CC BY
9
УДК 636.52/612:015.31:015.32
Бугай А.О., кандидат ветеринарних наук © andbugay@ua. fm Днтропетровський державный аграрный утверситет
ОТРИМАННЯ АП1КАЛЬНИХ ТА БАЗОЛАТЕРАЛЬНИХ МЕМБРАН АБСОРБЦ1ЙНИХ ЕНТЕРОЦИТ1В ПОРОЖНЬО1 КИШКИ КУРЧАТ-БРОЙЛЕР1В ДЛЯ ВИВЧЕННЯ ТРАНСПОРТНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
ПЛАЗМОЛЕМИ
Модифжовано методику для видыення в одтй процедурi аткальних та базолатеральних мембран абсорбцшних клтин порожньог кишки курчат-бройлерiв. Використання щег методики дозволяе отримувати очищет мембранш препарати та вивчати гх транспорты властивостi.
Ключовi слова: курчата-бройлери, абсорбцтт ентероцити, плазмолема, транспортш властивостi.
Вступ. Фундаментальну шформацш про мехашзми транспортних процеЫв в еттели порожньо! кишки можливо отримати в експериментах in vitro з використанням фрагмента нативного кишечнику, л^ованих кишкових сегмента, iзольованих ентероцита тощо [4, 6 - 8]. Проте можливост вказаних технологш обмежеш впливом метаболiчних та регуляторних процеЫв в ентероцитах та сукупшстю тканин, внаслiдок чого отримаш данi можуть бути викривленими i не враховувати ряд факторiв, яю впливають на транспортнi процеси [1, 8]. Саме тому використання везикульованих препарата аткальних (АМ) та базолатеральних (БМ) мембран ентероцита дае можливкть окремо вивчати транспортш процеси та !х особливостю за впливу певних речовин.
В лiтературних джерелах [3, 5, 6] висвгаено ряд методик для отримання фракцш плазмолеми ентероцита порожньо! кишки курей. Проте вш вони передбачають видiлення або АМ, або БМ з одше! проби матерiалу, яким е зiскрiб чи загальна фракцiя ентероцитiв зi слизово! оболонки кишки.
Тому, метою ще! роботи було розробити методику видшення в однiй процедурi аткально! та базолатерально! фракцiй плазмолеми абсорбцiйних ентероцита кл^ин порожньо! кишки курчат-бройлерiв, здатних до транспортних процеЫв.
Матер1али та методи. Дослiдження проводились на кафедрi фiзiологi!' та бiохiмi! сiльськогосподарських тварин i у вiварi! Днiпропетровського державного аграрного ушверситету у травнi 2009 р.
Об'ектом дослщження були курчата-бройлери кросу "Конкурент-3" 14-добового вжу, якi утримувались у клiтках з добового вжу на збалансованому за вама показниками рацiонi, що змшювався згiдно технологiчного графiку. Евтаназiю курчат проводили шляхом декаттаци, вранцi, без попереднього голодування. Шсля цього видаляли порожню кишку, промивали !!
© Бугай А.О., 2009
21
фiзiологiчним розчином (NaQ-HEPES, рН 7,4) для видалення вмкту. Для видшення ентероцитсв порожню кишку вщдшяли вiд брижi, визначали И загальну довжину, знаходили середину, вщ яко1 вiдмiряли рiвновiддаленi точки у крашальному та каудальному напрямах та вiдрiзали дiлянку кишки. При цьому довжина кишки складала третину вщ загально!. Отриману дiлянку кишки розрiзали на фрагменти по 2 - 3 см та розтинали вздовж. Пщготовлеш вiдрiзки порожньо! кишки шкубували 90 хв в розчинi такого складу (мМ): NaCl - 80; КН2Р04 - 3; трiс-HCl - 20; маншт - 37; ЕГТО - 0,1; натрш цитрат - 27; сироватковий альбумш - 1 мг/мл, при 370С , рН 7,4. Шсля завершення шкубацп iзольованi кл^ини iз середовища осаджували центрифугуванням впродовж 3 хв при 500 g iз дворазовим промиванням розчином шкубаци.
Суспензiю iзольованих абсорбцiйних клiтин гомогешзували за допомогою ножового гомогенiзатора MPW-302 (Польща) при швидкостi обертання ножа 9,5 тис. об/хв впродовж 30 с у середовищi складом (мМ): 100 маннгг, 2 HEPES-трiс, рН = 7,1 [3, 6]. Сшввщношення об'ем середовища/маса суспензи клiтин складала 100/15 [1, 8]. Стутнь гомогешзаци контролювали за допомогою свгшово1 мжроскопи у мазках забарвлених за Романовським-Пмза, при збiльшеннi у 1000 разiв. Критерieм якостi гомогешзаци були: наявшсть незруйнованих клiтин (недостатня гомогенiзацiя) чи вщсутшсть вираженого осаду при центрифугуванш (10 тис.g) гомогенату (надмiрна гомогешзащя).
