CC BY
102
УДК 577.21:577.3
ПРЕДСКАЗАНИЕ ПОЛЕЗНЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ РОДА ТШСНОБЕШЛ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
© Л.Л. Фролова, Г.Дж. Бамптон
Ключевые слова: грибы рода Trichoderma; база данных нуклеотидных последовательностей ОепЪапк; мультиген-ный филогенетический анализ; парное выравнивание нуклеотидных последовательностей.
В настоящее время из большого количества известных грибов рода Trichoderma используются в биотехнологии лишь 10 % видов, чьи полезные свойства подтверждены экспериментально. В то же время, остальные виды могут иметь те же полезные свойства и использоваться в тех же целях. В данной работе впервые сделана попытка предсказать полезные симбиотические свойства неиспользуемых в биотехнологии грибов рода Trichoderma на основе филогенетического анализа нескольких известных генов данного рода в БД ОепЪапк и анализа парного выравнивания нуклеотидных последовательностей.
ВВЕДЕНИЕ
Полезные свойства универсальных грибов рода 1т(-choderma активно используются во многих сферах человеческой деятельности. Например, в водной среде они используются для укоренения черенков растений или для очистки загрязненных водоемов [1]. В почве грибы Trichoderma активно разлагают целлюлозу и другие органические остатки, и тем самым повышают плодородие почв, а также уничтожают покоящиеся или зимующие стадии болезнетворных микроорганизмов. Грибы рода Trichoderma являются антагонистами многих фитопатогенных грибов. Они защищают овощные культуры от серой и белой гнилей, черной ножки и фузариозного увядания [2]. В медицине белок Ь-лизин-а-оксидазы, выделенный из Trichoderma, может служить ингибитором вируса СПИДа [3].
В настоящее время только 10 % из известных видов грибов рода Trichoderma используются в биотехнологии, например:
- Целлюлаза с использованием Trichoderma har-zianum применяется в производстве хлопчатобумажной ткани. T. reesii используется для производства целлю-лаз и гемицеллюлаз, T. longibratum и T. harzianum используются для массового культивирования ферментов ксиланаз и хитиназ соответственно [4].
- Некоторые виды грибов Trichoderma используются как агенты биологического регулирования грибковых болезней растений. Большинство из них - разновидности видов T. harzianum и T. hamatum - растут, например, на поверхности корней [5].
- Способность грибов увеличивать скорость роста и развития растения, активизировать процессы появления новых и оздоровления старых корней известна уже много лет. Так, исследования показывают, что зерновые культуры, корни которых колонизированы ^^0-derma harzianum ^22, требуют приблизительно на 40 % меньше азотного удобрения. Некоторые клонированные гены Trichoderma spp. могут быть использованы в
качестве трансгенных для селекционирования зерновых культур, устойчивых к болезням растений [5].
- Штамм Trichoderma harzianum Rifai - продуцент антиопухолевого фермента L-лизин-a-оксидазы способен ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека даже при очень низких концентрациях. Белок, выделенный из Trichoderma harzianum Rifai, ингибирует как репродукцию вируса иммунодефицита человека, так и синтез вирусных антигенов [б, 7].
В данной работе авторами впервые сделана попытка предсказать полезные симбиотические свойства неиспользуемых в биотехнологии грибов рода Trichoderma на основе молекулярного филогенетического анализа нескольких известных генов данного рода в БД Genbank и анализа парного выравнивания нуклеотидных последовательностей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы нуклеотидные последовательности 52 видов грибов рода Trichoderma из БД GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) (табл. 1).
Множественное и парное выравнивание проведено с помощью on-line программ ClustalW (http://align.genome. jp/clustalw/) и Pairwise (http://www.ebi.ac.uk/Tools /emboss/align/index.html).
Филогенетические деревья по нуклеотидным последовательностям 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК; tef1a; и ITS1, 5.8S рРНК, ITS2 разных видов рода Trichoderma построены с помощью пакета программ Phylip (http://evolution.gs.washington.edu/phy-lip.html) методом максимальной экономии. Результаты представлены для 100 повторов множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей между собой. Числа выражают вероятности (в %) появления групп видов в бутстреп-анализе. Цветом выделены кластеры, содержащие используемые виды рода Trichoderma.
