CC BY
46УДК 617.58-08+616-092.4+616.003
ПРИМЕНЕНИЕ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ УСКОРЕНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРОНИЧЕСКИХ РАНЕВЫХ ДЕФЕКТОВ КОЖИ
© 2019 Ю.Г. Барановский, Ф.Н. Ильченко, Е.Ю. Шаповалова
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского»,
Симферополь
Исследована эффективность применения дермальных фибробластов с целью улучшения процесса регенерации трофических язв (ТЯ). В исследовании участвовало 41 пациент хирургического отделения ГБУЗ РК «Симферопольской ЦРКБ», имеющих трофические язвы нижних конечностей различных размеров и форм от 4 до 26 см2. Пациенты 1-й группы дополнительно к комплексному лечению трофических язв получали местное лечение стимуляторами регенеративного процесса - дермальными фибробластами. По стандартным подходам лечение получали 21 пациент с ТЯ (2-я группа). Использование дермального эквивалента в комплексе лечения ТЯ явилось клинически эффективным. Примененный метод в 1-й группе способствовал ускорению процессов репарации, уменьшению сроков заживления трофических язв, статистически значимому уменьшению площади раневого дефекта по сравнению с больными 2-й группы.
Ключевые слова: трофическая язва, дермальные фибробласты, дермальный эквивалент.
Работа является фрагментом НИР «Применение миниинвазивных хирургических и кле-точно-регенеративных технологий в лечении осложнений сосудистой патологии нижних конечностей», регистрационный номер АААА-А16-116051910015-4.
Введение. Хирургическое лечение хронических раневых дефектов нижних конечностей остается одной из актуальных проблем современной хирургии, решение которой заключается в закрытии дефектов кожи и в ряде случаев сохранение опорной функции нижней конечности. Развитие хронической венозной недостаточности (ХВН), а также посттромбофлеби-тической болезни нижних конечностей могут приводить к образованию обширных раневых дефектов, требующих в дальнейшем пластического закрытия [6].
Патофизиология ран, которые долго не заживают, сложна и разнообразна, но все они имеют одно общее свойство - длительное течение воспаления, которое приводит к значительному поражению тканей и препятствует регенерации. Раневой процесс приобретает хронический характер при определенных условиях. К этим условиям можно отнести инфицированные трофические язвы нижних конечностей на фоне ХВН, венозные трофические язвы голени, посттромбофлебитический синдром. Для данных патологических состояний характерно одномоментное наличие признаков всех 3-х фаз раневого процесса. Дно такой язвы одновременно покрыто фибрином и грануляциями, возможно наличие участков некроза и гнойного содержимого. Грануляции, как правило, дряблые и бледные, края трофической язвы набухшие и плотные, иногда имеет место краевая эпителизация. Характерным для длительно незаживающих ран является повышенная активность тканевых ферментов, которые разрушают экстрацеллюлярный матрикс, высокая иммунизация тканей, нарушение васкуля-ризации и снижение способность тканей к регенерации через активацию тканевых провоспа-лительных цитокинов. За счет данных факторов пластическое закрытие хронических ран, как правило, приводит к лизису трансплантатов [2].
Несмотря на наличие значительного количества методик в лечении хронических ран, результаты остаются неутешительными. Продолжается поиск новых лекарственных препаратов и комплексных повязок как природных, так и биосинтезированних. В последнее время для лечения длительно незаживающих ран наряду с биотехнологическими разработками (коллагенопластика, ксенокожа, биополимерные покрытия), стали применять методы клеточной терапии [3].
На сегодня одним из прогрессивных методов лечения является трансплантация аллоген-ных дермальных фибробластов, культивированных in vitro. Их низкая иммуногенность и стабильность генома делает их перспективными для применения в регенераторной медицине. Клетки транспортируют к ране путем инъекций или на биодеградируемых матрицах на основе коллагена, фибрина или гиалуроновой кислоты. В экспериментальных исследованиях доказано, что при трансплантации дермальных фибробластов на длительно незаживающую раневую поверхность кожных покровов ускоряются процессы васкуляризации и эпителизации, что приводит к ее быстрому и качественному заживлению [4, 7]. Такие эффекты достигаются путем стимуляции роста сосудов благодаря секреции фактора роста эпителия (VEGF) [4] Вместе с тем дермальные фибробласты обладают противовоспалительной активностью [9].
Поэтому целью работы было исследование механизмов и оценка эффективности применения дермального эквивалента (ДЭ), состоящего из коллагена I типа и культивируемых ал-логенных дермальных фибробластов на течение раневого процесса у пациентов с варикозными язвами нижних конечностей.
