CC BY
573
Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика
Меркулов В.А., Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Гайдерова Л.А., Яковлев А.К., Медуницын Н.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics
Merkulov V.A., SoldatovA.A., Avdeeva J.I., Alpatova N.A., Gayderova L.A., YakovlevA.K., Medunitsyn N.V.
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Представлен обзор по лекарственным препаратам эритропоэтинов, получаемых на основе технологии рекомбинантной ДНК. В настоящее время наиболее эффективным методом лечения анемий, вызванных снижением синтеза эритропоэтинов, является применение препаратов рекомбинатных эритропоэтинов (rHuEPOs). Эри-тропоэтин является гетерогенным гликопротеином, состоит из нескольких различных изоформ, образующихся преимущественно путем гликозилирования, биологическая активность разных изоформ эпоэтина различна. Физико-химические характеристики определяют такие свойства препарата, как стабильность, активность, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, иммуногенность, которые, в конечном итоге, влияют на профиль безопасности и эффективности его применения. Использование технологии рекомбинантной ДНК для изготовления лекарственных препаратов rHuEPOs не позволяет получить полную копию оригинального стандартного препарата. Поэтому препараты rHuEPOs, выпускаемые разными фирмами, имеют отличия по показателям качества (подлинности, рН, осмолярности, содержанию белка, биологической активности), которые могут влиять на безопасность и эффективность их применения. Представлены сведения о зарегистрированных лекарственных препаратах эритропоэтинов, показаниях для их клинического применения. Обосновывается необходимость разработки единых требований, регламентирующих показатели качества лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов, что не только позволит унифицировать требования к данным препаратам как отечественного, так и зарубежного производства, но и повысит качество, безопасность и эффективность их клинического применения. Требования при оценке показателей качества препаратов рекомбинантных эритропоэтинов должны быть гармонизированы с международными нормативными документами и должны соответствовать современным научным достижениям.
Ключевые слова: лекарственные препараты эритропоэтинов, рекомбинантные белки эритропоэтинов, физико-химические свойства, биологическая активность, оценка качества, показания к применению.
Библиографическое описание: Меркулов В.А., Солдатов А.А., АвдееваЖ.И., Алпатова Н.А., Гайдерова Л.А., Яковлев А.К., Медуницын Н.В. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 4-11.
The present review describes erythropoietin preparations on the basis of recombinant DNA technology. At present the most effective method of treating anemia caused by decreased synthesis of erythropoietin, is using recombinant erythropoietin preparations (rHuEPOs). Erythropoietin is a heterogeneous glycoprotein consisting of several various isoforms built primarily by glycosylation. Biological activity of various epoetin isoforms differs. Physicochemical properties of a preparation induce the following characteristics: stability, activity, pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, immunogenicity, which ultimately affect it’s safety and efficacy profile. The use of recombinant DNA technology for the manufacture of rHuEPOs preparations does not allow to obtain an exact copy of the original reference drug. Therefore, rHuEPOs preparations manufactured by variuos companies, differ in terms of quality (identity, pH, osmolarity, protein content, biological activity), which may affect their safety and efficacy. The review provides information on authorized erythropoietin medicines and their proposed clinical use. It justifies the necessity to develop unified standards, regulating recombinant erythropoietin drug quality indicators, which allows not only to unify the requirements for this type of medicines, both domestic and foreign manufacture, but also to improve their quality, safety and efficacy of their clinical use. The quality requirements for the evaluation of recombinant erythropoietin products must be harmonized with international regulations and must conform to modern scientific achievements.
Key words: recombinant erythropoietin preparations, recombinant erythropoietin proteins, physico-chemical properties, biological activity, quality evaluation, proposed clinical use.
Bibliographic description: Merkulov V.A., Soldatov A.A., Avdeeva J.I., Alpatova N.A., Gayderova L.A., Yakovlev A.K., Medunitsyn N.V. Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 3. P. 4-11.