Отримання ашкально1 та базолатерально! фракцш плазмолеми абсорбцiйних ентероцитiв здiйснювали шляхом диференцшного центрифугування. Осади мембранних фракцш ресуспендували в розчинi такого складу (мМ): 300 маннiт, 20 HEPES-трiс, 0,1 MgSO4, рН = 7,4 [3, 5, 6].
Пошук оптимальних параметрiв центрифугування визначали за ступенем очистки мембранних препарата, що проводили шляхом вимiрювання активностi маркерних ферменив: лужно1 фосфатази (ЛФ) (за Кшгсом-Армстронгом), сахарази (Сах) (за Далквктом) та Na+,K+-АТРази (за Болдиревим). Вмкт бiлка визначали за Лоурi. Орieнтацiю мембранних везикул визначали за [4], штактшсть та збереження транспортних властивостей АМ та БМ визначали за поглинанням глюкози №-залежним та №-незалежним механiзмом.
Статистичну обробку результатiв проводили з використанням програми Ехсе1 - 97.
Результати дослщження. Проведенi дослiдження вказують на доцiльнiсть видiлення в однш процедурi АМ та БМ абсорбцшних ентероцитiв курчат-бройлерiв з огляду на достатню ступiнь очистки мембранних фракцш та збереження !х транспортних властивостей.
Описаний в л^ературних джерелах методичний пщхщ для отримання АМ або БМ ентероциив курей базуеться на Mg2+-прецшiтацil [1, 4 - 7]. Сутшсть ще1 процедури полягае у прециштаци та осадженнi за невеликих значень вщносного центрифужного поля субкл^инних органел (мiтохондрiй, лiзосом, ендоплазматично1 сiтки) та БМ. Надалi осаджуються з очищеного вiд них супернатанта АМ. Для отримання БМ використовують багаторазову
22
очистку сумарного прециттату вщ субкл^инних органел. Таю методики дозволяють отримувати очищеш фракци плазмолеми ентероциив зi збереженням транспортних властивостей. Проте вони е досить трудомюткими та тривалими, особливо при отриманш БМ, внаслiдок очищення !х вщ субклiтинних органел.
Тому для оптимiзацil схеми отримання АМ та БМ абсорбцшних ентероцитiв курчат-бройлерiв, ми вважаемо доцшьним видiлити з гомогенату субкл^инш органели, отримати АМ, а поим i БМ, за допомогою магшево! прещштаще!.
Таким чином, ми порiвняли ефективнiсть традицiйних методик видiлення фракцш плазмолеми ентероцитiв порожньо! кишки курей [5, 6] iз запропонованою нами в однш процедурi за таких умов:
- центрифугування гомогенату при 10 тис^ упродовж 15 хв з метою осадження субкл^инних органел та грубих мембранних фракцш;
- ентрифугування отриманого супернатанту при 30 тис. g впродовж 30 хв. з отриманням в осадi АМ. Супернатант використовуеться для видшення БМ;
- отримання БМ: до супернатанту додають розчин магнш хлориду до кшцево! концентраци 10 мМ, витримують 30 хв на холодi (40С) при перемiшуваннi. Надалi суспензiю центрифугують при 30 тис. g., ппродовж 30 хв. з отриманням в осадi БМ.
Так, стутнь очистки АМ, отриманих за традицшною схемою, за актившстю ЛФ склав 8,7 рази, а за актившсю Сах - 11,0 (табл. 1).
Таблиця 1.
Актившсть маркерних фермент1в (нмоль/мг*с) та ступ1нь очистки (раз1в) АМ абсорбцшних ентероцит1в порожньо!" кишки курчат бройлер1в,
М±т, п=6.
Показник Гомогенат АМ, традицшна схема АМ, модифжована схема
актившсть, нмоль/мг*с стутнь очистки, раз1в актившсть, нмоль/мг*с стутнь очистки, раз1в
Лужна фосфатаза, нмоль/мг*с 2,29± 0,03 19,88± 0,36 8,7 21,33± 0,63* 9,3*
Сахараза, нмоль/мг*с 1,57± 0,01 17,23± 0,19 11,0 16,87± 0,11 10,8
Na+,K+-АТФаза, нмоль/мг*с 0,14± 0,01 0,16± 0,01 1,2 0,13± 0,01* 0,9*
Примггка: *- даш в1ропдш (Р<0,05) у пор1внянш з традицшною схемою.
