CC BY
36
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №3, 2015
УДК 576.3 Мельченко Е. A. [Melchenko Е. А.]
ПРИМЕНЕНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БИОФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ
Application of atomic-power microscopy at research of biophysical properties of red blood cells membranes
Исследование морфологических параметров биологических структур является важной задачей в диагностике, поскольку размеры и форма некоторых структур во многом определяют их физиологические свойства. По мнению исследователей, эритроцит наряду с узкоспецифическими функциями обладает общностью метаболических процессов, легко выделяется и в настоящее время признан доступной моделью живой клетки организма. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одним из методов комплексного исследования поверхностей различных объектов в микро- и нанометровом диапазоне размеров [3]. Регуляция метаболизма клетки и его адаптационная реорганизация в ответ на различные воздействия в значительной степени связаны с физико-химическими процессами, происходящими в ее мембране. Применение АСМ предоставляет возможность непосредственного наблюдения тех молекулярных структурных изменений, на существование которых ранее указывали лишь косвенные данные. Кроме получения с высоким разрешением количественных данных о геометрии объектов, АСМ позволяет также получать топографические образы таких физических параметров мембран, как твердость, адгезивная способность и молекулярное трение.
Ключевые слова: биофизические свойства мембраны, эритроцит, атомно-силовая микроскопия.
Research of morphological parameters of biological structures is an important task in diagnostics, as sizes and form of some structures determine their physiological properties. According to researchers, the erythrocyte possesses a community of metabolic processes, is easily allocated and now is recognized available model of living cell of an organism. An Atomic-power microscopy (AFM) is one of methods of complex research of surfaces of different objects in micro- and nanometer range of sizes. Adjusting of metabolism of cage and its adaptation reorganization in response to various influences are substantially connected with the physical and chemical processes happening in its membrane. The use of AFM provides the possibility of direct observation of those molecular structural changes, which had previously indicated only indirect data. Except receiving with high resolution of quantitative data on geometry of objects of AFM allows to receive also topographical images of such physical parameters of membranes as hardness, adhesive ability and molecular friction.
Keywords: biophysical properties of the membrane, erythrocyte, atomic-power microscopy.
«НАУКА, ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»
.Северо-Кавказский федеральный универст"ет
Необратимые изменения, затрагивающие биофизические свойства эритроцита, ухудшают реологические свойства крови и, как следствие, дают начало развитию застойных явлений, повреждению стенок эндотелия сосудов и развитию сосудистых заболеваний. Вязкость крови зависит от множества факторов, но к наиболее определяющим нормальную вязкость крови можно отнести: биохимические показатели крови, в том числе биофизические свойства красных клеток крови (агрегация и деформабельность эритроцитов), белковый состав плазмы крови. Уменьшение объема плазмы крови и увеличение массы эритроцита приводит к повышению уровня гематокрита с последующим увеличением общей вязкости крови. Причиной повышенного уровня гематокрита могут заболевания различной этиологии, например гипергликемия, заболевания сердца и т. д. [1].
Изменение формы эритроцитов является результатом нарушения внутриклеточного обмена или возникает вследствие внешних физико-химических и иммунологических воздействий. Атомно-силовая микроскопия является инновационным методом изучения структуры и формы клеток. Преимуществом данной микроскопии можно считать получение информации о микро- и нано-архитектонике поверхности клетки, а также о структурах подмембранных слоев. Разработка метода атомно-силовой микроскопии положила начало новому периоду в исследовании эритроцитов периферической крови. С помощью данного метода стало возможным исследование геометрических изменений в эритроцитах и получение более полной информации о состоянии эритрона по сравнению с традиционными лабораторными методами [2].
Целью данного исследования явилось исследование биофизических свойств мембран эритроцитов методом атомно-силовой микроскопии.
