сернов2, А.А. Степченко4
БУЗ ОО Орловская областная клиническая больница, бульвар Победы, 10, 302028, г. Орел, Российская Федерация (1) ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет, ул. Победы, 85, 308015, г. Белгород, Российская Федерация (2) ФКУЗ «Медико-санитарная часть УМВД России по Орловской области», ул. Салтыкова-Щедрина, 37, 302028, г. Орёл, Российская Федерация (3) ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет, ул. К. Маркса, 3, 305041, г. Курск, Российская Федерация (4)
Цель. Изучить противодиарейную активность энтеросорбента на основе монтмориллонита на модели серотонин-индуцированной диареи. Материалы и методы. Исследование проведено на лабораторных мышах обоего пола, острая диарея индуцировалась внутрибрюшинным введение серотонина гидрохлорида в дозе 0,32 мг/кг, энтеросорбент в виде водной суспензии вводили перорально в широком диапазоне доз за 30 минут до введения серотонина. В течении 4 часов учитывали время наступления диареи, количество дефекаций, содержание жидкости в каловых массах. Проводили морфологическое исследование тонкой кишки. Результаты. Введение серотонина приводило к развитию диареи у 100% животных в течении 12,8±1,2 минут, количество дефекаций увеличивалось в 2,5 раза по сравнению с интактными животными и составило 19,5±0,5 раз за 4 часа, дефекации были преимущественно влажными и жидкими. Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 в максимальной используемой дозе приводило к задержке развития диареи до 73,6±4,1 минут, сокращению количества дефекаций до 9,4±0,1 и значительному уплотнению каловых масс. Противодиарейный эффект энтеросорбента подтвержден морфологически. Выводы. Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 обладает дозозависимой противодиарейной активностью при моделировании серотонин-индуцированной диареи.
Ключевые слова: энтеросорбент, монтмориллонит, диарея, противодиарейная активность.
Одним из самых распространенных заболеваний, имеющих водное или пищевое происхождение, является диарея. По данным ВОЗ, диарея является одной из ведущих причин смертности в мире. Несмотря на то, что смертность от диареи в последние годы сократилась, в 2015 году в мире от диарейных заболеваний погибло 1,39 млн человек, большинство из которых
дети. Ежегодно регистрируется более 1,7 млрд случаев диареи в мире [1,2].
В качестве адъювантной терапии острых диарей, в том числе и у детей, используется метод энтеросорбции [3,4]. Особый интерес в этом отношении представляет минеральное сырье, в частности монтмориллонит. Монтмориллонит относится к слоистым минералам из группы
смектита. Диоктаэдрический смектит, имеющий сходную с монтмориллонитом структуру, пользуется повышенным спросом у населения России [5]. Минералы смектитовой группы обладают противо-диарейным и цитомукопротекторым эффектами, имеют высокую сорбционную активность в отношении токсинов бактерий при пероральном применении [6-11].
В настоящий момент на российском фармацевтическом рынке нет минерального энтеросорбента на основе отечественного сырья [12]. Разработка лекарственных препаратов на основе отечественных субстанций является актуальной задачей для здравоохранения и фармацевтической промышленности и согласуется со «Стратегией Фарма-2020» [13].
Цель исследования - провести доклиническое изучение противодиарей-ной активности энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 на модели серотонин-индуцированной диареи.
Материалы и методы
Работа была выполнена на базе ФГАОУ «Белгородский государственный университет» в лаборатории доклинических исследований. Все этапы исследования были выполнены с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU].
Объект исследования
Объектом исследования явился опытный образец энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 на основе монтмориллонита крымского месторождения, предоставленный ООО «Крымфармамед». Опытный образец энтеросорбента Crim_04 представляет собой порошок от желтоватого- или серовато-белого цвета до серовато-или коричневато-жёлтого цвета с запахом ванилина. Массовая доля монтмориллонита составляет 62,4%, серебра - 0,15%. Размер наиболее часто встречающихся частиц в суспензии составляет 7,08 мкм.
Препараты сравнения: энтеросорбент «Смекта» (Beaufuor Ipsen Industrie», Фран-
ция) и препарат лоперамид («ТапББеп-СП৻, Франция).
Лабораторные животные, экспериментальные группы
Исследования проведены на 140 лабораторных мышах обоего пола массой 25±2г. Животные были получены из вивария ФГАОУ «Белгородский государственный университет».
Диарею вызывали внутрибрюшин-ным введением серотонина гидрохлорида (5-гидрокситриптамин - 5-ГТ) (Н9523, 81§ша-АЫпск, США) в дозе 0,32 мг/кг (п=20 животных) [14]. Серотонина гидрохлорид применялся через 30 минут после внутрижелудочного введения энтеросор-бентов и лоперамида. В группе интактных животных внутрибрюшинно применялся 0,9% раствора натрия хлорида 10 мл/кг (п=20 животных).