Отриманi даш вказують на досить ефективне видшення АМ з гомогенату. При цьому абсолютш показники активност цих гщролаз АМ е бшьшими за описаними в лiтературi на 15 - 25% [5, 6]. Цей факт ми пояснюемо використанням в якост в наших дослщженнях матерiалу для видшення
23
плазмoлеми абсopбцiйниx ентеpoцитiв, а не загадь^!' фpакцiï ештелюцитав абo зiскpiбу з1 слизoвoï oбoлoнки пopoжньoï кишки.
Сл1д вказати на певне забpуднення AM абсopбцiйниx ентеpoцитiв пpепаpатами БM, oскiльки за викopистання тpадицiйнoï сxеми вщзначаеться збагачення аикань^го макpoдoмену базoлатеpальним за пoказникoм активист Na+,K+-ATФази в 1,2 pази. Ймoвipнo, це зумoвленo пеpеxpеснoю пpеципiтацieю магнieм AM та БM.
Отpимання AM за мoдифiкoванoю нами сxемoю пiдвищилo на 7% (Р<0,05) ступiнь oчистки мембpанниx пpепаpатiв за активнiстю ЛФ та знизилo на 25% (Р<0,05) забpудненiсть AM пpепаpатами БM за даними активист Na+,K+-ATФази (див. табл. 1). A^ramc^ Cаx вipoгiднo не вiдpiзняeться мiж дoслiдними сxемами.
Отже, викopистання мoдифiкoванoï сxеми для oтpимання AM абсopбцiйниx ентеpoцитiв куpчат-бpoйлеpiв пpизвoдить дo меншoгo забpуднення цieï фpакцiï, щo зумoвленo пoпеpеднiм видаленням з гoмoгенату субклiтинниx opганел та гpубиx мембpанниx фpакцiй, а такoж вiдсутнiстю Mg2+-пpецiпiтацiï на стадiï видiлення AM абсopбцiйниx клiтин.
Пpи аналiзi пoказникiв активист феpментiв БM абсopбцiйниx ентеpoцитiв, oтpиманиx за тpадицiйнoю та мoдифiкoванoю сxемoю, слiд вiдмiтити значну ступiнь oчистки цieï мембpаннoï фpакцiï за актившстю ЛФ - у 5,0 та 5,2 pази, вiдпoвiднo (табл. 2). На нашу думку, даний факт зумoвлений не забpудненням БM аткальними мембpанами, а значним «том^^вим» включенням ЛФ в БM ентеpoцитiв в пpoцесiв ïx генезу [2]. ^му ми вважаeмo недoцiльним викopистoвувати токазники активнoстi ЛФ плазмoлеми ентеpoцитiв пopoжньoï кишки куpей для oцiнки oчистки ïï фpакцiй.
Таблиця 2.
Актившсть мapкepниx фepмeнтiв (нмоль/мг*с) та стушнь очистки (pa^ie) БМ aбсоpбцiйниx e^ei^m^s поpожньоï кишки куpчaт бpойлepiв,
M±m, n=6.
Пoказник Гoмoгенат БЫ, тpадицiйна сxема EM, мoдифiкoвана сxема
актившсть, нмoль/мгхс стушнь oчистки, pазiв актившсть, нмoль/мгхс стушнь oчистки, pазiв
Лужна фoсфатаза, нмoль/мгхс 2,29± 0,03 11,73± 0,08 5,0 11,88± 0,47 5,2
Cаxаpаза, нмoль/мгхс 1,57± 0,01 1,41± 0,03 0,9 1,20± 0,05* 0,77*
Na+,K+-ATФаза, нмoль/мгхс 0,14± 0,01 1,40± 0,02 10,1 1,57± 0,03* 11,4*
Пpимiтка: *- даш вipoгiднi (Р<0,05) у пopiвняннi з тpадицiйнoю сxемoю.
Фpакцioнування плазмoлеми абсopбцiйниx ентеpoцитiв за мoдифiкoванoю сxемoю e бшьш ефективним, oскiльки за умoв пoпеpедньoгo
24
видшення АМ зменшуеться забруднення БМ цим макродоменом. Так, стутнь очистки БМ при використанш модифжовано! схеми за показниками активносп №+,К+-АТФази е бшьшим на 11% (Р<0,05). А ступiнь забруднення ще! мембранно! фракци за показниками активности Сах, е меншим на 17%, (Р<0,05) порiвняно з традицiйною схемою.