( Обзор Review ),
Review
Для корреспонденции:
Солдатов А.А. - главный эксперт Управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов
Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41,
e-mail: [email protected]
Статья поступила 25.10.12 г, принята к печати 22.08.2013 г
Многие заболевания и патологические состояния сопровождаются снижением количества эритроцитов и, соответственно, гемоглобина, что приводит к снижению “кислородной ёмкости крови” и развитию симптоматической анемии. Одной из причин данного вида анемии является снижение или полное прекращение синтеза эритропоэтина. Снижение синтеза эритропо-этина развивается на фоне таких тяжелых состояний, как опухолевый процесс, почечная недостаточность, СПИД и др. Лечение анемии у больных с данной патологией возможно с использованием только двух методов - гемотрансфузия (переливание крови) или введение в организм аналога эритропоэтина. В организме эритропоэтин синтезируется в мизерных количествах, поэтому единственным методом получения эндогенного аналога эритропоэтина является генно-инженерная технология с использованием рекомбинантной ДНК. Развитие биотехнологии, в первую очередь методов генной инженерии и высокой степени очистки биопрепаратов, позволило значительно увеличить количество и номенклатуру рекомбинантных эпоэтинов. Однако, нормативные требования для оценки качества, проведения доклинических и клинических исследований препаратов рекомбинантных эритропоэтинов отсутствуют.
В данной работе представлен обзор основных показателей качества, которые необходимо учитывать при разработке унифицированных требований при оценке качества, безопасности и эффективности на этапах разработки, проведения доклинических и клинических исследований и регистрации препаратов рекомбинантных эпоэтинов.
дисульфидных связей между цистеинами. Молекула эритропоэтина представляет связанные между собой четыре а-спирали, которые свернуты в компактную шаровидную структуру (рис. 1). Углеводы составляют 40-50% массы молекулы гликопротеина, при этом около 17% приходится на сиаловую кислоту. Молекулярная масса гликопротеина 32-36 кДа, расчетная масса белковой части - 18,4 кДа. Изоэлектрическая точка эритропоэтина низкая р1 3,5-4,0, что обусловлено наличием сиаловых кислот в терминальных отделах углеводных цепочек [3, 4].
KEPFEL-FHONHJ»
А
Химическое строение, механизм синтеза и основные функции эритропоэтина
Эритропоэтин является гликопротеином и относится к группе цитокинов I класса (семейство факторов гемопоэтических клеток), поддерживающих жизнеспособность и пролиферацию кроветворных клеток. Являясь основным регулятором эритропоэза, эри-тропоэтин стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга [1]. Впервые эри-тропоэтин был выделен и очищен из мочи больного апластической анемией в 1977 году, молекула природного эритропоэтина состоит из 165 аминокислотных остатков. Эритропоэтин является гетерогенным гликопротеином, состоящим из нескольких различных изоформ, образующихся преимущественно путем гли-козилирования [2]. Сахара присоединяются к протеину в участках гликозилирования путем образования одной О-связи (серин) и трех ^связей (аспарагин). Трехмерная структура эритропоэтина формируется за счет двух
\jyis
\ I w J 1
• / Г "
рис. 1. структура молекулы эритропоэтина. А - двумерная модель молекулы эритропоэтина: “=” - дисульфид-ная связь, М - манноза, в - галактоза, • - аминокислоты, N - ацетилглюкозамин, N - ацетилгалактозамин. Б - пространственная модель молекулы эритропоэтина.
Б
Молекулы эритропоэтинов имеют сходное строение у различных видов животных, гомология составляет 80 %.
У взрослого человека основное количество эритро-поэтина синтезируется почками и до 10-15% синтезируется гепатоцитами и эпителиальными клетками, окружающими центральные вены. Сигналом к выработке эритропоэтина в организме является снижение парциального давления кислорода в циркулирующей крови. В норме содержание эритропоэтина в крови колеблется в пределах 10-15 мМЕ/мл, что позволяет поддерживать эритропоэз на уровне 1,8*109 ретикулоцитов в минуту. Серьезное кровотечение может вызвать увеличение продукции эритроцитов в 10-12 раз, за счет повышения в плазме уровня эритропоэтинов до 10000 мМЕ/мл. Период полувыведения эритропоэтина составляет от 6 до 10 часов. В норме эритропоэтин выводится почками, попадая в мочу из крови, а не из клеток почек.
Нарушение синтеза эритропоэтина почками сопровождается снижением синтеза эритроцитов и развитием анемии. Подавление активности эритро-поэза развивается при патологии почек, при опухолевом процессе (в результате синтеза большого количества провоспалительных цитокинов и химиотерапии), при действии факторов, подавляющих деление клеток (радиационное излучение и т.п.) и др. Разработка технологии получения рекомбинантных эритропоэтинов (rHuEPOs) открыла новую эру лечения анемий, обусловленных сниженным синтезом эритропоэтина [6, 7].