Материал и методы. В соответствии с поставленной целью в ходе наблюдения за состоянием больных гипертонической болезнью (ГБ) в МБУЗ «Городская клиническая больница №3», было выполнено исследование крови, охватывающее 30 человек из них 12 здоровых, 18 больных ГБ в возрасте 45-55 лет. Изучение строения мембраны эритроцитов периферической крови пациентов на субмикронном уровне осуществлялось при помощи сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) «Интегра
№3, 2015
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Применение атомно-силовой микроскопии.
133
Прима». В оптическом микроскопе находили зону одиночных клеток в монослое, после чего переносили интересующую зону на предметный столик сканирующего зондового микроскопа. Использовался кантилевер N80 20 фирмы ЭТ-Ж)Т.
В каждом образце исследовалось не менее 100 клеток. Осуществляли замер диаметра и высоты эритроцитов (рис. 1).
Рис. 1.
Этапы работы в программе.
«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»
-Северо-Кавказский федеральный университет
Сканирование участков проводилось в различных режимах полуконтактной атомно-силовой микроскопии, основанной на регистрации параметров взаимодействия колеблющегося кантилевера с поверхностью и с последующей обработкой изображения. Благодаря встроенной системе наблюдения с разрешением до 1 мкм можно в реальном времени наблюдать за процессом сканирования. Атомно-силовая микроскопия позволила получить двухмерное и трехмерное изображение эритроцитов в формате 30 Были измерены величины высоты и диаметра. Результаты представлены на рис. 2.
Рис. 2. 2D- и ЗО-изображение эритроцитов, полученное
при помощи АСМ «Интегра Прима».
№3, 2015
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Применение атомно-силовой микроскопии.
135
Статистическую обработку данных проводили с привлечением методов параметрического анализа с использованием пакета Microsoft Excel. Определяли основные статистические характеристики: среднее (X), ошибку среднего (m) и стандартное отклонение (б). Достоверность различия средних определяли по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации, уровень значимости (р) выбран менее 0,05.
Таблица 1. Изменение геометрических показателей (высоты и диаметра) эритроцитов в группах здоровых людей и больных гипертонической болезнью (X + т; Р < 0,05)
Группы Геометрические показатели, мкм. X + m
высота 1 0,402 ± 0,017
2 0,454 ± 0,034
Р Р Р < 0,01
Диаметр 1 6,18 ± 0,16
2 6,85 ± 0,15
Р Р Р < 0,01
Примечание: 1 - группа здоровых;
2 - группа больных гипертонической болезнью.
В результате статистического анализа полученных в эксперименте данных выявлено, что у группы здоровых людей эритроциты имеют достоверно меньшую высоту и диаметр по сравнению с группой больных (ГБ): здоровые - Ь - 0,402 ± 0,017 мкм; с1 - 6,18 ± 0,16 мкм;
«НАУКА, ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»
.Северо-Кавказский федеральный универст"ет
больные ГБ - Ь - 0,454 ± 0,034, с1 - 6,85 ± 0,15 мкм. Данная зависимость объясняется приспособительными механизмами организма, при которых эритроциты здоровых людей более плотные по сравнению с таковыми у людей больных ГБ.
Таким образом, изучив геометрические показатели эритроцитов периферической крови здоровых людей и больных гипертонической болезнью, было выявлено достоверное различие в размерах, говорящее о приспособительной реакции организма и периферического звена эритро-на при изменении морфологии клеток крови.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Бондарь Т.П. Изменение показателей гемопоэза у больных сахарным диабетом 2-го типа в зависимости от наличия сосудистых осложнений / Т.П. Бондарь, О.И. Анфиногенова, М.В. Бондарь, A.A. Солдатов // Саратовский научно-медицинский журнал. 2010. Т. 6. № 4. С. 783-786.
2. Бондарь Т.П., Печенкин Е.В., Петровский С.А. Исследование гемореологических показателей при осложненном сахарном диабете // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. № 9. С. 89.
3. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. М.: Изд-во «Техносфера», 2005. 182 с.