В экспериментальных группах животным внутрижелудочно однократно вводили водные суспензии энтеросорбен-тов Спш_04 в дозах 880 мг/кг, 1660 мг/кг, 3320 мг/кг и препарата «Смекта» в дозе 1660 мг/кг, лоперамида в эффективной дозе 10 мкг/кг, полученных с учетом пересчета доз со средней терапевтической суточной дозы для человека. В контрольной группе животные получали эквиобъемное количество 0,9% раствора натрия хлорида.
После моделирования патологии мыши по одной располагались на белом листе бумаги для оценки времени наступления диареи и подсчета количества дефекаций в течении 4 часов. Бумажное покрытие менялось каждый час. Для подсчета выраженности ингибирования (ВИ) диареи использовали следующую формулу:
ВИ(%) =[(Дк-Ди)/Дк] х 100%, где Дк - количество влажных и жидких дефекаций в контрольной группе, Ди - количество влажных и жидких дефекаций в исследуемых группах. Подсчет коэффициента выраженности диареи (КВД) осуществляли с помощью балльной шкалы оценки консистенции каловых масс: 1 балл - нормальные экскременты, 2 - полужидкие, влажные дефекации, 3 балла - жидкие дефекации. Показатель рассчитывался по формуле:
где N - количество нормальных экскрементов, S - количество полужидких экскрементов, L - количество жидких экскрементов, AD - общее количество дефекаций за время наблюдения. Стрессовые дефекации в начале эксперимента при подсчете общего количества каловых выходов в процессе эксперимента не учитывались.
По истечении 4 часов наблюдения животные под эфирным наркозом выводились из эксперимента.
Морфологическое исследование Для гистологического исследования у животных забирали участки ткани тонкого кишечника. При этом участки тканей фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, с последующей заливкой в парафин. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 5-7 мкм. Окраску проводили гематоксилин-эозином. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе «Микмед-6» (ЛОМО, Санкт-Петербург), анализ изображений осуществлялся с помощью программы «Микро-анализ Pro» (ООО «ЛОМО-Микросистемы», Санкт-Петербург). Статистический анализ Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2010 и STATISTIKA 6.0 для Windows. Средние значения изучаемых показателей представлены в виде (М±т), где М - среднее арифметическое, а m - стандартная ошибка среднего. Для анализа различий показателей между группами использовали t-критерий Стью-дента. Достоверным считали различие сравниваемых показателей при p<0,05.
Результаты и их обсуждение Было установлено, что внутрибрю-шинное введение серотонина гидрохлорида в дозе 0,32 мг/кг в течении 15 минут вызывало диарею у 100% животных с выраженным увеличением количества дефекаций со значительным преобладаем водянистых каловых масс в сравнении с ин-тактными животными (рис. 1).
Как видно из рисунке 1 А применение энтеросорбента под шифром Crim_04 значительно задерживало наступление
диареи. При этом диарея наступала более чем в 5,5 раза позже, чем в контрольной группе. Этот эффект был наиболее выражен при применении энтеросорбента в дозе 3320 мг/кг.
Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 снижало количество дефекаций у мышей при моделировании се-ротонин-индуцированной диареи. При этом было установлено, что применение энтеросорбента Crim_04 в дозе 3320 мг/кг вызывало ингибирование развития диареи на 52,1%, что выражается в уменьшении количества влажных и жидких дефекаций по сравнению с контрольной группой. Этот результат достоверно выше, нежели в группах где энтеросорбент применялся в дозах 880 мг/кг и 1660 мг/кг (26,7% и 35,9% соответственно). Для «Смекты» и лоперамида этот показатель составил 34,8% и 73,8% соответственно (рис. 1 Б).
При внутрижелудочном введении эн-теросорбента под шифром Crim_04 наблюдалось уменьшение содержания жидкости в каловых массах, дефекации были преимущественно влажные. Наиболее этот эффект выражен в группах животных, получавших энтеросорбент Crim_04 в дозе 3320 мг/кг (рис. 1 В).
Показатели энтеросорбента под шифром Crim_04 в средней терапевтической дозе 1660 мг/кг достоверно не отличались от эффекта диоктаэдрического смектита в такой же дозе. Вместе с тем, энтеросорбент под шифром Crim_04 и препарат «Смекта» значительно уступали лоперамиду по времени наступления диареи, общему количеству дефекаций и содержанию жидкости в каловых массах.
Морфологическое исследование
У животных контрольной группы макроскопически слизистая кишечника набухшая, отечная, розово-серого цвета, отдельными участками гиперемирована. Поверхность слизистой оболочки покрыта слегка мутной, полужидкой слизью, которая хорошо смывается водой.
Микроскопически слизистая отечна. Определяется укорочение и деформирование ворсинок. На концах некоторых ворсинок наблюдается слущивание эпителия с
108.?
51 Г
А
5-1 1 + 5-ГТ+
(КЯ41 мг/мг) N fti.ll мМкг)
?-ГТ+ лолгриши (1(1 яткг/ьт)
.......................II
Б
5ГГ+ 5-1Г+ 5.ГГ+ СгЦ11з4 Сг1ш_М
нг/и * нг'кт)
5-ГТ+ 5-1 Г + С»кЮ1* ликрищ нМ>-чкг.кг>
иг'К!']