основные виды рекомбинантных эритропоэтинов
Эритропоэтин является первым цитокином, который был клонирован и получен в виде рекомбинантного белка. Эритропоэтин, полученный с использованием клеток насекомых (с вектором на основе бакуловируса), имел молекулярную массу 23 кДа и сниженное количество углеводных цепочек. В системе in vitro биологическая активность данного эритропоэтина соответствовала нативному, однако в исследованиях in vivo была установлена его более низкая биологическая активность. Бактериальная система синтеза рекомбинантного эритропоэтина не позволила получить гликопротеин, в котором гликозилирование соответствует (или подобно) нативному эритропоэтину [8]. Известно, что бактериальная клетка имеет систему гликозилирования, принципиально отличающуюся от эукариотической. Препарат, синтезированный в системе клеток Escherichia coli, распознавался антителами против эритропоэтина и имел молекулярную массу, соответствующую дегликозилированному эритропоэтину.
Наиболее удачными явились исследования Lin F.K. с соавт. [9], которые первыми получили эритропоэтин в культуре клеток линии СНО (эпителиоподоб-ные клетки из яичника китайского хомячка). Для этого была использована плазмида, которая содержала ген эритропоэтина человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40.
Для получения следующего рекомбинантного эритропоэтина использована линия клеток из почки хомячка (ВНК), в которые встраивали две плазмиды, одна
из которых содержала ген эритропоэтина человека, другая - ген дегидрофолатредуктазы.
Разработка технологии получения rHuEPOs на основе клеток линии СНО позволила начать промышленный выпуск лекарственных препаратов на основе рекомбинантных эритропоэтинов. Вопрос о том, какие критерии должны быть положены в основу при определении МНН рекомбинантным эритропопэтинам, рассматривались в 1989, 2009 и 2010 международной группой ВОЗ (Consultation on International Nonproprietary Names), которая ежегодно рассматривает вопросы, связанные с присвоением МНН лекарственным средствам. При появлении первых рекомбинантных эритропоэтинов было мало информации об их физико-химических и биологических свойствах. В дальнейшем, с появлением новых препаратов, стало понятно, что препараты рекомбинантных эритропоэтинов различаются между собой по степени гликозилирования. Практически невозможно в разных производственных условиях получить абсолютно идентичные препараты, даже при сходстве аминокислотной цепочки они будут отличаться по качественным и количественным характеристикам полисахаридных цепочек. Поэтому было принято решение о том,что для определения МНН рекомбинантных препаратов эритропоэтинов будет использоваться корень - poetin, а приставка (префикс) будет определяться в зависимости от того, имеется или нет изменение аминокислотной цепочки. При неизмененной аминокислотной последовательности добавляется “э” (“е” в английском варианте) - эпоэтин. Для препаратов, которые имеют модифицированную последовательность аминокислот присоединяется другой префикс (например, дарбэпоэтин). В настоящее время известны девять видов эпоэтинов (альфа, бета, гамма, дельта, эпсилон, каппа, омега, тета и дзета). К основному наименованию добавляется буква греческого алфавита, которая характеризует особенности гликозили-рования, фактически это отражает разработку нового производственного процесса получения рекомбинантного эпоэтина.
Препараты рекомбинантных эритропоэтинов, зарегистрированные органами контроля стран ЕС (ЕМА), США (FDA) и Российской Федерации, включенные в Государственный реестр лекарственных средств РФ, представлены в таблице 1.
Американская компания «Amgen», разработав биотехнологию получения эпоэтина альфа в системе клеток СНО, получила патент на препарат Epogen, после продажи патента компании «Johnson & Johnson», последняя начала выпускать препарат с наименованием Procrit для США и наименованием Eprex для других стран.
Эпоэтин бета, синтезируемый клетками СНО, был разработан двумя фирмами «Roche» и «Chugai» и поступил на рынки под торговыми наименованиями Neo-Recormon (Ф. «Roche») и Epogin (Ф. «Chugai»).
Следующим rHuEPO является препарат эпоэтин омега, для синтеза которого были использованы клетки почки хомячка. Права на препарат Epomax приобрела фирма «Baxter», которая не стала дальше развивать препарат.
