CC BY
190
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11213 УДК 635.21:631.527: 632.938.1
Применение днк-маркеров для оценки исходного селекционного материала картофеля
Е. П. ШАнинА, доктор сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник (e-mail: [email protected])
л. Б. сергеева, кандидат сельскохозяйственных
наук, старший научный сотрудник
М. А. СтАФЕЕвА, кандидат сельскохозяйственных
наук, старший научный сотрудник
Е. М. клЮкинА, кандидат сельскохозяйственных
наук, ведущий научный сотрудник
Уральский федеральный аграрный научно-
исследовательский центр Уральского отделения
Российской академии наук, ул. Главная, 21, пос. Исток,
Екатеринбург, 620061, Российская Федерация
Резюме. В селекционно-технологическом центре по картофелю Уральского научно-исследовательского института сельскогохозяй-ства в 2018 г. проведён скрининг сортов и межвидовых гибридов картофеля с использованием семи ДНК-маркеров. На основе сведений из литературы и собственных экспериментов был проведён отбор ПЦР-маркеров для идентификации в генотипах картофеля генов вертикальной устойчивости к наиболее распространённым болезням и вредителям. Всего проанализировано 89 образцов, в том числе 27 сортов и 62 межвидовых гибрида. Установлена высокая встречаемость в коллекции генов отS. andigenum - маркер TG-689 гена H1 устойчивости к золотистой картофельной немато -де, которые выделены у 92% образцов. Наличие гена Gro 1-4 от дикого вида S. spegazzinii отмечено у 60 % проанализированных образцов. Маркер RxSP устойчивости к вирусу X от S. andigenum представлен у трети образцов - 32 %. Частота встречаемости в коллекции гена Rysto устойчивости к вирусу Y, происходящего от S. stoloniferum невысокая - 27 %, вместе с тем, встречаемость маркера гена Ry 186 от S. chacoense достаточна большая (81 %). С высокой частотой представлен в коллекции маркер Rpi-sto 1-890 устойчивости к фитофторозу от S. stoloniferum - 84 %, и крайне редок маркер гена Rpi-blb 1от S. bulbocastanum, выделен только у одного образца СМ503-55, у которого устойчивость к фитофторозу подтверждена фенотипическими исследованиями. Рекомендованы в качестве наиболее ценного селекционного материала образцы СМ 503-55, 14-45-4, Аляска, Getsbi, Горняк, Ирбитский, Memfis, Мишка, Nicse, Терра, Evalution, 12-47-10, 14-4-1, которые характеризовались высокой насыщенностью маркерами генов устойчивости к болезням и вредителям.
Ключевые слова: картофель, сорт, исходный материал, маркеры, R-гены, устойчивость.
Для цитирования: Применение ДНК-маркеров для оценки исходного селекционного материала картофеля / Е. П. Шанина, Л. Б. Сергеева, М. А. Стафеева и др. //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 12. С. 47-49. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11213.
Картофель - вегетативно размножаемая культура, поэтому неизбежно накопление вирусной инфекции. Это приводит к снижению продуктивности растений и вырождению сортов. Известно около 30 видов вирусов, поражающих растения культуры [1]. Наиболее широко распространены вирус скручивания листьев, Y-вирус и Х-вирус картофеля [2]. Поэтому одним из важных сортовых признаков при создании новых сортов стала устойчивость к вирусам.
Большой интерес для селекции картофеля на устойчивость к вирусу Х представляет крайняя устойчивость (иммунитет, ER - extreme resistance). Устойчивость такого типа контролируют доминантные аллели R-генов [2]. Крайняя устойчивость (ER) к вирусу Х интрогресси-рована в культурные сорта картофеля из диких видов Solanum acaule, Solanum vernei, Solanum sucrense и полукультурного вида Solanum tuberosum ssp. andi-
gena [3]. Локализация генов ER к Х-вирусу картофеля определена на V хромосоме, источник - дикий вид S. acaule (ген Rx2 или Rxacl) и на XII хромосоме, источник -S. tuberosum ssp. andigena (ген Rx1 или Rxand) [4, 5].