2.-17-
]
1,0
1 -- 1
2,14'
В
5114 5-ГГ4 5-ГГ+ МТ+ 5-П +
Спн1_Ы С™_>4 (Нп, N СННЯЯ .....,р;ио|д
ней т/хг) (ЩЛ (пи, Щ^ьт)
мг/кг) мг/м| чг/кг)
Рис. 1. Дозозависимое влияние энтеросорбента под шифром Спш_04 на время наступления диареи (А, минуты), количество дефекаций (Б, число), консистенцию каловых масс (В, усл. ед.) при серотонин-индуцированной диарее у мышей.
Примечание: + - при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; * - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой; а - р<0,05 в сравнении группой Сйш_04 в дозе 880 мг/кг; Ь -р<0,05 в сравнении группой Спш_04 в дозе 1660 мг/кг; # - р<0,05 в сравнении с группой лоперамида
обнажением собственной пластинки слизистой. Определяется выраженная гипертрофия крипт. Кровеносные сосуды слизистой и подслизистого слоя полнокровны. Мышечная и серозная оболочки кишечника без изменений. В просвете кишки большое количество слизи (рис. 2 Б). Эти изменения не были характерны для ин-тактных животных (рис. 2 А).
В группах животных, получавших энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в дозах 3320 мг/кг, патологические изменения тонкой кишки заключались в незначительном отеке слизистой оболочки. Участков гиперемии слизистой не наблюдалось. Явления слущивания эпителия были минимальны, участков обнажения
собственной пластинки слизистой оболочки не наблюдалось. Кровенаполнение сосудов слизистой оболочки и подсли-зистого слоя было умеренным. Мышечный слой и серозная оболочка без патологических изменений (рис. 2 Г).
В контрольной группе с моделированием серотонин-индуцированной диареи выявлены уменьшение высоты ворсинок в 1,4 раза, увеличение ширины ворсинок у основания в 1,4 раза и глубины крипт в 1,2 раза по сравнению с интактными животными. Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 в дозе 3320 мг/кг значительно улучшало гистологическую картину тонкой кишки, приближая морфометрические показатели к уровню интактных животных (рис. 3).
•7 Ж /М V ■ j t S~ _ -, f I M J i .» \
¿iffî 'УУ / ¿¡fA * I * s wtf'JtF*^ ¥ ч
W$IWà*k s ■r lé
JM V' K fÂ: i t' f/ ЯГ* X Av ( ' ■1 Й w*s
Km- лг*t vJ% fi h^v^räiir л-, i- .
Л Wirf/iv: /лс/Ш > r 'fkJjV
А
Б
В
■jj.
Я*
х
V £ S*.- та
^ д
Л^ЭйкУй
Ш , Й "Шг1
V
ДО
Г
ÇWi ШЖЩ
Л да НУЛЖтШс^ Ш
тага
V/ t Er
a» Tir.
Д
-sf
Е
Рис. 2. Гистологическая структура тонкой кишки у мышей (микрофото х100): А - интактные животные; Б - контрольная группа; В - энтеросорбент Crim_04 в дозе 1660 мг/кг; Г - энтеросорбент Crim_04 в дозе 3320 мг/кг; Д - энтеросорбент «Смекта» 1660 мг/кг; Е - лоперамид 10 мкг/кг. Окр. гематоксилином и эозином
Интактные 5-ГТ 5-ГТ+ 5-ГТ+ 5ГТ+ 5ГТ+ Смекта 5ГТ+
Слт04 880 Crim_04 Crim_04 1660 мг/кг Лоперамид мг/кг 1660 мг/кг 3320 мг/кг 0,01 мг/кг
■ Дпина горсннок ширина горсинок ВДтнна горемнок п.бмна нрмпт
Рис. 3. Влияние энтеросорбента под шифром Сг1ш_04 на отношение длины ворсинок к ширине ворсинок и длины ворсинок к глубине крипт в тонкой кишке мышей при моделировании серотонин-индуцированной диареи (усл. ед.).
Примечание: * - при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой; а - р<0,05 в сравнении с группой Спш_04 в дозе 880 мг/кг
Серотонин является важной сигнальной молекулой, регулирующей секрецию кишечного эпителия, моторику стенок желудочно-кишечного тракта [15,16]. Механизм слабительного действия серотонина заключен, по-видимому, в стимуляции им 5-НТ3-рецепторов. Это приводит к повышению моторики желудочно-кишечного тракта, повышению кишечной секреции, как следствие накоплению в просвете кишки повышенного количества жидкости и её ускоренной эвакуации естественным путем [14,17]. При моделировании серотонин-ин-дуцированной диареи отмечалось раннее начало развития диареи у мышей (12,8±1,2 минут), резкое увеличение количества дефекаций и содержания в каловых массах жидкости (19,5±0,5 и 2,47±0,02 соответственно по сравнению с группой интактных животных - 7,9±0,04 и 1,0±0,0 соответственно).