Европейские фирмы «Transkaryotic» и «Aventis» разработали технологию получения препарата Dynepo (эпоэтин дельта), который синтезируется опухолевыми
( Обзор
Review
Таблица 1. Зарегистрированные лекарственные препараты рекомбинантных эритропоэтинов в Российской Федерации, странах ЕС, США
1^ Торговое наименование
РФ Страны ЕС (ЕМА) США (FDA)
Epoetin alfa Эпрекс Эпокомб Бинокрит Эпокрин Аэприн Abseamed Binocrit Epoetin Epogen
Epoetin beta Рекормон Эпостим Эритростим Эритропоэтин Веро-Эпоэтин NeoRecormon
Epoetin theta Biopoin Eporatio
Epoetin zeta Retacrit SiLapo
Darbepoetin alfa Аранесп Aranesp Aranesp
Methoxipoly-ethyleneglycol epoetin beta Мирцера Mircera Mircera
клетками фибросаркомы человека (НТ-1080). Среди всех рекомбинантных препаратов, эпоэтин дельта имеет наибольшее сходство с нативным эритропоэтином, в нем также не содержится N-гликолилнейраминовая кислота. Препарат выпускался около года и затем по коммерческим причинам его выпуск был прекращен. В настоящее время фирма «Sanofi-Aventis» готовится к выпуску препарата DynEpo (эритропоэтин сигма), также синтезируемого клетками фибросаркомы человека (НТ-1080).
К воспроизведенным препаратам эпоэтина альфа относится разработанный «Japan Chemical Research Pharmaceuticals Co.» и одобренный Японским национальным органом контроля как препарат эпоэтин каппа. В странах ЕС разработаны и зарегистрированы воспроизведенные препараты эпоэтина альфа: Bin-ocrit («Sandoz»), Epoetin alfa Hexal («Hexal Biotech»), Ab-seamed («Medice Arzneimittel») и препараты эпоэтина зета: Silapo («Stada») и Retacrit («Hospira») [10].
В Российской Федерации, по данным реестра лекарственных средств Министерства здравоохранения, разработаны и выпускаются препараты эпоэтина альфа (ГосНИИ ОЧБ) и эпоэтина бета («Фармапарк», «Микроген», «Биннофарм», «Лэнс-Фарм» и ЗАО МТХ).
Рядом зарубежных фирм разработаны новые лекарственные препараты эритропоэтинов, характеризующиеся более высокой эффективностью. Одним из путей повышения эффективности rHuEPOs является увеличение времени циркуляции в крови препарата за счет образования непрочной связи активного центра эпоэтина с соответствующим рецептором на клетках, что позволяет ему многократно активировать рецептор к эритропоэтину. Этого можно достичь путем использования одного из двух подходов - за счет увеличения молекулярной массы самого rHuEPO или в результате
его полимеризации. Фирма «Amgen» разработала препарат Дарбэпоэтин (эпоэтин альфа), в котором к аминокислотной цепочке присоединены 2 дополнительные углеводные N-цепочки в положении Asn30 и Asn88. В результате этого, количество сиаловых остатков увеличилось до 22, доля углеводного компонента повысилась до 52% молекулярной массы, которая составила 37,1 кДа.
Компания «Ф.Хоффманн-Ля Рош Лтд.» разработала препарат Mircera, в котором молекула эпоэтина бета присоединена к метоксиполиэтиленгликолю. Данная комбинация позволила повысить молекулярную массу до 60 кДа, при этом полимеризация rHuEPO вызвала снижение сродства активного центра эритропоэтина к соответствующему рецептору на клетках [6].
физико-химические и биологические свойства препаратов рекомбинантных эпоэтинов
Физико-химические характеристики определяют такие свойства препарата, как стабильность, активность, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, иммуногенность и др., которые в конечном итоге влияют на профиль безопасности и эффективности применения лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов.
Аминокислотная цепочка молекулы эритропоэтина является стабильной структурой, а углеводная часть молекулы может меняться. Например, олигосахариды ^участков глизилирования могут содержать 2, 3 или 4 ответвления. В каждом из ответвлений в терминальном отделе прикреплены отрицательно заряженные сиало-вые кислоты, которые сообщают кислотные свойства гликопротеину. Углеводы О-участка либо не содержат,
С
рис. 2. Варианты гликозилирования: первый ряд - глико-зилирование эпоэтина альфа, бета и т.п.; второй ряд - гли-козилирование дарбэпоэтинов; третий ряд - углеводородные цепочки пегилированного эпоэтина (№/. Jelkmann, 2007).
либо содержат до 2 сиаловых кислот (рис. 2).