Золотистая картофельная нематода Globodera ros-tochiensis - объект внутреннего и внешнего карантина в Свердловской области. В зависимости от зараженности почвы, ее особенностей, погодных условий и свойств возделываемых сортов урожай картофеля снижается под ее воздействием на 20...95 % [6].
Все известные нематодоустойчивые сорта картофеля имеют межвидовое происхождение, так как геном S.tuberosum ssp. tuberosum L. не имеет генов резистентности к картофельным цистообразующим нематодам, относящимся к видам Globodera rostochiensis и Globodera pallida. Поиск источников устойчивости ведется с 50-х гг. прошлого века, на сегодняшний день созданы сорта, устойчивые к цистообразующим нематодам. В ходе их селекции использовали такие виды как S. andigenum, S. vernei. S. sparsipilum, S. spegazzinii. Еще два вида - S. gourlay, S. oplocense - вовлечены в создание перспективного селекционного материала [7].
На сегодняшний день широкое применение нашли два ДНК-маркера устойчивости к цистообразующим нематодам. Маркер Gpa 2-2 сцеплен с геном устойчивости к Globodera pallida (ген Gpa2) [8, 9]. Маркеры Gro 1 -4-1 и TG689 - с геном устойчивости к Globodera rostochiensis (ген Н1 и Gro 1-4 соответственно) [9]. Белорусские ученые при исследовании коллекции своих сортов обнаружили маркер Gro 1-4-1 у 7-и сортов из 70-и проанализированных [10]. По другим данным этот маркер присутствовал у 12 иностранных сортов из 78 проанализированных [11]. Таким образом, его встречаемость невелика, что свидетельствует о высокой ценности селекционного материала, несущего эти гены.
Среди всех болезней картофеля наиболее серьезной проблемой остается фитофтороз. Широкое распространение и высокая скорость эволюции возбудителя этого заболевания оомицета Phytoftora infestans Mont. De Bary. создают сложности в создании устойчивых сортов. Необходимо вовлечение в селекционный процесс нескольких доноров, несущих разные гены устойчивости к фитофто-розу. Создание таких сортов можно назвать упреждающей селекцией [12]. В селекционной работе в этом направлении чаще используют четыре диких вида картофеля - S. bulbocastanum, S. demissum, S. stoloniferum и S. venturii, у которых имеются R-гены устойчивости к фитофторозу [13]. Для скрининга взяты SCAR маркеры R-генов рассоспецифиче-ской устойчивости к фитофторозу, локализованные на 8-й хромосоме Rpi-blb 1-820 и Rpi-sto 1-890.
Цель исследований - анализ сортообразцов питомника исходного материала и межвидовых гибридов по практически применяемым маркерам генов хозяйственно-ценных признаков - устойчивость к золотистой картофельной нематоде, к вирусам X и Y, а также к фитофторозу картофеля.
Условия, материалы и методы. Экспериментальную работу проводили в селекционно-технологическом центре по картофелю Уральского НИИСХ - филиала ФГБНУ УрФА-НИЦ УрО РАН, г. Екатеринбург, в рамках научно-технической программы по заданию Поисковые научные исследования, выполняемые организациями-исполнителями в рамках
Таблица 1. Характеристика маркеров Я-генов устойчивости картофеля к патогенам, использованных в работе
Ген
Устойчивость
Маркер
Праймеры (5' - 3')
Источник
H 1
Gro 1-4 Rx 1
к нематоде G. Rostochiensis к нематоде G. Rostochiensis к PVX
TG 68914 Gro 1-4-RxSP
Rysto крайняя к PVY YES3-3A34.