Противодиарейный эффект энтеро-сорбента под шифром Спш_04 носил дозо-зависимый характер. Наибольшую активность энтеросорбент под шифром Спш_04 показывал в дозе 3320 мг/кг, что проявлялось увеличением времени наступления диареи, уменьшением общего количества дефекаций с уменьшением содержания жидкости в каловых массах на модели экспериментальной диареи. Этот эффект, по-видимому, связан с сорбцией излишне сек-ретированной жидкости в просвете кишки, повышением плотности каловых масс и, как следствие, с уменьшением скорости продвижения каловых масс по кишечнику [18].
Вывод
Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Спш_04 обладает дозозависимой проти-водиарейной активностью при моделировании серотонин-индуцированной диареи.
Конфликт интересов отсутствует.
Исследование выполнено в ходе 1 этапа государственного контракта
№ 14.N08.11.0109 от 19.09.2016.
Литература
1. Top 10 causes of death in the world. Geneva: WHO; 2017. Available at:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 310/ru. Accessed: 02.05.2017.
2. Diarrhea: Information Bulletin No. 330. Geneva: WHO; 2013. Available at:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 330/en. Accessed: 14.05.2017.
3. Carretero M.I., Pozo M. Clay and non-clay minerals in the pharmaceutical and cosmetic industries. Active ingredients // Appl. Clay Sci. 2010. №47. P. 171-181.
4. Liashenko N.V. Peculiarities of enterosorption via nasointestinal probe using sorbent diosmectite // Klin. Khir. 2014. Vol. 12. P. 16-18.
5. Бондарев А.В., Жилякова Е.Т. Анализ спроса на адсорбционные кишечные препараты при помощи индекса Выш-ковского // Фармация и фармакология. 2014. Vol. 6, №7. С. 114-116.
6. Новокшонов А.А., Соколова Н.В. Клиническая эффективность этиопатогене-тической терапии энтеросорбентами острых кишечных инфекций у детей // Consilium Medicum. 2009. №1. С. 4-8.
7. Bui Q.C., Nguen H.C., Vesentsev A.I., et al. The antibacterial properties of modified bentonite deposit tam bo // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2016. Vol. 2, №3. P. 63-74.
8. Bukhanov V.D., Vezentsev A. I., Filippova O.V. The influence of the concentration of montmorillonite containing sorbent and pH of the culture medium on the antibiotic sensitivity of Escherichia coli, as well as the effect of ground on growth of Escherichia // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2017. Vol. 3, №1. P. 97-104.
9. Hu C., Song J., You Z., et al. Zinc oxide-montmorillonite hybrid influences diarrhea, intestinal mucosal integrity, and digestive enzyme activity in weaned pigs // Biolo-gical trace element research. 2012. №149. P. 190-196.
10.Khediri F., Mrad A.I., Azzouz M., et al. Efficacy of diosmectite (smecta) in the treatment of acute watery diarrhea in adults: a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel group study // Gastroenterol Res Pract.
2011. Vol. 2011. P. 721-736.
11. Mujawar Q.M., Naganoor R., Ali M.D., et al. Efficacy of dioctahedral smectite in acute watery diarrhea in Indian children: a randomized clinical trial // J. Trop Pediatr.
2012. Vol. 58. P. 63-67.
12. Жилякова, Е.Т., Самсонов А.А., Голубев Н.Н., и др. Обзор российских эн-теросорбционных лекарственных средств // Ремедиум. 2014. №10. С. 40-47.
13. Фарма-2020 - экспертная площадка открытого обсуждения. Стратегия развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 г. [Электронный ресурс]. Доступно по URL: http://www.pharma2020.ru/ down-load/1594.html?pharma2020=0223e3cc41acc 42e5. Ссылка активна на 21.05.2017.
14. Kadowaki M., Nagakura Y., Tomoi M. Effect of FK1052, a potent 5-hydroxy-tryptamine 3- and 5-hydroxytryptamine 4 receptor dual antagonist, on colonic function in vivo // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol. 266. P. 74-80.
15. Парфенов А.И. Четыре варианта патогенеза и терапии диареи // Терапевтический архив. 2015. Т. 87, №12. С. 5-12.
16. Shcherbakov P., Trubitsyna I., Kirova M. Serotonin and Acetylcholine associated damage to microcirculation in gastric mucosa and cytokine changes in rats // Gastroenterology. 2011. Vol. 140. P. 318-319.
17. Dong Y., Yang C., Wang Z., et al. The injury of serotonin on intestinal epithelium cell renewal of weaned diarrhea mice // European Journal of Histochemistry. 2016. Vol. 60. №2689. P. 253-261.
18. Tishin A.N., Krut U.A., Tishina O.M., et al. Physico-chemical properties of montmorillonite clays and their application in clinical practice (review) // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2017. Vol. 3, №2. P. 119-128.
Тишин А.Н. - терапевт БУЗ ОО Орловская областная клиническая больница, г. Орёл, Российская Федерация. SPIN 3250-6576, ORCID 0000-0002-8286-8967, Researcher ID U-1072-2017. Е-mail: [email protected]
Покровский М.В. - д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии НИУ «БелГУ», г. Белгород, Российская Федерация. SPIN 9201-3580, ORCID 0000-0004-4895-1674, Researcher ID A-1573-2014.
