CC BY
55
УДК 616-074:579.841.930
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, сайга, антиген, сыворотка, иммуноглобулин
Key words: enzyme immunoassay, saiga, antigen, serum, immunoglobulin
Сейсенбаева М. С., Кошеметов Ж. К., Сандыбаев Н. Т., Нурабаев С. Ш., Матвеева В. М., Богданова М. И., Сугирбаева Г. Д.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ЦЕЛьЮ ВыЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА
PREPARATION OF DIAGNOSTIC PRODUCTS FOR ELISA AIMING TO DETECT THE ANTIGEN OF PASTEURELLOSIS AGENT
РГП «НИИ проблем биологической безопасности» КН МОН РК Адрес: 080406, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, п. г. т. Гвардейский
RGE "Research Institute for Biological Safety Problems " SC ME&S RK Address: 080406, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya Oblast, Kordaiskiy Rayon, Gvardeiskiy
Сейсенбаева Мадина Сагадатовна, ст. лаборант / Seisenbayeva Madina S., Senior Laboratory Assistant Кошеметов Жумагали Каукарбаевич, к. б. н., зав. Лабораторией Koshemetov Zhumagali K., Ph.D. in Biology Science, Laboratory Chief Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич, к. б. н., ассоциированный проф., зам. ген. Директора Sandybayev Nurlan T., Ph.D. in Biology Science, Associated Professor, Deputy Director General Нурабаев Сергазы Шуратбаевич, ст. научн. сотрудник / Nurabayev Sergazy Sh., Senior Researcher Матвеева Валентина Михайловна, к. б. н., вед. научн. сотрудник Matveyeva Valentina M., Ph.D. in Biology Science, Leading Researcher Богданова Марина Ивановна, научн. сотрудник / Bogdanova Marina I., Researcher Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна, мл. уаучн. Сотрудник / Sugirbayeva Gulnur D., Junior Researcher
Аннотация. Приготовлен специфический антиген из штамма «PasteureUa/Saigas/2011/ZK0/KZ», активность которого составила в реакции диффузионной преципитации (РДП) 1 : 32. Предложена оптимальная схема получения антисыворотки к возбудителю пастереллеза на овцах, активность антисыворотки в РДП - 1 : 16. На основе данной антисыворотки приготовлены диагностические препараты (иммуноглобулины и конъюгаты), и с применением данных препаратов поставлен ИФА для выявления антигена возбудителя пастереллеза. Summary. The specific antigen from "Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ" strain has been prepared; activity in diffusion precipitation reaction (DPR) was 1: 32. The optimal diagram for receiving antiserum to agent of Pasteurellosis on sheep is proposed, activity ofantiserum in diffusion precipitation reaction was 1: 16. Diagnostic preparations (immunoglobulins and conjugates) have been prepared on the base of this antiserum. ELISA has been used with these preparations for detection antigen of Pasteurellosis agent.
Введение
Широкое географическое распространение пастереллеза, восприимчивость к нему всех видов домашних животных, многих диких млекопитающих и птиц, а также значительный ущерб, наносимый им, требует совершенствования существующих диагностических методов и лечебно-профилактических мероприятий.
В настоящее время для диагностики и дифференциации пастереллеза используются микробиологические методы и лабораторные тест-системы.
Из лабораторных тест-систем в мировой практике для диагностики возбудителя па-стереллеза применяются: реакция непрямой
гемагглютинации (РНГА), РДП, иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразной цепной реакция (ПЦР) и другие методы.
Среди лабораторных методов ИФА находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе как экспресс тест-система.
Достоинствами ИФА является возможность ранней диагностики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе. Метод ИФА продолжает широко применяться для определения напряженности иммунитета к возбудителю пастереллеза
с целью эпидемиологического и эпизоотического надзора за инфекцией среди животных и птиц в Российской Федерации, США и Европейских странах [6].
Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа от нескольких минут до нескольких часов, возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости в предварительных операциях по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90 %.
Метод ИФА используется как диагностическая тест-система с 1972 года, однако создается необходимость каждый раз оптимизировать условия постановки для диагностики новых выделенных штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, т. к. в процессе эволюций могут быть изменены антигенные свойства одной той же инфекции.