Ry chc к PVY Ry186
Rpi- к фитофторо- Rpi-blb
blb 1 зу от S. bulbo- 1-820
castanum
Rpi- к фитофторо- Rpi-sto
sto 1 зу от S. stolo- 1-890
niferum
F-TAAAACTCTTGGTTATAGCCTAT R-CAATAGAATGTGTTGTTTCACCAA F - AAGCCACAACTCTACTGGAG R - GATATAGTACGTAATCATGCC F-ATCTTGGTTTGAATACATGG R -CACAATATTGGAAGGATTCA F - TAACTCAAGCGGAATAACCC R - AATTCACCTGTTTACATGCTTCT-TGTG
F -TGGTAGGGATATTTTCCTTAGA R-GCAAATCCTAGGTTATCAACTCA F - AACCTGTATGGCAGTGGCATG R -GTCAGAAAAGGGCACTCGTG
F -ACCAAGGCCACAAGATTCTC R -CCTGCGGTTCGGTTAATACA
Brodie et al, 1999 Asano, 2012 Asano, 2012 Song et al. 2005
Mori, 2011 Wang, 2008
Haesaert, 2015
КПНИ «Развитие селекции и семеноводства картофеля». Объектом исследования были сорта картофеля коллекционного питомника и межвидовые гибриды. По пяти из семи маркеров анализировали по 89 образцов, по маркеру гена Gro 1-4-1 - 33 образца; Rpi-sto 1 -890 - 37 образцов.
Для выделения растительной ДНК использовали набор реагентов компании «Синтол». Для определения наличия генов устойчивости картофеля методом полимеразной цепной реакции использованы маркеры TG 689141, Gro 1-4-1602, RxSP, YES3-3Ag41 Ry186, Rpi-blb 1-820, Rpi-sto 1 -890 (табл. 1 ).
При одинаковых условиях амплификации реакцию для каждого маркера осуществляли отдельно. После чего выполняли электрофорез в 1,5 %-ном агарозном геле.
результаты и обсуждение. Почти все исследованные образцы имели в своем генотипе ген устойчивости к Glo-bodera rostochiensis - Н1, присутствие которого определяли с использованием маркера TG 689141. Его встречаемость составила 92 %. Исключением стали образцы СМ 503-55, 13-36-3, Оригинал, Sarpo mira (табл. 2).
Из 33 проанализированных образцов наличие гена Gro 1-4, сцепленного с маркером Gro 1-4-1602с ожидае-
Таблица 2. результаты молекулярного скрининга наиболее ценных в качестве источников сортов и гибридов картофеля
Маркер (ген)*
Сортообразец TG 689141 (H 1)1 Gro 1-4- (Gro 1-4) RxSP YES3- (Ry™) Ry186 Rpi-blb 1-820 Rpi-sto 1-890 (Rpi-sto 1)
(Rx 1) (Ry<J (Rpi-blb 1)
Sarpo mira 0 0 + 0 - 0 +
Аляска + 0 0 + + 0 +
Getsbi + + + 0 - 0 +
Горняк + + 0 + + 0 0
Гусар + 0 0 0 - 0 +
Evrostarch + 0 0 + - 0 +
Ирбитский + + 0 0 + 0 +
Memfis + + + 0 - 0 +
Мишка + 0 0 + + 0 +
Nicse + 0 + + - 0 +
Оригинал 0 0 0 0 - 0 0
Першацвет + 0 0 0 - 0 +
Табор + 0 0 0 - 0 +
Терра + + 0 + + 0 0
Evalution + + + 0 - 0 +
Югра + 0 0 0 - 0 +
03-15-66 + + 0 0 - 0 +
12-47-10 + + 0 + 0 0 +
СМ 503-55 0 + 0 + + + +
Частота встреча- 92,0 60,0 32,0 27,0 81,0 1,5 84,0
емости (для всей
выборки), %
* «+» - маркер выявлен, «0» - маркер не выявлен, «-» - анализ не достоверен.
мым размером фрагмента 602 п.н., отмечено у 20 образцов. То есть его встречаемость составила около 60 % (рис. 1). Это обуславлено вовлечением в селекционный процесс хорошо подобранного исходного материала.
Устойчивость остальных сортообразцов к золотистой картофельной нематоде по гену Н1 подтверждена, при том, что присутствие этого гена диагностировали у слабовосприимчивого к ней сорта Горняк.
Встречаемость ДНК-маркера RxSP,сцепленного с геном устойчивости Rx1 к Х-вирусу, была невысокой. Он присутствовал у 32 % образцов картофеля. Аллель размером 1230 п.н., специфический для детекции гена Rx1, идентифицирован после амплификации у образцов 13-36-3, 14-49-31, а также 14-4-1, 14-45-4, Arshena, Sarpo mira, Getsbi, Memfis, Nicse, Rozi, Evalution и Б 92ху00-2.