Тишина О.М. - терапевт ФКУЗ «Медико-санитарная часть УМВД России по Орловской области», г. Орёл, Российская Федерация. SPIN 7492-3519, ORCID 0000-0002-1893-4671, Researcher ID N-1694-2017.
Сернов Л.Н. - д.м.н., профессор, НИУ «БелГУ», г. Белгород, Российская Федерация. SPIN 5241-1276, ORCID 0000-0001-4512-6871, Researcher ID H-6475-2014.
Степченко А.А. - д.м.н., доцент, Курский государственный медицинский университет, г. Курск, Российская Федерация. SPIN 5747-3948, ORCID 0000-0002-3647-9541, Researcher ID R-5487-2016.
© Tishin A.N., Pokrovskii M.V., Tishina O.M., Sernov L.N., Stepchenko A.A., 2017
APPLICATION OF ENTEROSORBENT ON THE BASIS OF MONTMORILLONITE IN ACUTE DIARRHEA (experimental study)
A.N. Tishin1, M.V. Pokrovskii2, O.M. Tishina3, L.N. Sernov2, A.A. Stepchenko 4
Orel Regional Clinical Hospital, Pobedy Boulevard, 10, 302028, Orel, Russian Federation (1) Belgorod National Research University, Pobeda str., 85, 308015, Belgorod, Russian Federation (2) Medical-sanitary unit of the Administration of Ministry of Internal Affairs of Russia of the Orel Region, Saltykov-Shchedrin str., 37, 302028, Orel, Russian Federation (3)
Kursk State Medical University, K. Marx str., 3, 305041, Kursk, Russian Federation (4)
Aim. To study the antidiarrheal activity of enterosorbent on the basis of montmorillonite on the model of serotonin-induced diarrhea. Materials and Methods. The study was conducted on laboratory mice of both sexes, acute diarrhea was induced by intraperitoneal injection of serotonin hydrochloride at the dose of 0.32 mg/kg, enterosorbent was introduced orally in the form of aqueous suspension in a wide range of doses 30 minutes before introduction of serotonin. Within 4 hours, the time of onset of diarrhea, the number of defecations, the fluid content in fecal masses were taken into account. Morphological examination of the small intestine was carried out. Results. introduction of serotonin led to diarrhea in 100% of animals within 12.8±1.2 minutes, the number of defecations increased 2.5 times as compared to the intact animals and was 19.5±0.5 times in 4 hours, the fecal masses were predominantly semi-liquid and liquid. Use of enterosorbent coded Crim_04 at the maximum dose led to a delay in diarrhea up to 73.6±4.1 minutes, the number of defecations decreased to 9.4±0.1 with a significant solidification of feces. The antidiarrheal effect of enterosorbent was confirmed morphologically. Conclusions. Enterosorbent on the basis of montmorillonite with laboratory code Crim_04 possesses a dose-dependent antidiarrheal effect in modeling of serotonin-induced diarrhea.
Keywords: enterosorbent, montmorillonite, diarrhea, antidiarrheal activity.
Diarrhea is one of commonest diseases of water-related or food-related origin. According to WHO data, diarrhea is one of the leading causes of death in the world. Despite reduction in mortality rate of diarrhea, in 2015 1.39 million people, mostly children, died from diarrheal diseases. Every year more than 1.7 billion of cases of diarrhea are reregistered in the world [1,2].
Adjuvant therapy of acute diarrheas that can also be used in children, is enterosorption [3,4]. Of special interest here are mineral raw materials, in particular, montmorillonite. Montmorillonite is a layered mineral of smectite group. Dioctahedral smectite having similar structure with montmorillonite is in increased demand among the population of Russia [5]. Minerals of smectite group possess antidiarrheal and cytomucoprotective effect and a high sorption activity towards bacterial toxins in peroral use [6-11].
At present there is no mineral enterosorbent on the basis of domestic raw materials on the Russian pharmaceutical market [12]. Development of medical drugs on the basis of domestic substances is an important task for healthcare and for pharmaceutical industry that complies with "Pharma-2020 Strategy" [13].
Aim of research to carry our preclinical study of antidiarrheal activity of entero-sorbent with laboratory code Crim_04 based of montmorillonite on the model of serotonin-induced diarrhea.
Materials and Methods
The work was carried out on the base of FSAEI "Belgorod State University" in the laboratory of preclinical studies. All stages of the work were conducted with observance of "European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes" [Directive 2010/63/EU].
Test object
Test object was an experimental sample of enterosorbent with laboratory code Crim_04 on the basis of montmorillonite from Crimean deposit provided by firm Crimfarmamed. The experimental sample Crim_04 is a powder ranging in color from yellowish- or grayish-white to grayish- or brownish-yellow with a smell of vanillin.
Mass fraction of montmorillonite makes 62.4%, silver - 0.15%. The size of the majority of particles in the suspension is 7.08 pm.
Drugs for comparison: enterosorbent Smecta (Beaufuor Ipsen Industrie, France) and loperamide (Janssen-Cilag, France).