Объект и методы исследования. Обследовано 41 пациента с хроническими раневыми дефектами, которые находились на стационарном лечении в отделении хирургии ГБУЗ РК «Симферопольской ЦРКБ» (клиническая база кафедры хирургии № 2 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского) в период 2015-2018 годы. Среди них было 22 (53,7 %) мужчин и 19 (46,3 %) женщин в возрасте от 43 до 72 лет. Средний возраст пациентов составил 55,4 ± 4,2 года. Средняя продолжительность раневых дефектов составляла 1,4 ± 0,5 года.
Всем пациентам проводили комплексную дезагрегантную, сосудистую и антибиотикоте-рапию, а также адекватную медикаментозную терапию, направленную на поддержание функционального состояния основных органов и систем жизнеобеспечения организма, медикаментозную коррекцию хронической венозной недостаточности нижних конечностей.
Обследование пациентов предусматривало определение общих клинических и биохимических лабораторных показателей. С диагностической целью больным проводилось определение кровообращения с помощью ультразвукового доплеровского исследования. Состояние костной системы оценивали рентгенологически. При выборе хирургической тактики учитывалась клиническая форма, уточнялся этиологический фактор, характер и глубина поражения тканей, варианты топической локализации кожного дефекта, а также количественный и качественный характер микрофлоры. В результате проведенного лечения происходило завершение гнойно-некротической фазы с переходом в фазу грануляций.
Площадь изначального дефекта кожи измеряли с применением программы «Lesion-Meter.apk» в день госпитализации в стационар в период лечения для определения скорости эпителизации трофической язвы на 4, 8, 12, 16, 20 и 24-е сутки, а также на этапе завершения лечения. Средняя площадь раневого дефекта составляла 20,1 ± 2,6 см2 (минимальная 6 см2 и максимальная 26 см2), что не требовало проведения аутодермопластики.
Пациенты были разделены на 2 группы: группу сравнения - 21 больных и основную - 20 пациентов. По нозологии, возрастным и половым признакам, сопутствующей патологии
группы были репрезентативны. Местная терапия в I фазу раневого процесса у больных обеих групп проводилась по общим правилам и не отличалась, по существу.
Во II фазу раневого процесса у пациентов группы сравнения применяли мази: левоме-коль, офломелид, левосин.
В основной группе пациентов применяли ДЭ, состоящий из коллагена I типа и культивированных аллогенных дермальных фибробластов.
Культивирование и иммунофенотипирование аллоогенных дермальных фибробластов
Дермальные фибробласты были выделены ферментативным путем в условиях стерильного бокса с ламинарным потоком воздуха из кожи молодых доноров, полученной при пластических операциях. Кусочки кожи после ферментативного удаления эпидермиса помещали в среду альфаMEM (Lonza) и измельчали сосудистыми ножницами до размера 1-2 мм. Затем к кусочкам ткани добавляли равные объемы растворов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Sigma) и диспазы (30 ед/мл) (Gibco). Полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при 37 °С и постоянном перемешивании. После фильтрации суспензии через фильтр-сеточку диаметром 0,40 мкм и центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 об/мин, фибробласты ресуспенди-ровали и культивировали в среде альфаMEM (Lonza) с добавлением 10 % сыворотки пациента и 50 ед./мл пенициллина - стрептомицина (ПанЭко) в чашках Петри в инкубаторе при 37 °С и концентрации СО2 - 5 % до достижения 100 % конфлюента. Для пересева клеток использовали 0,25 % трипсин - 0,02 % ЭДТА.
Определение фенотипа популяций дермальных фибробластов проводили с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, имеющих флуоресцентные метки. На дно чашек Петри помещали покровные стекла, на которые прикреплялись дермальные фибробласты. Стекла извлекали по достижении конфлюэнта первого пассажа. Клетки фиксировали ледяным ацетоном (-20 °С). Для иммунофенотипирования дермальных фибробластов применяли панель первичных моноклональных антител к поверхностным антигенам: CD 34 [Clone EP373Y] (Abcam), CD 45 (Abcam), CD44 [Clone EPR1013Y] (Abcam), CD73 [Clone 7G2] (Abcam), CD90 (Thy-1) [Clone 5E10] (BD Biosciences), CD31 [Clone 1D12] (Cell Marque), CD 105 (Endoglin) [Clone EPR10145] (Abcam). Вторичные антитела были конъюгированы с флюоресцентными метками Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Препараты изучали с помощью флюоресцентного микроскопа Olympus BX-43.