Количество сиаловых остатков в молекуле HuEPOs может достигать 14, что составляет около 17% от всех углеводных компонентов в составе гликопротеина. Изучение рекомбинантного эпоэтина альфа показало его неоднородность, которая включает присутствие изоформ с содержанием от 9 до 14 сиаловых кислот. По
данным международных исследований биологическая активность разных изоформ эпоэтина различна [2, 4].
Количественный и качественный состав углеводной части молекулы HuEPOs определяет стабильность и специфическую, биологическую активность эритропо-этина [11-13]. При отщеплении всей углеводной части молекулы rHuEPO с помощью гликозидаз наблюдается потеря до 80% активности, оцениваемой в тестах in vitro. При ферментативной обработке гликозилированно-го эритропоэтина с удалением всех остатков сиаловой кислоты происходит потеря активности эритропоэтина in vivo, при сохранении активности in vitro. Более активное снижение активности in vivo связано с тем, что при отсутствии в терминальном отделе углеводной цепочки сиаловой кислоты, происходит связывание гликопротеиновой цепочки эритропоэтина с азилало-гликопротеином. Образующийся азило-эритропоэтин активно выводится из организма с мочой. Поэтому, чем больше сиаловых остатков в боковой цепи, тем больше времени циркулирует rHuEPO в крови. В то же время, чем меньше содержание сиаловых остатков в боковой цепи, тем активнее rHuEPO взаимодействует с рецептором к эритропоэтину на клетках. Все эти данные указывают на существенную роль структуры углеводного компонента для биологической активности эритропоэтина in vivo. По-видимому, более высокая активность in vitro тех форм эритропоэтина, которые содержат неполный углеводный компонент, связана с облегчением взаимодействий эритропоэтина с рецепторами. В то же время, по-видимому, именно углеводный компонент обеспечивает стабильность эритропоэтина в организме и соответственно высокий уровень биологической активности в тестах in vivo. Следует отметить, что в организме человека в печени происходит деградация rHuEPOs, при которой происходит постепенное отщепление сиаловых кислот [5, 10].
Клинические испытания рекомбинантных эритропо-этинов показали, что особенности химического строения rHuEPOs определяют, прежде всего, фармакокинетические свойства препаратов. Например, эпоэтин бета содержит большее количество основных изоформ, которые вызывают более активное связывание с лектинами (Erythrina cristagalli, Lycopersicon esculen-
Таблица 2. Показатели фармакокинетических свойств рекомбинантных эритропоэтинов при введении больным с анемией на фоне хронической почечной недостаточности
Эпоэтин альфа Эпоэтин бета Дарбэпоэтин (эпоэтин альфа) Метокси-полиэтилен-гликоль эпоэтин бета
Молекулярная масса (кДа) 29,9 29,9 37,1 60
Содержание углеводов (%) в молекуле 40 40 52 не определ.
Период полувыведения при в/в (ч) 4 - б 4 - 12 21 134
Период полувыведения при п/к (ч) 24 13 - 28 73 139 - 142
Время достижения максимальной концентрации при п/к введении (ч) 12-18 12 - 28 54 72 - 95
Биодоступность после п/к введения (%) до 20 23 - 42 37 54 - 62
Количество введений при лечении анемии в неделю 2 1 - 3 0,5 - 1 0,25 - 0,5
Review
)
tum, Phaseolis vulgaris и Agaricus bisporus), в сравнении с эпоэтином альфа. В результате этого, биологическая активность in vitro эпоэтина бета выше, чем эпоэти-на альфа. При внутривенном введении здоровым добровольцам распределение препарата эпоэтина бета выше (16,9%) в сравнении с эпоэтином альфа (7,7%), а период полувыведения на 20% больше, в сравнении с эпоэтином альфа. При подкожном введении эпоэтина бета уровень ретикулоцитоза выше, чем при введении эпоэтина альфа. Кроме того, при подкожном введении болевые реакции на эпоэтин бета (0,08±0,06 ед) менее выражены, чем на введение эпоэтина альфа (1,75±0,19 ед). Эффективность лечения в этом исследовании, составила для препарата эпоэтина альфа 48%, для эпоэтина бета - 83% [11, 13].
Дарбэпоэтин отличается от двух предыдущих препаратов наличием двух дополнительных углеводных цепочек в N области гликозилирования (рис. 2). Увеличение структуры и молекулярной массы в препарате дарбэпоэтин позволило значительно повысить период полувыведения rHuEPO до 21 ч при внутривенном введении и до 73 ч при подкожном введении, относительно эпоэтинов альфа и бета (4-6 и 4-12 ч при внутривен-
ном введении и 24 и 13-28 ч при подкожном введении соответственно) (табл. 2).