Laboratory animals, experimental groups
The study was conducted on 140 laboratory mices of both genders with 25±2 g mass. The animals were obtained from the vivarium of FSAEI "Belgorod State University".
The diarrhea was induced by intra-peritoneal introduction of serotonin hydrochlo-ride (5-hydroxyrtyptamine - 5-HT) (H9523, Sigma-Aldrich, USA) at the dose of 0.32 mg/kg (n=20 animals) [14]. Serotonin hydrochloride was introduced in 30 minutes after intragastric introduction of enterosorbents and loperamide. In the group of intact animals 0.9% sodium chloride solution was introduced intraperito-neally at the dose of 10 ml/kg (n=20 animals).
Animals of experimental groups were intragastrically introduced aqueous suspension of Crim_04 enterosorbents at one-time doses of 880 mg/kg, 1660 mg/kg, 3320 mg/kg and Smecta at the dose of 1660 mg/kg, loperamide at the effective dose 10 pg/kg, the doses were recalculated on the basis of the average therapeutic daily doses for humans. Animals of the control group received equivalent quantities of 0.9% sodium chloride solution.
After modelling of the pathology mice were placed onto white sheets of paper (one on a sheet) to evaluate the time of onset of diarrhea and count the number of defecations within 4 hours. The paper was changed every hour. The evidence of inhibition (EI) of diarrhea was calculated using the formula:
EI (%)=[(Dc-De)/Dc]* 100%, where Dc - the quantity of semi-liquid and liquid defecations in control group, De - the quantity of semiliquid and liquid defecations in studied groups. The coefficient of evidence of diarrhea (CED) was calculated using point scale of evaluation of consistence of fecal masses: 1 point - normal feces, 2 - semiliquid feces, 3 points - liquid feces. The coefficient was calculated from the formula:
CED=(N*1+S*2+L*3)/AD, where N - quantity of defecations with normal feces, S - quantity of defecations with
semiliquid feces, L - quantity of defecations with liquid feces, AD - total quantity of defecations during the observation period. Stress-related defecations at the beginning of the experiment were ignored in counting the total quantity of defecations in the experiment.
After 4 hours of observation the animals were withdrawn from the experiment under ether narcosis.
Morphological examination
For histological examination portions of small intestinal tissue were taken from animals. The portions of tissue were fixed in 10% solution of neutral formalin with subsequent paraffin coating. From the obtained blocks cuts were prepared of 5-7 pm thickness and stained with hematoxylin-eosin. Microscopic examination was conducted using microscope Micromed-6 (LOMO, Saint-Petersburg), pictures were analyzed using Micro-Analysis Pro program (оОо LOMO-Microsystems, Saint-Petersburg).
Statistical analysis
Statistical processing of the data was conducted using program pack Microsoft Excel 2010 and STATISTIKA 6.0 for Windows. Average values of the studied parameters were presented in the form (M±m) where M is the arithmetic mean, and m is standard error of the mean. Differences in parameters between the groups were analyzed using Student criterion. The difference between compared parameters with p<0.05 was considered reliable.
Results and Discussion
It was found that intraperitoneal introduction of serotonin hydrochloride at the dose of 0.32mg/kg caused diarrhea in 100% of animals within 15 minutes with evident increase in the number of defecations with significant predomination of watery fecal masses as compared to the intact animals (Fig. 1).
As it is seen from Figure 1 A, application of enterosorbent coded Crim_04 significantly delayed the onset of diarrhea. Here, diarrhea began 5.5 times later than in the control group. The effect was most evident with application of enterosorbent at the dose of 3320 mg/kg.
Application of enterosorbent coded Crim_04 reduced the number of defecations in modeling of serotonin-induced diarrhea in mice. Here, it was ascertained that application
of enterosorbent Crim_04 at the dose of 3320 mg/kg inhibited development of diarrhea by 52.1% manifested by reduction in the amount of semi-liquid and liquid defecations compared to the control group. This result was reliably higher than in groups with introduction of enterosorbent at the doses 880 mg/kg and 1660 mg/kg (26.7% and 35.9%, respectively). For Smecta and loperamide this parameter was 34.8% и 73.8%, respectively (Fig. 1 B).
In intragastric introduction of entero-sorbent coded Crim_04 reduction in the content of fluid in fecal masses was observed, defecations were mostly with semi-fluid feces. This effect was most expressed in groups of animals that received the enterosorbent Crim_04 at the dose 3320 mg/kg (Fig. 1 C).
The parameters for enterosorbent coded Crim_04 in the average therapeutic dose 1660 mg/kg did not show a reliable difference from the effect of dioctahedral smectitis at the same dose. With this, enterosorbent coded Crim_04 and Smecta were significantly inferior to loperamide in terms of time of the onset of diarrhea, total quantity of defecations and content of fluid in fecal masses.
Morphologic examination
In animals of control group the intestinal mucosa was macroscopically swollen, edematous, of pink-gray color, with separate hyperemized areas. The surface of the mucosa was covered with slightly turbid semi-liquid mucus readily washed off with water.