Существует необходимость в создании сортов с комплексной устойчивостью к вирусу Y, этому способствует вовлечение в селекционный процесс таких видов как S. stoloniferum и S. chacoense [14].
В наших исследованиях отмечена высокая доля встречаемости маркера Ry186, сцепленного с геном Rychc - 81 %. Наличие гена устойчивости Rys^o к Y-вирусу определено у образцов СМ 503-55, Nicse, Аляска, Мишка, Evrostarch, Терра, 12-47-10, 12-47-21 и 14-45-4, встречаемость его маркера в целом по коллекции составила около 27 %.
Почти 84 % из 37 проанализированных образцов несли ген устойчивости к фитофторозу, полученный от вида S. stoloniferum. Встречаемость гена Rpi-blb 1 от вида S. bulbocastanum была крайне мала. Среди всех изученных генотипов диагностирован только один с
маркером Rpi-blb 1-820 -СМ-503-55 (рис. 2). По результатам полевых исследований 2014-2018 гг. устойчивость по ботве у этого образца составляла 8...9 баллов, даже при эпифитотии фитофтороза в 2017 г.
В результате проведенной работы по ДНК-маркированию выделены наиболее перспективные образцы картофеля, в генотипе которых присутствует комплекс R-генов: с 5-ю генами устойчивости - СМ 503-55, 14-45-4; с 4-я генами - Аляска, Getsbi, Горняк, Ирбитский, Memfis, Мишка, Nicse, Терра, Evalution, 1247-10, 14-4-1; с 3-я генами устойчивости -Evrostarch, Arshena, Rozi, 03-15-66, 12-4721, 13-41-13, 14-49-31.
Ни одного изучаемого гена устойчивости не обнаружено в генотипе у сорта
рис. 1. Результаты амплификации маркера Gro 1 -4-1602 на наличие гена устойчивости Gro 1-4 к золотистой цистообра-зующей нематоде у картофеля.
Оригинал, выделяющегося высоким содержанием крахмала в клубнях - 23.. .24 %.
Все ценные образцы будут в дальнейшем использованы в процессе гибридизации как источники устойчивые к ряду болезней картофеля.
выводы. Из коллекционного и конкурсного питомника выделены генотипы картофеля с комплексом генов
рис. 2. Результаты амплификации маркера Rpi-blb 1-820 на наличие гена устойчивости Rpi-blb 1 к фитофторозу картофеля.
устойчивости к патогенам, в том числе два с 5-ю генами устойчивости, одиннадцать с 4-я генами и семь - с 3-я генами устойчивости. В качестве наиболее ценного исходного материала рекомендованы образцы СМ 50355, 14-45-4, Аляска, Getsbi, Горняк, Ирбитский, Memfis, Мишка, Nicse, Терра, Evalution, 12-47-10, 14-4-1.
Литература.
1. Павлючук Н. В., Казючиц И. М., Волуевич Е. А. Отбор устойчивых кХ-вирусу генотипов картофеля с использованием ПЦР-маркеров// Картофелеводство: сборник научных трудов. 2011. Т. 19. С. 245-253.
2. Valkonen J. P. T. Natural genes mechanisms for resistance to viruses in cultivated and wild potato species // Plant Breed. 1994. Vol. 12. Рр. 1-16.
3. Росс Х. Селекция картофеля. Проблеммы и перспективы /пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. 183 с.
4. Gebhardt C., Valkonen J. P. T. Organization ofgenes controlling disease resistance in the potato genome//Annu. Rev. Phytopatol. 2001. Vol. 39. Pр. 79-102.
5. Solomon-Blackburn R. M., Barker H. A review of host major-gene resistansce to potato viruses X, Y, A and V in potato; genes, genetics and mapped locations //Herediry. 2001. Vol. 86. Pр. 8-16.
6. Букасов С. М., Камераз А. Я. Селекция и семеноводство картофеля. Л.: Колос, 1972. 359 с.