В связи с вышеизложенным в этой работе приведены данные по приготовлению диагностических препаратов на основе штамма «Pasteшгe11a/Saigas/20ШZKO/KZ» возбудителя пастереллеза, выделенного на территории Западно-Казахстанской области в 2011 году от павших сайгаков, пригодных для оптимизации условий постановки ИФА по выявлению антигена вышеуказанной инфекции.
Материалы и методы исследования
Возбудитель. В работе использовали штамм «Pasteшrella/Saigas/2011/ZKO/KZ».
Бактериальную массу штамма «Pasteшrella/Saigas/2011/ZKO/KZ» получали путем посева на питательный агар с 20 % сывороткой крови КРС и проводили инкубацию в течение 24-48 часов при 37 °С по общепринятому методу. Активность наработанной бактериальной массы в РДП составила 1 : 8 - 1 : 16.
Приготовление антигена. Полученную бактериальную массу штамма «Ра81ешге11а/
Saigas/2011/ZKO/KZ» инактивировали формалином в конечной концентрации 0,3 % в течение 24 часов при 37 °С при постоянном перемешивании. При проверке полноты инактивации возбудителя пастереллеза на мышатах и на питательном агаре, мышата оставались живыми в течение 7 суток (срок наблюдения) и на питательном агаре рост колоний в течение трех суток не наблюдался. В ходе опыта установлено, что формалин в конечной концентрации 0,3 % в течение 24 часов при 37 °С полностью инактивиру-ет бактериальные пробы. С целью освобождения суспензий от клеточных балластов их отмывали трехкратно физиологическим раствором путем центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 15 минут, затем сконцентрировали пробы 10-кратно. Далее антиген приготовлен 5 способами.
1 способ - осаждение суспензии при 15000 об./мин. в течение 15 минут, добавление к осадку Bug Buster Mix из расчета 5 мл на 1 г. Осадок тщательно ресуспенди-ровали в течение 5 минут встряхиванием вручную. Затем инкубировали 60 минут на ротаторе (медленное перемешивание) при комнатной температуре. Центрифугировали при 16000 g 20 минут при 4 °С, надоса-док - растворимые белки, осадок - нерастворимые белки.
2 способ - обработка суспензии УЗИ по 5 секунд 3 раза (21 кГц, 20-30 миллиампер), очистка от балластов центрифугированием при 1000 об./мин. 10 мин. Затем надосадок очищали через слой 30 % сахарозы центрифугированием при 20000 об./мин. в течение 15 минут, отмывка от сахарозы.
3 способ - отмывка трехкратно путем центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 10 мин.
4 способ - обработка УЗИ по 5 секунд 3 раза (21 кГц, 20-30 миллиампер), очистка от балластов центрифугированием при 1000 об./мин. 10 мин. Надосадок обрабатывали твин-эфиром, для этого к суспензии добавляли 0,1 % твина-80 и оставляли на холоде в течение 30 минут, изредка помешивая. Затем суспензию смешивали на холоде с эфиром в соотношении 1 : 1 и выдерживали в течение 2 часов при 4 °С,
постоянно встряхивая на шуттель-аппа-рате. Нижнюю слабоопалесцирующую водную фазу отделяли и удаляли остатки эфира выветриванием в течение суток при 4 °С, материал осветляли путем центрифугирования при 1000 об./мин. 10 мин. Затем очищали через 30 % сахарозу центрифугированием при 20000 об./мин. в течение 15 минут, отмывали от сахарозы.
5 способ - по методу Grosset [8]. С этой целью культуры пастереллеза выращивали на питательной среде с pH 7,2-7,4 в течение 18-24 часов при 37 °С. Микробные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 20 минут и трижды отмывали физиологическим раствором pH 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляли небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушали путем замораживания при минус 60 °С и оттаивания (37 °С) от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугировали при 6000 об./мин. в течение 20 мин. Полученная насадочная жидкость представляет собой комплекс водорастворимых антигенов.
Содержание белка в препаратах определяли по методу Лоури [9], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы "Sigma" (США).
Коммерческий ПЦР набор фирмы «Bactotype», Германия. Постановку осуществляли согласно наставлению по применению данного набора.
Животные. Донорами специфических антител служили козы и овцы местной породы в возрасте до одного года.
Специфические иммуноглобулины к антигену возбудителя пастереллеза из специфических антисывороток выделяли спиртовым методом по Кону [5].
Специфические конъюгаты получали по методу Wilson M.B., Nakane P.K. [10]. В работе использовали пероксидазу хрена фирмы "Sigma" (США) типа VI-А.