Microscopically, the mucosa was edematous. Shortening and deformation of villi were determined. On the end of some villi scaling off of the epithelium was seen with exposure of the plate of mucosa proper. Evident hypertrophy of crypts was determined. Blood vessels of mucosa and of submucosal layer were hyperemic. Muscular and serous membranes of the intestine were without changes. In the gut lumen a high amount of mucus was present (Fig. 2 B). These changes were not characteristic of the intact animals (Fig. 2 A).
In groups of animals that received enterosorbent with laboratory code Crim_04 at the doses of 3320 mg/kg pathological alterations in the small intestine consisted in a mild edema of the mucous membrane. No
168.7*
5-НТ
А
>НТ+ ■■ иг ■ OihiJM Сшп 0*1 (saonie-i^j am nig
5-HT+ Simchi I liyfy • j u,; fcjj'l
Ьрегашйк 110 nArkg)
Mbtat"
B
1%У
J-JHT
5-НГ + i-HT ■+ SHT4-
CruiiJM Ciiio o.l Cnm_04
iSSO 11660
Bfcfttf тдЛф
^-HT + illliCTil (1660 Lt(JJ Y.^t
C
2.ЛТ
5-HT
-S-HT4 5-HT+ 4-HT-t-
ComM ШауМ Ciim_04 frnettn
iJfSO (3320 (1660
PP^-1 mgv^j u^/tg}
5-1 IT i lopcifluilil (.10
Fig. 1. Dose-dependent effect of enterosorbent with code Crim_04 on the time of onset of diarrhea (A, minutes), quantity of defecations (B, number), consistence of fecal masses (C, conventional units) in serotonin-induced diarrhea in mice.
Note:+ - with p<0.05 compared to the group of intact animals; * - with p<0.05 compared to the control group; a - p<0.05 compared to the group given Crim_04 in the dose 880 mg/kg; b - p<0.05 compared to the group given Crim_04 at the dose of 1660 mg/kg; # - p<0.05 compared to the group given loperamide
hyperemized areas were seen. Scaling off of the epithelium was minimal, no exposure of the proper plate of mucous membrane was observed. Blood vessels of mucosa and of submucosal layer were moderately filled with blood. Muscle layer and serous membrane were without pathological changes (Fig. 2 E).
In the control group with modeled serotonin-induced diarrhea 1.4 times decrease in
the height of villi, 1.4 times increase in the width of villi at the base and 1.2 time increase in the depth of crypts were determined as compared to the intact animals. Application of enterosorbent with code Crim_04 at the dose of 3220 mg/kg significantly improved the histological pattern of the small intestine bringing morphometric parameters up to the level of the intact animals (Fig. 3).
Fig. 2. Histological structure of small intestine in mice (microphoto x100): A - intact animals; B - control group; C - enterosorbent Crim_04 at the dose of 1660 mg/kg; D - enterosorbent Crim_04 at the dose of 3220 mg/kg; E - enterosorbent Smecta at the dose of 1660 mg/kg; F - loperamide 10 |ig/kg. Staining with hematoxylin and eosin
Serotonin is an important signaling molecule that controls secretion of the intestinal epithelium, motility of the walls of gastrointestinal tract [15,16]. The mechanism of laxative effect of serotonin is likely to consist in stimulation of 5-HT3-receptors. This causes increase in the motility of the gastro-intestinal tract, in intestinal secretion with the result of accumulation of increased amount of fluid in
the gut lumen and its accelerated evacuation in the natural way [14,17]. In modeling of serotonin-induced diarrhea early development of diarrhea in mice was noted (12.8±1.2 minutes), sharp increase in the number of defecations and in the content of fluid in fecal masses (19.5±0.5 and 2.47±0.02 respectively as compared to the group of intact animals -7.9±0.04 and 1.0±0.0 respectively).
Fig. 3. Effect of enterosorbent coded Crim_04 on the ratio of the length of villi to the width and the length of villi to depth of crypts in small intestine of mice in modelling serotonin-induced diarrhea (conv. units).
Note: * - with p<0.05 compared to the group of intact animals; ** - with p<0.05 compared to the control group; a - p<0.05 compared to the group given Crim_04 at the dose of 880 mg/kg
Antidiarrheal effect of enterosorbent coded Crim_04 depended on the dose. The enterosorbent coded Crim_04 produced the highest effect at the dose of 3320 mg/kg that was manifested in the model of experimental diarrhea by prolongation of the onset of diarrhea, reduction in the total number of defecations and reduction in the amount of fluid in feces. This effect is probably associated with sorption of fluid excessively secreted into the
gut lumen, with increase in the density of fecal masses, and as a result, with reduction in the speed of movement of fecal masses through the intestine [18].
Conclusions Enterosorbent on the basis of montmorillonite with laboratory code Crim_04 possesses dose-dependent antidiarrheal activity in modeling of serotonin-induced diarrhea.
Authors have no conflict of interest to declare.
Research was conducted in the first stage of the government contract
№ 14.N08.11.0109 of 19.09.2016.
References
1. Top 10 causes of death in the world. Geneva: WHO; 2017. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 310/ru. Accessed: 02.05.2017.
2. Diarrhea: Information Bulletin No. 330. Geneva: WHO; 2013. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 330/en. Accessed: 14.05.2017.