Полимеризация гНиЕРО в препарате Мирцера, вне зависимости от пути введения, привела к повышению периода его полувыведения до 134-142 ч. При этом биодоступность препарата повышается с 20%, которая определяется у препаратов эпоэтина альфа, до 54-62% у пегилированных эпоэтинов. Данные особенности фармакокинетики позволяют при лечении пеги-лированным препаратом вводить препарат подкожно 1 раз в 2 недели, в то время как препарат эпоэтин альфа - 2 раза в неделю. Кроме того, низкое сродство поли-меризованного гНиЕРО к рецептору эритропоэтина на клетках, позволяет ему многократно активировать рецептор в течение длительного времени.
оценка качества рекомбинантных эритропоэтинов
Использование технологии рекомбинантной ДНК для изготовления лекарственных препаратов rHuEPOs не позволяет получить полную копию оригинального стандартного препарата. Поэтому препараты rHuEPOs, выпускаемые разными фирмами, имеют отличия по по-
Таблица 3. Основные показатели качества лекарственных рекомбинантных эритропоэтинов, включенные в спецификацию нормативной документации
Требования по показателям качества
Показатель Эпоэтин Эпоэтин Эпоэтин Эпоэтин Европейская
альфа бета зета тета Фармакопея
Подлинность
ВЭКЭ
Изоформа 1 - 0-4% 0-1% 0-2% 0-15%
Изоформа 2 - 5-29% 0-2% 0-2% 0-15%
Изоформа 3 1-5% 17-3б% 8-1б% 4-10% 1-20%
Изоформа 4 4-22% 21-27% 19-34% 11-20% 10-35%
Изоформа 5 23-35% 8-23% 2б-32% 22-29% 15-40%
Изоформа б 27-41% 2-17% 15-30% 27-35% 10-35%
Изоформа 7 11-30% 0-9% 5 -12% 5-12% 5-25%
Изоформа 8 0-5% 0-4% 0 -2% 0-2% 0-15%
рН б,7-7,3 7,0-7,4 7,0-7,4 б,3-б,7
Осмоляльность 225-275 мОсм/кг 2б0-300 мОсм/кг 272 - 28б мОсм/кг
Бактериальные эндотоксины Не более 10 ЕЭ/мл Не более 10 ЕЭ/мл Не более 2 ЕЭ/ 10000 МЕ Не более 20 ЕЭ/ 100000 МЕ
Белок 90-110% 90-110% 95-105% 80-120%
Содержание сиаловых
кислот
(в пересчете на Не менее 10 моль / Не менее 10,4 моль Не менее 10 моль Не менее 10 моль Не менее 10 моль
ацетилнейраминовую 1 моль /1 моль /1 моль /1 моль /1 моль
кислоту)
на 1 моль эритропоэтина
Биологическая активность 70-140% 80-125% 80-125% 80-125%
С
казателям качества, безопасности и эффективности их применения.
Наиболее подробно современные требования к оценке качества рекомбинатных эритропоэтинов изложены в общей фармакопейной статье Эритропоэтин, концентрированный раствор (Erytropoietin concentrated solution), которая была включена в Европейскую Фармакопею в 2008 г. [14]. До этого момента каждый производитель представлял собственные требования для оценки качества лекарственных препаратов рекомбинантных эпоэтинов. Поэтому в нормативных документах от разных производителей можно встретить существенные отличия по многим показателям качества (табл. 3).
Одним из основных показателей качества rHuEPOs является оценка специфической активности препарата, которая согласно Европейской фармакопеи (ЕФ), определяется по активности ретикулоцитоза у нормо-цитемических мышей при введении им испытуемого препарата в сравнении со стандартным образцом. Отсутствие до 2008 г. единых требований к качеству препаратов rHuEPOs отразилось на включении в нормативные требования к эпоэтину альфа более широкого предела допустимых значений по показателю специфической активности (70-140%) по сравнению с требованиями, введенными ЕФ (80-125%).