Для введения в свежую операционную рану пациентам основной группы использовали ал-логенные дермальные фибробласты с фенотипом CD44+/CD90+/CD105/+CD73+/CD 45±/CD31-/CD34-/CD45-. Все исследуемые культуры не экспрессировали гемопоэтические маркеры, но экспрессировали маркеры CD73, CD90, CD105, рекомендованные Международным обществом клеточной терапии для идентификации мезенхимных стромальных клеток [5].
С помощью полимеразной цепной реакции определяли присутствие в дермальных фиб-робластах бактериальной, вирусной и грибковой контаминации, в том числе микоплазменной.
В рану трансплантировали ДЭ с аллофибробластами, приготовленный на основе коллагена первого типа из крысиных хвостов из расчета 1 млн клеток на 1 мл раствора коллагена. Стерильный 0,34М раствор NaOH объединяли с концентрированной (х10) питательной средой 199 в соотношении 1:1. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена, после чего добавляли суспензию фибробластов в питательной среде DMEM F12, содержащей 10 % аутоплазмы больного. Полученную смесь инкубировали при 37 °С в инкубаторе до полной полимеризации геля [8].
ДЭ укладывали в подготовленную к трансплантации рану, укрывали его раневой повязкой ВоскоПран с мазью Левомеколь (Россия) для удобства манипулирования, затем укрывали асептической марлевой повязкой и фиксировали самоклеящейся нетканной пластырь-повязкой SilcoFix (Россия). Перевязки проводили через трое суток в зависимости от количества экссудата, производимого раной.
Критериями оценки эффективности лечения были: визуальная оценка регенеративных процессов в области кожного дефекта, уменьшение площади трофической язвы и динамика уменьшения болевого синдрома.
Результаты и их обсуждение. Визуальную оценку регенеративных процессов в области ТЯ (наличие грануляций, эпителизация, количество раневого содержимого, состояние окружающих тканей) проводили с помощью системы подсчета баллов в начале, при перевязках (каждые 3 суток) и в конце лечения (табл. 1).
Согласно балльной системе оценки состояния ТЯ, минимальная сумма баллов может составлять 2 балла, а максимальная - 10. Увеличение количества баллов свидетельствует о формировании благоприятных условиях и заживлении ТЯ.
У всех пациентов в начале исследования отмечались вялые грануляции, отсутствие эпи-телизации, интенсивная или умеренная экссудация, наличие мацерации окружающих тканей.
Таблица 1
Балльная оценка состояния трофической язвы
Показатели Баллы
Грануляции 1 - нет 2 - вялые 3 - хорошие
Эпителизация 0 - отсутствует 1 - слабая 2 - выраженная
Выделения из раны (экссудация) 1 - интенсивные 2 - умеренные 3 - отсутствуют
Дерматит 0 - присутствует 2 - отсутствует
На третьи сутки у пациентов основной группы было отмечено увеличение количества баллов за счет уменьшения экссудации, отсутствие явлений дерматита. Вместе с тем уже на третьи сутки пациенты перестали жаловаться на боли, зуд и гиперемию в области трофической язвы. На пятые сутки исследования у пациентов основной группы количество баллов значительно наросла за счет уменьшения экссудации, появления грануляций. Окружающие ткани были без отека и явлений дерматита. Имела место краевая эпителизация ТЯ.
Начиная с восьмых суток, количество баллов значительно превышало количество баллов в группе сравнения. Визуально ТЯ у пациентов основной группы отмечались более обильными грануляциями, удовлетворительной краевой эпителизацией, умеренной экссудацией и отсутствием реакции со стороны окружающих кожных покровов (табл. 2). У пациентов группы сравнения на восьмые сутки лечения имели место жалобы на тяжесть в области ТЯ, боли. Грануляции были мелкозернистыми и бледными. Краевая эпителизация была синюшной. Явления мацерации не фиксировались, зато имел место зуд окружающих тканей.
Таблица 2
Визуальная оценка регенеративных процессов в динамике
Группы наблюдения Количество баллов
1 сутки 3 сутки 5 сутки 8 сутки
Основная группа п = 20 5,4 ± 0,02 7,3 ± 0,04 8,1 ± 0,03 9,5 ± 0,01
Группа сравнения п = 21 5,3 ± 0,02 5,4 ± 0,01 5,9 ± 0,02 6,3 ± 0,01
Важным показателем эффективности лечения является интенсивность болевого синдрома, степень которого оценивали с помощью визуальной аналоговой шкалы.