Результаты исследований
Антигенную активность приготовленных препаратов проверяли путем введения материалов кроликам внутривенно в объеме по 0,5 см3. Через неделю после введения материалов отобранные от кроликов сыворотки крови проверяли на образование антител в РДП и ИФА, результаты представлены в таблице 1.
По результатам таблицы можно судить, что антигены, приготовленные разными способами, способствуют образованию антител в организме крольчат после однократного введения исследуемых проб через 7 суток. Активность антител составила в ИФА в пределах 1 : 400 - 1 : 6400, также с помощью РДП в трех пробах были выявлены антитела к возбудителю пастереллеза в цельном виде.
В ходе проведенного исследования удалось сконцентрировать, очистить и проверить антигенные свойства штамма «Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ» возбудителя пастереллеза.
В дальнейшем были проведены опыты по получению антисывороток к штамму «Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ» возбудителя пастереллеза на разных видах животных с применением антигена, приготовленного по методу Grosset, т. к. по данным таблицы 1
Таблица 1.
Антигенные свойства приготовленных разными способами антигенов
Наименование материала для введения Штамм Активность в
РДП ИФА
1 способ «Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ» + 1 : 800
2 способ - 1 :1600
3 способ - 1 : 400
4 способ + 1 :3200
5 способ + 1 :6400
Примечание: + - положительный результат; «-» - отрицательный результат.
можно судить, что в организме кроликов активный иммунный ответ получен на данный антиген [8].
При получении антисывороток к возбудителю пастереллеза использовали коз и овец местной породы в возрасте 8-12 мес. Животных до проведения экспериментов выдерживали на карантине в течение 2 недель с проведением термометрии, клинического осмотра и исследованием сывороток крови на наличие вируснейтрализующих антител. Содержание животных проводили в соответствии с «Инструкцией по содержанию подопытных животных и ветеринарно-са-нитарным правилам в экспериментально-биологических изоляторах» НИИПББ инв. № 1069 [4].
Схемы получения антисывороток к возбудителю пастереллеза представлены в таблице 2.
Оценку активности и специфичности полученных антисывороток проводили в РДП. Результаты проведенного опыта по получению антисывороток к возбудителю пастерел-леза и оценка их активности представлены в таблице 3.
Из результатов таблицы 3 видно, что активность овечьей антисыворотки к возбудителю пастереллеза составила в РДП 1 : 32, в ИФА - 1 : 3200, козья антисыворотка показала активность в РДП - 1 : 4, в ИФА -1 : 100 - 1 : 800. Неспецифические реакции с гетерогенными антигенами не наблюдались, что свидетельствует о специфичности полученных нами антител.
В дальнейшем в наших опытах проводились работы по выделению иммуноглобулинов из специфических сывороток крови к возбудителю пастереллеза, полученных на овцах. Выделение иммуноглобулина из антисыворотки к возбудителю пастереллеза проводили двумя методами. Первый способ заключался в использовании 3-ступенчато-го осаждения альбумина и иммуноглобулина различными концентрациями этилового спирта по методу Кона, и второй с помощью сернокислого аммония (NH4)2SO4 [5]. Выделенные иммуноглобулины проверяли на активность и специфичность в РДП, результаты исследований представлены в таблице 4.
Как свидетельствуют данные таблицы 4, из испытанных двух методов выделения иммуноглобулинов из специфических сывороток более приемлемым оказался спиртовый метод по Кону, активность иммуноглобулина, выделенного по данному методу, в РДП составила 1 : 32-64, а активность иммуноглобулина, выделенного сернокислым аммонием, в РДП была на один порядок ниже.
На основе приготовленных иммуноглобулинов были получены вирусспецифические иммунопероксидазные конъюгаты по методу Wilson M. B., Nakane P. K. [10]. Для приготовления специфического конъюгата использовали иммуноглобулин, выделенный по методу Кона. Активность и специфичность приготовленного иммуноферментного конъ-югата проверяли в ИФА, предельная активность которого составила 1 : 800 - 1 : 1600, а рабочее разведение - 1 : 100.
С использованием приготовленных препаратов был оптимизирован прямой вариант ИФА для обнаружения антигена возбудителя пастереллеза. Для оптимизации условий постановки ИФА были испытаны разные временные и температурные параметры постановки ИФА, подобраны буферные растворы и рабочие концентрации компонентов реакции.