К характеристике подлинности, кроме определения специфической активности препарата, относится оценка качественных и количественных показателей молекулы эритропоэтина методом капиллярного зонного электрофореза. Согласно требований ЕФ, пики изоформ 1-8 на электрофореграмме исследуемого rHuEPO сравнивают с электрофореграммой стандартного образца и рассчитывают площади соответствующих пиков. Нормативные требования по показателю подлинность, оцениваемому указанным методом, для рекомбинантных эритропоэтинов, разработанных разными производителями, существенно различаются. Например, изоформы 1 и 2 отсутствуют в эпоэтине альфа, в эпоэтине бета количество изоформ 1 может достигать 4%, а изоформ 2-29%, тогда как по требованиям ЕФ количество изоформ 1 и 2 может быть не выше 15% (табл. 3).
Следующими показателями для качественной и количественной характеристики подлинности молекулы эритропоэтина являются электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг. При детектировании результатов электрофореза должна выявляться одна полоса, соответствующая по положению и интенсивности полосе стандартного образца. Аналогичные значения установлены и для результатов иммуноблоттинга. Данные методы являются достаточно чувствительными для количественной и качественной оценки молекулы rHuEPOs.
В работе А. Шнайдер [15] приведены результаты сравнительного изучения физико-химических свойств препарата Эральфон (Россия) с препаратом Eprex (США), который является признанным эталоном рекомбинантных эритропоэтинов. После удаления альбумина и концентрации исследуемых образцов при одномерном вестерн-блот анализе в препарате Eprex определялись слабые полосы в диапазоне значений между 32 и 44 кДа, в препарате Эральфон, кроме по-
лос в этом диапазоне, установлено наличие дополнительных полос в области 50 и 60 кДа. Данные иммуноблоттинга свидетельствуют, что молекулярная масса эритропоэтина в препарате Ергех находится в узком диапазоне от 40 до 45 кДа, тогда как молекулярная масса эритропоэтина в препарате Эральфон - в диапазоне от 32 до 45 кДа. Полученные автором результаты исследований свидетельствуют о более высокой степени гликозилирования эритропоэтина в препарате Ергех по сравнению с препаратом Эральфон. Установленные различия могут оказывать влияние на фармакокинетические характеристики препаратов.
Кроме указанных методов, для полной характеристики подлинности препаратов rHuEPOs должны быть включены метод пептидного картирования и анализ ^концевой последовательности. Среди зарегистрированных лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов различия по данным критериям отсутствуют.
Количественная характеристика рекомбинантных эритропоэтинов включает определение содержания белка и сиаловых кислот. Согласно спецификации, диапазон допустимых пределов содержания белка в препаратах rHuEPOs различных производителей соответствует 90-110%, т.е. указанные требования более высокие по сравнению с требованиями ЕФ - 80120%. Количественное содержание сиаловых кислот (в пересчете на ацетилнейраминовую кислоту) на 1 моль эритропоэтина, регламентируемое нормативной документацией всех анализируемых препаратов 10-10,4 моль/1 моль, требования ЕФ - не менее 10 моль/1 моль.
Кроме различий между требованиями по показателям качества rHuEPOs, включенными в спецификацию нормативных документов на препараты разных производителей и которые включены в ЕФ, имеются различия между показателями, которые не регламентированы ЕФ. Например, при более высоком значении рН 7,0-7,4 в препарате эпоэтина зета, значения осмоляль-ности выше и находятся в пределах 260-300 мОсм/кг, относительно препарата эпоэтина альфа (6,7-7,3 и 225-275 мОсм/кг) и эпоэтина тета (6,3-6,7 и 272-286 мОсм/кг).
Кроме указанных в ЕФ показателей качества rHuEPOs, необходимо учитывать, что все белковые рекомбинантные препараты очень чувствительны к составу вспомогательных веществ, от которых зависит стабильность многомерной структуры белковой молекулы препарата.
Для поддержания стабильности молекул гНиЕРО в готовом препарате используется несколько подходов. Первые зарубежные препараты выпускались с использованием набора аминокислот и альбумина в качестве стабилизатора, затем альбумин был заменен на полисорбат с глицином. Известны два основных состава вспомогательных веществ для рекомбинанатных эритропоэтинов. В одном случае используется набор аминокислот, мочевины, кальция хлорида и небольшие количества полисорбата-20 в нейтральном растворе фосфатного буфера. Второй состав базируется на большом количестве полисорбата-80 и глицина в нейтральном растворе фосфатного буфера. В обоих случаях изотоничность раствора достигается за счет
( Обзор Review ),
Review
добавления натрия хлорида. В отечественных препаратах в качестве стабилизатора используется альбумин человека.