3. Carretero MI, Pozo M. Clay and non-clay minerals in the pharmaceutical and cosmetic industries part II. Active ingredients. Appl. Clay Sci. 2010;47:71-181.
4. Liashenko NV. Peculiarities of enterosorption via nasointestinal probe using sorbent diosmectite. Klin. Khir. 2014;12:16-8.
5. Bondarev AV, Zhilyakova ET. Analiz sprosa na adsorbcionnye kishechnye preparaty pri pomoshhi indeksa Vyshkovskogo. Farmaciya i farmakologiya, 2014;6(7):114-116. (In Russ).
6. Novokshonov A A, Sokolova NV. Klinicheskaja jeffektivnost' jetiopatoge-neticheskoj terapii jenterosorbentami ostryh kishechnyh infekcij u detej. Sonsilium Medicum. 2009;1:4-8. (In Russ).
7. Bui QC, Nguen HC, Vesentsev AI, et al. The antibacterial properties of modified bentonite deposit tam bo. Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2016:2(3):63-74.
8. Bukhanov VD, Vezentsev AI, Filippova OV, et al. The influence of the concentration of montmorillonite containing sorbent and pH of the culture medium on the antibiotic sensitivity of Escherichia coli, as well as the effect of ground on growth of Escherichia. Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2017;3(1):97-104.
9. Hu C, Song J, You Z. Zinc oxide-montmorillonite hybrid influences diarrhea, intestinal mucosal integrity, and digestive enzyme activity in weaned pigs. Biological trace element research. 2012;149:190-6. doi:10.25207/1608-6228-2017-24-3-106-113.
10. Khediri F, Mrad AI, Azzouz M. Efficacy of diosmectite (smecta) in the treatment of acute watery diarrhea in adults: a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel group study. Gastroenterol Res Pract. 2011;2011:721-36. doi: 10.1155/2011/783196.
11. Mujawar QM, Naganoor R, Ali MD. Efficacy of dioctahedral smectite in acute watery diarrhea in Indian children: a randomized clinical trial. J Trop Pediatr. 2012;58:63-7.
12. Zhilyakova ET, Samsonov AA, Golubev NN, et al. Obzor rossijskih jenterosorbcionnyh lekarstvennyh sredstv.
Remedium. 2014;10:40-7. (In Russ).
13. Farma-2020 - jekspertnaja plo-shhadka otkrytogo obsuzhdenija. Strategija razvitija farmacevticheskoj promyshlennosti Rossijskoj Federacii na period do 2020 g. [Electronic resource]. Available at: http://www.pharma2020.ru/download/1594.html ?pharma2020=0223e3 cc41 acc42e5. Accessed: 21.05.2017. (In Russ).
14. Kadowaki M, Nagakura Y, Tomoi M. Effect of FK1052, a potent 5-hydroxy-tryptamine 3- and 5-hydroxytryptamine 4 receptor dual antagonist, on colonic function in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 1993;266:74-80.
15. Parfenov AI. Chetyre varianta patogeneza i terapii diarei. Terapevticheskij arhiv. 2015;87(12):5-12. (In Russ). doi: 10.17116/terarkh201587125-12.
16. Shcherbakov P, Trubitsyna I, Kirova M. Serotonin and Acetylcholine associated damage to microcirculation in gastric mucosa and cytokine changes in rats. Gastroenterology. 2011;140:318-19.
17.Dong Y, Yang C, Wang Z. The injury of serotonin on intestinal epithelium cell renewal of weaned diarrhea mice. European Journal of Histochemistry. 2016; 60(2689):253-61.
18. Tishin AN, Krut UA, Tishina OM, et al. Physico-chemical properties of mont-morillonite clays and their application in clinical practice (review^. Research result: pharmacology and clinical pharmacology. 2017;3(2):119-128. doi: 10.18413/2313-89712017-3-2-119-128.
Tishin A.N. - therapist of Orel Regional Clinical Hospital, Orel, Russian Federation. SPIN 3250-6576, ORCID 0000-0002-8286-8967, Researcher ID U-1072-2017.
E-mail: [email protected]
Pokrovskii M.V. - MD, Grand PhD, Professor, Head of the Department of Pharmacology, NRU "BelSU", Belgorod, Russian Federation. SPIN 9201-3580, ORCID 0000-0004-4895-1674, Researcher ID A-1573-2014.
Tishina O.M. - therapist of Medical-sanitary unit of the Administration of Ministry of Internal Affairs of Russia of the Orel Region, Orel, Russian Federation. SPIN 7492-3519, ORCID 0000-0002-1893-4671, Researcher ID N-1694-2017.
Sernov L.N. - MD, Grand PhD, Professor, NRU "BelSU", Belgorod, Russian Federation. SPIN 5241-1276, ORCID 0000-0001-4512-6871, Researcher ID H-6475-2014.
Stepchenko A.A.- MD, Grand PhD, Associate Professor, Kursk State Medical University, Kursk, Russian Federation. SPIN 5747-3948, ORCID 0000-0002-3647-9541, Researcher ID R-5487-2016.