Оптимизированный вариант ИФА был испытан на специфичность и эффективность. Для этого при постановке ИФА использованы гомогенные и гетерогенные пробы, результаты представлены в таблице 5.
Из результатов таблицы 5 видно, что в исследуемых органо-тканевых пробах с помощью конъюгата к возбудителю пастереллеза выявлен антиген пастереллеза в титрах 1 : 16 -1 : 32, а в концентрированных культураль-ных пробах - 1 : 3200-6400. В тоже время все нормальные и гетерологичные образцы показали отрицательный результат в ИФА.
Обсуждение результатов
С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования бактерий пастереллеза до настоящего времени зарубежными учеными проведены определенные исследования. Так, например, Са-муйленко А. Я. с соавторами и Рубан Е. А.
Таблица 2.
Схемы получения антисывороток к возбудителю пастереллеза
№ Вид Наименование Способ Концентрация белка, Интервал между
схемы животного вводимого введения мкг/см3 введениями, сут.
материала
1 Баран штамм «Pasteurella/ Saigas/2011/ ZKO/KZ» В область предлопаточных лимфатиче ских узлов 80 18
150+0,05 % ГОА 9
250+2,5 % Montanid ISA-71 7
2 Коза 80 18
150+0,05 % ГОА 9
250+2,5 % Montanid ISA-71 7
Таблица 3.
Оценка активности антисывороток к возбудителю пастереллеза в РДП
Наименование антисыворотки Активность
в РДП в ИФА
АгС бруцеллеза АгН АгС 1 :3200
Овечья - - 1/32 1 : 800
Козья - - 1/4
Примечание: «-» - отрицательный результат; АгН - антиген нормальный; АгС - антиген специфический.
Таблица 4.
Активность и специфичность иммуноглобулинов в РДП
Исходная активность сыворотки в РДП Методы выделения иммуноглобулина Активность иммуноглобулинов в РДП
АгС бруцеллеза АгС C АгН
Овечьи 1 : 32 по Кону у-глобулин - 1 :32-64 -
по Кону В-глобулин - 1 :32-64 -
(NH4)2SO4 иммуноглобулин - 1 : 32 -
Таблица 5.
Результаты исследования проб на выявление антигена возбудителя пастереллеза в ИФА
№ п/п Наименование проб Активность в ИФА
1 Предлопаточный лимфатический узел от павшего козленка после заражения штаммом «Pasteurella/Saigas/2011/ZK0/KZ» 1 : 16 - 1 : 32
2 Селезенка от павшего козленка после заражения штаммом «Pasteurella/Saigas/2011/ZK0/KZ» 1 : 16 - 1 : 32
3 АgS возбудителя E. coli -
4 АgS возбудителя B. abortus 19 -
5 АgN из ПБ -
6 АgS штамма «Pasteurella/Saigas/2011/ZK0/KZ» возбудителя пастереллеза 1 : 3200 - 1 : 6400
Примечание: «-» - отрицательный результат; АgS - антиген специфический; АgN - антиген нормальный; ПБ - питательный бульон.
с соавторами (2000, 2003) для получения биомассы возбудителя пастереллеза в работе использовали производственные штаммы Pasteurella multocida А-1231, В-681 и Д-Т-80. Питательные среды для выращивания вакцинных штаммов готовили по действующим инструкциям на монопрепараты, а их выращивание осуществляли в лабораторных ферментерах АНКУМ-2М, оснащенных системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН и СО2).
Концентрация культур производственных штаммов по окончании процесса выращивания (10-12 часов) была 22±2 млрд м. т. / мл.
Культуры пастерелл инактивирова-ли формалином в конечной концентрации 0,3 % при температуре 37 °С в течение 24 часов и концентрировали методом центрифугирования.
Кроме того, в последние годы за рубежом изготавливается целый ряд вакцинных и сывороточных препаратов против пасте-реллеза [3, 2].
Исследования по отработке схемы гипериммунизации и получению опытных партий сывороток против пастереллеза свиней проводили на Армавирской биофабрике (Школьников Е. Э. и др., 2007; Гринь С. А. и др., 2007).
Для этого были сформированы пять групп свиней по пять голов в каждой.
Гипериммунизацию свиней проводили путем внутримышечных инъекций возрастающих доз инактивированных концентрированных пастереллезных антигенов с интервалом в 2-3 сут. При этом исследователи антигены вводили раздельно в разные участки тела животного. Авторами были испытаны пять схем, отличающихся дозой антигена и количеством инъекций.