В начале исследования, в первые сутки лечения, 100 % пациентов обеих групп оценивали болевые ощущения как умеренные. Данная характеристика боли объясняется недавно проведенным дебридментом ТЯ. На третьи сутки у всех пациентов основной группы отмечали уменьшение болевого синдрома до слабого у 11 пациентов, и полного исчезновения боли у 9 больных. У пациентов контрольной группы все пациенты (21 больной) не отмечали каких-либо изменений в болевых ощущениях. На 5 сутки у всех пациентов основной группы полностью отсутствовал болевой синдром. В то же время у пациентов группы сравнения на 5 сутки исследования 12 пациентов отмечали уменьшение болевого синдрома до слабого. На восьмые сутки 8 пациентов в группе сравнения отмечали слабый болевой синдром только во время проведения перевязок (табл. 3).
Таблица 3
Визуальная аналоговая шкала боли
Основная группа п = 20 Контрольная группа п = 21
1 сутки 3 сутки 5 сутки 8 сутки 1 сутки 3 сутки 5 сутки 8 сутки
Боли нет 9 20 20 13
Боль слабая 11 12 8
Боль умеренная 20 21 21 9
Боль сильная
Аппликации аллогенных фибробластов в составе объемной конструкции - дермального эквивалента из коллагена I типа - на раневую поверхность после очищения ТЯ позволяет доставить данные клетки непосредственно к грануляционной ткани, что существенно снижает нежелательные потери лечебного эффекта, связанных с возможным быстрым распадом и гибелью фибробластов. Это существенно улучшает результаты лечения хронических ран: инициирует репаративные процессы в грануляционной ткани, стимулирует ангиогенез, уменьшает явления воспаления в ране, значительно ускоряет эпителизацию (табл. 4). Вместе с тем данные клетки можно наносить на раневую поверхность в любой нужный момент, в зависимости от процессов, происходящих в ране. Полное приживление трансплантатов достигается за счет улучшения васкуляризации и трофики грануляционной ткани, стимуляции остаточных эпителиальных участков кожи, уменьшения признаков воспаления, иммунорегулирую-щей и антифибротической активности клеток [9].
Применение ДЭ происходило без осложнений. Повязку ВоскоПран удаляли на третьи сутки лечения. В дальнейшем применяли повязки с растворами антисептиков. Марлевые салфетки не «врастали», но и не присыхали к ране, а при проведении перевязок поверхностные салфетки легко удалялись. В фазе регенерации пациенты получали повязки с водным раствором повидон-йода. Полная эпителизация ТЯ в основной группе в среднем укладыва-
лась в 30-дневный период наблюдений, в группе сравнения данный период был более чем в два раза длиннее, либо не наступал вовсе, что обуславливало необходимость повторных госпитализаций.
Таблица 4
Динамика эпителизации трофических язв у пациентов 1-й и 2-й группы (х ± т)
Этапы наблюдения Группы
1-я 2-я
Госпитализация 19,4 ± 4,2 см2 20,5 ± 4,7 см2
4-е сутки 18,7 ± 4,1 см2 19,8 ± 4,6 см2
8-е сутки 15,6 ± 4,4 см2 18,9 ± 4,2 см2
12-е сутки 13,2 ± 3,8 см2 17,5 ± 4,3 см2
16-е сутки 10,8 ± 2,4 см2 16,7 ± 4,2 см2
20-е сутки 7,5 ± 2,2 см2 15,9 ± 3,9 см2
24-е сутки 4,2 ± 1,5 см2 15,1 ± 3,9 см2
Выводы:
1. Применение ДЭ, состоящего из коллагена I типа и культивируемых аллогенных дермальных фибробластов у пациентов с хроническими раневыми дефектами, позволило ускорить развитие регенеративных процессов в ранах вплоть до полного закрытия ТЯ.
2. При использовании данного ДЭ пациентами отмечено уменьшение болевого синдрома до слабого в течение первых трех суток лечения.
3. Применение ДЭ достоверно ускоряет эпителизацию ТЯ нижних конечностей и может служить реальной альтернативой оперативному лечению - аутодермопластике.
Перспективы дальнейших исследований. Применение клеточных технологий в лечении хронических раневых дефектов является перспективным направлением в лечении данной патологии. Учитывая тот факт, что количество ТЯ, которые долго не заживают, не уменьшаются, дальнейшие методы лечения будут направлены на стимуляцию регенераторных процессов в ранах. В этом плане ведущую роль будут играть клеточные технологии, которые по мере развития научного прогресса будут совершенствоваться и становиться более доступными.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Андреев Д.Ю., Абрамова Н.В., Блинова М.И. Эффективность кожной пластики и дермального эквивалента в лечении обширных язв голени смешанного генеза // Вестник хирургии. - 2013. - Т. 172, № 1. - С. 104-107.