О важности требований к составу вспомогательных веществ, качеству первичной упаковки и условиям хранения биотехнологических препаратов свидетельствуют сообщения о серьезных нежелательных явлениях в случае их нарушения или недостаточного обоснования для использования. Так, в препарате Eprex (компании Johnson& Johnson) в качестве стабилизатора изначально был использован альбумин сыворотки крови человека. Для снижения риска передачи с альбумином возбудителей вирусных инфекций, а также возбудителей прионовых энцефалопатий человека, включая болезнь Крейцфельдта-Якоба, в 1998 г альбумин был заменен на полисорбат-80 и глицин. При этом среди больных, получавших препарат Eprex, участились случаи развития парциальной красноклеточной аплазии (ПККА) -около 250 случаев за 3 года. Расследование причин ПККА показало, что развитие аплазии связано с одной серией препарата Eprex, в котором альбумин был заменен на полисорбат-80, препарат был расфасован в шприцы с резиновыми поршнями, которые были не покрыты защитным составом. Предполагается, что контакт полисорбата-80 с латексом вызывал выщелачивание последнего, появление латекса в растворе препарата инициировало более интенсивное проявление иммуногенности препарата и как следствие развитие ПККА [5].
Таким образом, гарантия качества лекарственных препаратов рекомбинатных эритропоэтинов, как и других биотехнологических препаратов, должна обеспечиваться валидацией основных этапов производственного процесса, контролем качества промежуточных продуктов в процессе производства, контролем готовой лекарственной формы препарата, а также адекватностью используемых аналитических методов контроля, их валидацией, указанным набором оцениваемых показателей качества, включенных в спецификацию.
Литература
1. Krantz S.B. Eerythropoietin //Blood. 1991. V. 77(3). P. 419-434.
2. Storring P.L., Gaines Das R.E. The International Standard for recombinant DNA-derived erythropoietins and two higly purified human urinary erythropoietins // J. Endocrinology. 1992. V. 134(3). P. 459-484.
3. ImaiN., KawamuraA., HiguchiM. etal. Physicochemical and biological comparison of recombinant human
erythropoietin with human urinary erythropoietin // J. Biochem. 1990. V. 107(3). P. 352-359.
4. Sasaki H., Bothner B., Dell A., Fukuda M. Carbohydrate structure of erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells by a human erythropoietin c DNA // J. Biol. Chem. 1987. V. 262(25). P. 12059-12076.
5. Locatelli F., Pozzoni P., Del Vecchio L. Recombinant human epoetin beta in the treatment of renal anemia // Therapeutics and Clinical Risk Management. 2007. V. 3 (3). P. 433-439.
6. Macdougall I.C. Novel erythropoiesis-stimulating agents: a new era in anemia management // Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2008. V. 3. P. 200-207.
7. Бабичева Л.Г., Поддубная И.В. Лечение анемии в онкологии: роль нового стимулятора эритропоэза Аранесп (дарбэпоэтин альфа) // Современная онкология. 2007. № 3. Т. 9. С. 69-74.
8. Dordal M.S. Wang F.F. Goldwasser E. The role of carbohydrate in erythropoietin action//Endocrinology. 1985. V. 116. P. 2293-2299.
9. Lin F.-K., Suggs S., Lin C.-H. et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 7580-7584.
10. Goldsmith D. 2009: A Requiem for rHuEPOs—but should we nail down the coffin in 2010?// Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2010. V. 5. P. 929-935.
11. Storring P.L., Tiplady R.J., Gaines Das R.E. et al. Lectin-binding assays for the isoforms of human erythropoietin: comparison of urinary and four recombinant erythropoietins // J. Endocrinol. 1996. V. 150. P. 401-412.
12. Takeuchi M., Kobata A. Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins // Glycobiology 1991. V. 1(4). P. 337-346.
13. Yuen C.T., Storring P.L., Tiplady R.J. et al. Relationships between the N-glycan structures and biological activities of recombinant human erythropoietins producedusing different culture conditions and purification procedures // Br. J. Haematol. 2003. V. 121. P. 511-526.
14. European Parmacopoeia 7.0 «Erythropoietin Concentrated Solution». 2008. P. 1946-1950.
15. Шнайдер А. Сопоставление распределения изоформ фармацевтических препаратов эритро-поэтина с использованием двумерного гель-электрофореза // Клиническая нефрология. 2010. Т. 2. С. 50-53.