7. Оценка исходного материала картофеля на наличие маркеров TG689, CP113 и GRO 1-4 устойчивости к золотистой картофельной нематоде Globodera rostochiensis woll/ О. В. Маханько, Г. А. Яковлева, Н. И. Дробот и др. // Картофелеводство: сборник научных трудов. 2012. Т. 20. С. 70-84.
8. Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato/K. Mori, Y. Sakamoto, N. Mukojima, etc. //Euphytica. 2011. Vol. 180. Pp. 347-355.
9. DNA marker-assisted evaluation of potato genotypes for potential resistance to potato cyst nematode pathotypes not yet invading into Japan / K. Asano, A. Kobayashi, S. Tsuda, etc.// Breeding Science. 2012. Vol. 62. Pp. 142-150.
10. Оценка устойчивости картофеля к золотистой картофельной нематоде Globodera rostochiensis: методические рекомендации / Н. В. Павлючук и др. Минск: ИООО «Право и экономика». 2011. 43 с.
11. Ермишин А. П. Особенности использования ДНК-маркеров в селекции картофеля // Картофелеводство: сборник научных трудов. 2013. Т. 21. С. 169-183.
12. Упреждающая селекция: использование молекулярных маркеров при создании доноров устойчивости картофеля (Solanum tuberosum L.) к фитофторозу на основе сложных межвидовых гибридов/ О. А. Фадина, М. П. Бекетова, Е. А. Соколова и др.// Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 1. С. 84-94.
13. Молекулярный скрининг сортов и гибридов картофеля северо-западной зоны Российской Федерации / Т. А. Гавриленко, Н. С. Клименко, О. Ю. Антонова идр. //Вавиловскийжурнал генетики и селекции. 2018. Т. 22(1). С. 35-45. DOI 10.18699/VJ18.329.
14. Биотехнология в селекции растений. Геномика и генетическая инженерия//Генетические основы селекции растений. В 4 т. / науч. ред. А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева. Минск: Беларуская навука, 2014. Т. 4. 653 с.
use of DNA Markers to Examine the Source Breeding Material of Potato
E. P. Shanina, L. B. Sergeeva, M. A. Stafeeva, E. M. Klyukina
Ural Federal Agrarian Scientific Center, Ural branch, RAS, ul. Glavnaya, 21, pos. Istok, Ekaterinburg, 620061, Russian Federation Abstract. In 2018, in the selection and technology center for potato breeding, Ural Research Institute of Agriculture, varieties and interspecific hybrids of potato were screened using seven DNA markers. Based on published data and our own experiments, we selected PCR markers to identify genes of vertical resistance in potato genotypes against the most common diseases and pests. Eighty-nine samples were analyzed, including 27 varieties and 62 interspecific hybrids. In the collection it was found a high occurrence of genes from S. andigenum - TG-689 marker of H1 gene of resistance to a golden potato nematode, which was isolated from 92% of the samples. The presence of Gro 1-4 gene from the wild species S. spegazzinii was noted in 60% of the samples analyzed. Marker RxSP of resistance to X-virus from S. andigenum was identified in 32% of the samples. Rpi-sto 1-890 marker of late blight resistance from S. stoloniferum was represented in the collection with a high frequency - 84%, and a marker of Rpi-blb 1 gene from S. bulbocastanum was extremely rare; it was isolated from only one sample of SM 503-55, in which late blight resistance was confirmed by phenotypic studies. Samples SM 503-55, 14-45-4, Alaska, Getsbi, Gornyak, Irbitsky, Memfis, Mishka, Nicse, Terra, Evalution, 12-47-10, 14-4-1, which were characterized by high saturation with markers of disease and pest resistance genes, are recommended as the most valuable breeding material. Keywords: potato; variety; source material; markers; R-genes; resistance.
Author Details: E. P. Shanina, D. Sc. (Agr.), chief research fellow (e-mail: [email protected]); L. B. Sergeeva, Cand. Sc. (Agr.), senior research fellow; M. A. Stafeeva, Cand. Sc. (Agr.), senior research fellow; E. M. Klyukina, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow. For citation: Shanina E. P., Sergeeva L. B., Stafeeva M. A., Klyukina E. M. Use of DNA Markers to Examine the Source Breeding Material of Potato. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 12. Pp. 47-49 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11213.