2 Блинова М.И., Юдинцева Н.М., Александрова О.И., Баллюзек М.Ф. и др. Клинический опыт заживления трофических язв с использованием клеточного продукта «Эквивалент дермальный ДЭ» // Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. - 2015. - Т. 10. № 2. - С. 690-694.
3 Винник Ю.С., Салмана А.Б., Дробушевская А.И., Теплякова О.В. и др. Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении длительно не заживающих ран // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2001. - Т. 4, № 2. - С. 392-397.
4 Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С. и др. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи // Клет. трансплантол. и тканевая инженерия. - 2009. - Т. 4, № 4. - С. 26-40.
5 Лупатов А.Ю., Вдовин А.С., Вахрушев И.В. и др. Сравнительный анализ экспрессии поверхностных маркеров на фибробластах и фибробластоподобных клетках, выделенных из различных тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - № 4. - С. 221-228.
6 Мельцова А.Ж. Гриценко В.В., Орловский П.И. и др. Применение дермальных фибробластов в комплексном лечении больных трофическими язвами венозной этиологии // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2007. -Т. 166. № 1. - С. 72-77.
7 Шаповалова Е.Ю., Бойко Т.А., Барановский Ю.Г., Лугин И.А. Морфологическая характеристика заживления ишемизированной экспериментальной раны после применения ауто- и гетерофибробластов и дермального эквивалента // Казанский медицинский журнал. - 2018. - Т. 99. № 1. - С. 53-59.
8 Юдинцева Н.М., Самусенко И.А., Блинова М.И., Пинаев Г.П. Дермальный эквивалент на основе фибрина и восстановление соединительной ткани в результате его трансплантации на раны экспериментальных животных // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения / под редакцией В.А. Ткачука. - М.: Литтерра, 2009. - С. 209-221.
9 Esfahani M, Movahedian A, Baranchi M. Adiponectin: An adipokine with protective features against metabolic syndrome // Iran. J. Basic Med. Sci. - 2015. - № 18. - С. 430-442.
Рукопись получена: 23 сентября 2019 г. Принята к публикации: 4 октября 2019 г.
УДК 616-001-089.16
РОЛЬ И МЕСТО ТАКТИКИ DAMAGE CONTROL ПРИ РАНЕНИЯХ ЖИВОТА
С ПОВРЕЖДЕНИЕМ СЕЛЕЗЕНКИ
© 2019 В.В. Масляков, В.Г. Барсуков, С.Е. Урядов, В.Р. Горбелик, А.Ю. Чуманов, С.А. Куликов
Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Саратовский медицинский университет «Реавиз», Саратов
Цель исследования: определить роль и место тактики damage control при ранениях живота с повреждением селезенки.
Материалы и методы. Настоящее исследование основано на анализе лечения 224 раненых, из общего числа раненых 99 (44,1 %) поступили с пулевыми ранениями, 27 (12 %) - с осколочными и 98 (43,7 %) - с колото-резаными ранами.
Результаты. Анализ, проведенный в группе раненых, которым была применена тактика damage control и традиционная хирургическая тактика, показал, что в группе, где применялась данная тактика, было отмечено статистически достоверное снижение летальных исходов. Так, в группе с применением damage control летальность составила 16 (7,1 %), а в группе с обычной хирургической тактикой - 30 (13,3 %). При этом в группе с огнестрельными ранениями селезенки летальность при применении тактики damage control составила 12 (5,3 %), то в группе с традиционной хирургической тактикой - 29 (13 %). В группе раненых с колото-резаными ранениями соответственно 1 (0,4 %) и 4 (1,7 %). Кроме того, отмечалось снижение осложнений, в группе с применением damage control осложнения составили 12 (5,3 %), а в группе с обычной хирургической тактикой - 25 (11,2 %). При этом в группе с огнестрельными ранениями селезенки осложнения при применении тактики damage control развились в 8 (3,6 %), то в группе с традиционной хирургической тактикой - 15 (6,7 %). В группе раненых с колото-резаными ранениями соответственно 4 (1,8 %) и 10 (4,5 %).
Ключевые слова: ранения селезенки, ближайший послеоперационный период, тактика damage control.
Введение. В настоящее время травма селезенки занимает одно из ведущих мест в абдоминальной хирургии, по данным литературы повреждения этого органа встречаются в 22,3-30 %, при этом повреждения селезенки занимают второе место по частоте повреждений паренхиматозных органов [1]. Учитывая анатомическое строение селезенки, невозможность ее ушивания, основной операцией, которая выполняется при повреждениях этого орга-