Важливою характеристикою мембранних везикул, яка використовуеться для дослщження транспортних властивостей, е !х орiентацiя та штакттсть. Так, при порiвняннi традицшно! i модифжовано! схем отримання фракцiй плазмолеми абсорбцшних клiтин, не встановлено вiрогiдноl рiзницi щодо частки правильно орiентованих везикул. Цей показник е досить високим i складае 89-90% - для АМ та 85-86% - для БМ (табл. 3).
Таблиця 3.
Частка правильно ор^нтованих везикульованих препарат1в АМ та БМ
абсорбцiйних ентероцитв порожньо'! кишки курчат бройлер1в, M±m, n=6.
Методика АМ БМ
Традицшна схема 88,9±0,5 85,1±1,1
Модифжована схема 89,8±0,4 86,4±0,9
Пiдтвердженням штактноси та збереження транспортних властивостей АМ i БМ абсорбцiйних ентероцитiв порожньо! кишки курчат-бройлерiв, е поглинання глюкози. Так, везикульоват препарати АМ, якi були отримат за допомогою рiзних схем, поглинали глюкозу лише за Na-залежним механiзмом з iнгiбуванням цього процесу iонами К+. В той же час, поглинання глюкози везикульованими препарати БМ вщбувалось в рiвнiй мiрi як при використаннi iонiв Na+, так i К+.
Висновки. Модифжовано схему отримання в однiй процедурi апiкальних та базолатеральних мембран абсорбцшних ентероцита порожньо! кишки курчат-бройлерiв. Використання модифжовано! схеми дозволяе зменшити стутнь перехресного забруднення мембранних препарата на 11-25% та отримувати штактт фракци плазмолеми з високою часткою правильно орiентованих везикул, що дозволяе вивчати !х транспортнi властивостi.
Лiтература.
1. Усатюк, П. Отримання апiкальних та базолатеральних мембран ештелш тонкого кишечника. Методичш аспекти / П. Усатюк, Д. Мельничук // Укр. бюхш. журн. - 1995. - Т. 67, № 5. - С. 16 - 24.
2. Bivic A., Quaroni A., Nichols B. et al. Biogenetic pathways of plasma membrane proteins Caco-2, a human intestinal epithelial cell line // J. Cell Biol. - 1990. - V. 111 (4). - P. 1351-1361.
3. Coleto, R. Taurocholate transport by brush border membrane vesicles from different regions of chicken intestine / R.Coleto, J.Bolufer, C. Vazquez // Poultry Science - 1998. - V. 77. - P. 594-599.
4. Del Castillo, J. The simultaneous preparation of basolateral and brush border membrane vesicles from guinea pig intestinal epithelium and the orientation
25
HayKoeuù eicnuK ÏÏHYBMET iMeni C.3. f^uцbкого
Tom 11 № 3(42) Hacmuna 2, 2009
of the basolateral vesicles / J. Del Castillo, W. Robinson // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - V. 688. - P. 45-46.
5. Garriga, C. Hexose transport across the basolateral membrane of the chicken jejunum / C. Garriga, M. Moreto, J. Planas //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 1997. - V. 272, (4) - P. 1330-1335.
6. Vazquez, C. Developmental changes in glucose transport, lipid composition, and fluidity of jejunal BBM / C.Vazquez, N. Rovira, V. Ruiz-Gutierrez et al // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 1997. - V. 273. - P. 10861093.
7. Wilson, J. Simultaneous isolation and characterization of brush border and basolateral membrane vesicles from bovine small intestine / J.Wilson, K. Webb //J. Anim. Sci. - 1990. - V. 68. - P. 583-590.
8. Wright, E. Sugar uptake by intestinal basolateral membrane vesicles / E. Wright, C. Os, A. Mircheft // Biochim. Biophys. Acta. - 1980. - V. 597 (1). -P. 112-124.
Summary Bugay А.O.
Dnipropetrovs 'k State Agricultural University, Dnipropetrovs 'k, Ukraine PREPARATION OF APICAL AND BASOLATERAL MEMBRANE VESICLES OF BROILER CHICKEN JEJUNUM ABSORPTIVE CELLS FOR RESEARCHES OF THEM TRANSPORT FEATURES
The method for simultaneous preparation apical and basolateral membrane vesicles of broiler chicken jejunum absorptive cells was modified. This scheme using allow to obtain purified membranes fractions and to research them transport features.
Key words: broiler chicken, absorptive cells, plasma membrane, transport
features.
Cmammx nadiumna do peda^ii 22.09.2009
26