В результате гипериммунизация свиней путем 10 внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированного концентрированного пастереллезного антигена в общем количестве по 1000 млрд микробных тел (м. т.) позволяет получить сыворотку с титрами антител в РА : к Р. тикоаёа А, D -1 : 400, В - 1 : 800.
Таким образом, авторы предлагают для получения сыворотки против пастереллеза свиней следующую схему гипериммунизации: 8-10 инъекций пастереллезного антигена в общей дозе - 645-1000 млрд м. т., с интервалом в 2-3 дня [7, 1].
Подитоживая полученные в данной работе результаты, можно сказать, что приготовленные нами диагностические препараты при пастереллезе по активности и специфичности не уступают зарубежным аналогам.
Заключение
В результате проведенных исследований был приготовлен активный концентрированный и очищенный антиген возбудителя пастереллеза из штамма «Pasteurella/ Saigas/2011/ZK0/KZ», активность которого в РДП составила 1 : 32.
С использованием данного антигена получены активные и специфичные антисыворотки в разных видах животных. Наиболее активные и специфичные антитела к штамму «Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ» возбудителя пастереллеза получены на овцах, активность данной сыворотки в РДП составила 1 : 32, в ИФА - 1 : 3200.
Из испытанных двух методов выделения иммуноглобулинов из специфических сывороток более активные иммуноглобулины получены спиртовым методом по Кону, активность иммуноглобулина в РДП составила 1 :32-64.
На основе иммуноглобулина приготовлен специфический иммунопероксидаз-ный конъюгат по методу Wilson M. В., Nakane P. K. Предельная активность его в ИФА составила 1 : 800 - 1 : 1600, а рабочее разведение - 1 : 100.
С применением данных препаратов был поставлен ИФА для идентификации пастереллеза в образцах биологического материала.
Список литературы
1. Гринь, С. А. Изучение гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней на продуцентах-свиньях / С. А. Гринь, Е. Э. Школьников, Г. Ф. Коломнина, В. В. Меньшенин, Е. В. Кржижановская, А. К. Чулков, Д. И. Скородумов, Л. Я. Старцева, Е. В. Малик // Материалы Международной научно-практической конференции «Научные
основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково, 2007. - С. 249-253.
2. Рубан, Е. А. Некоторые проблемы глубинного культивирования клеток животных в биореакторах / Е. А. Рубан, Б. В. Соловьев, С. А. Самуйленко, А. Я. Самуйленко, В. И. Клюкина // Биологическая научно-практическая конференция ВГНКИ. - Москва, 2000. - С. 290-293.
3. Самуйленко, А. Я. Исследование гибели клеток в процессе аэрации при глубинном культивировании в биореакторе / А. Я. Самуйленко, Е. А. Рубан, М. А. Гунин, С. А. Самуйленко // Международная научно-практическая конференция «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии. -Покров, 2000. - С. 199-203.
4. Сансызбай, А. Р. Инструкция по содержанию подопытных животных и ветеринарно-санитарным правилам в экспериментально-биологических изоляторах : инв. № 1069. Утв. генеральным директором НИИПББ Республики Казахстан.
5. Фримель, Г. Иммунологические методы. -М. : Медицина, 1987. - 472 с.
6. Хралович Т. М. Получение специфического сенситина для ИФА из штаммов Pasteurella multocida серотипов А1, А3, А4 // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. - Минск. - 2006, № 3. - С. 57-62.
7. Школьников, Е. Э. Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрепто-коккоза и пастереллеза свиней / Е. Э. Школьников, Г. Ф. Коломнина, А. Я. Самуйленко, С. А. Гринь, Э. А. Шегидевич, Л. Я. Ставцева, М. А. Сидоров, Д. И. Скородумов, А. Н. Панин, Е. В. Малик, Е. В. Кржижановская, А. К. Чулков / Заявка на патент № 2007123692 от 20.06.2007 г.
8. Grasset, E. C.R. Soc. Biol. - 1935, v. 118 - 765 p.
9. Lowry, O. H. J. Biol. Chem / Lowry O. H., Rosebrough N. I., Farr A. L. - 1951, v. 193. -P. 265-275.
10. Wilson, M. B. Resent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies / M. B.Wilson, P. K. Nakane // Biomedical press, 1978. - P. 215-244.