Таблица 1
Молекулярный банк данных грибов рода Trichoderma
Гены / Уникальный номер
Вид l8S pPHK, ITSl, 5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK tefla ITSl, 5.8S pPHK, ITS2
T. aggressivum AY605757 AF348094 AF456924
T. asperellum FJ884746 AY376058 AY857217
T. atroviride EU595035 AF348112 AY857204
T. aureoviride AF501326 AY956322 AF191039
T. austrokoningii DQ315468 DQ307569 DQ333546
T. cerinum FJ412107 AY937443 нет
T. citrinoviride FJ824645 AY937422 EU186410
T. crassum EU280085 AY750892 AF414315
T. cremeum AY737760 AY737736 нет
T. croceum DQ083026 AY750879 AF400259
T. effusum DQ083008 AY937419 AF149858
T. erinaceum EU280130 AY750880 DQ109534
T. fasciculatum DQ087258 AY750895 AF414327
T. fertile DQ083018 AY750881 AF414347
T. flavofuscum EU330955 AF401020 AF414340
T. gelatinosum DQ087258 AY737740 AF275329
T. ghanense EU280100 AY937423 AF414346
T. hamatum EU595036 AY750893 AM498484
T. harzianum AB282752 AF348100 AM498496
T. harzianum Rifai FJ884179 AF348090 AM498495
T. helicum FJ412082 AY937416 нет
T. inhamatum FJ442680 DQ205217 AJ849897
T. konilangbra DQ083021 AY937425 AF414334
T. koningii FJ610294 AY376045 DQ109536
T. lacteum DQ000623 AF401027 AF414325
T. longibrachia-tum EU595034 AY937412 AY857241
T. minutisporum AY865634 AY750883 AF414318
T. nigrovirens AY737777 AY737744 нет
T. oblongisporum FJ623268 AY750884 AF414319
T. ovalisporum FJ442652 AY3 87660 AY380896
T. pachybasioides DQ112552 AY750885 AM498499
T. piluliferum EU520051 AY737747 нет
T. polysporum DQ914690 AY750885 FJ861394
T. pseudokoningii EU280097 AY937429 AF140046
T. pubescens EU280121 AY750887 AF414320
T. reesei FJ545237 DQ025754 AY857243
T. roseum EF589898 DQ676623 EU729713
T. rossicum EU280089 AY937441 DQ345901
T. saturnisporum Z48726 AY937414 AF048744
T. sinensis DQ083012 AY750888 нет
T. spirale FJ861463 AY750896 AY857245
T. strigosum FJ442649 AY376057 DQ109531
T. stromaticum DQ083013 AY937418 AY856839
T. tawa AY737756 AY737739 AF400258
T. tomentosum AY605719 AY750882 EU871024
T. velutinum DQ083010 AY937415 FJ861466
T. virens AB257271 AY750894 AY857233
T. viride FJ824646 AY376052 DQ132819
T. viridescens EU280137 EU871009 EU871022
Trichoderma sp. AY154934 AY857281 FJ861460
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
І. Мультигенный филогенетический анализ. В настоящее время идентификация видов Trichoderma проводится на основе нескольких генов, так как использование одного гена недостаточно для их определения. Большинство видов Trichoderma представлены в международной базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank последовательностями 18S pPHK,
5.8S pPHK, внутренних транскрибируемых спейсеров ITS и ITS2, начального фрагмента гена 28S pPHK, включающего вариабельные регионы D1 и D2 и гена tefla.
В целом ITS регион является высоко видоспецифичным. Поскольку ген tefla более изменчивый, чем ITS, то он лучше отражает различия внутри и между группами тесно связанных видов [8].
Ген l8S pPHK эволюционирует относительно медленно по сравнению с геном ITS, и более подходит для нахождения консенсусных консервативных регионов среди грибов на уровне рода и вида [9, 10].
Можно предположить, что комбинированный мультигенный филогенетический анализ позволит выявить наиболее близкие в эволюционном отношении виды рода Trichoderma с наибольшей степенью совпадения их функциональных возможностей.
1.1. Филогенетический анализ по нуклеотидной последовательности !8S рРНК, П^І, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидной последовательности 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК для 49 видов рода Trichoderma, представлено на рис. 1.
Анализ филогенетического дерева по последовательности l8S pPHK, ITSl, 5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK, приведенного на рис. 1, показал наличие 7 кластеров, включающих используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами (табл. 2).
1.2. Филогенетический анализ по гену tefla. Филогенетическое дерево, построенное по гену tefla для 48 видов Trichoderma, представлено на рис. 2.
Анализ филогенетического дерева по гену tefla, приведенного на рис. 2, показал наличие 5 кластеров, содержащих используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами (табл. 3).
1.3. Филогенетический анализ по нуклеотидной последовательности ITS!, 5.8S рРНК, ITS2. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидной последовательности ITSl, 5.8S pPHK, ITS2 для 41 вида рода Trichoderma, представлено на рис. 3.
Анализ филогенетического дерева по последовательности ITSl, 5.8S pPHK, TS2, приведенного на рис. 3, показал наличие 5 кластеров, включающих используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами (табл. 4).
З. Комбинированный мультигенный филогенетический анализ. В табл. 5 приведены результаты сравнительного анализа кластеров трех филогенетических деревьев, хотя бы два из которых содержат используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами.
Рис. І. Консенсусное филогенетическое дерево по нуклеотидной последовательности l8S pPHK, ITSl, 5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK
Т.Иагаапшп Т.Иагаапит Rifai
-----Тл/е1иНпит
78
97
43
100
48
. Т.ЬеНсит
46
96
100
Т.риЬвзсепз ____Т.а1гсмпс)е
47
,ТпНтНаппя сп
37
37,
100
-Т.у1пс1е
-Т.д1аисит
34
53
■дд-Т.аизиокоптам Т^пдозит ■Т. азрегеПит -Т.ИатаШт
73
39
70
34.
42
“^■Т.оуаНзрогит
Т.коп1пд11 Т.дИапепзе
—------Т.сИппсмпс1е
~Н Ю0 Т.р$еис1окогнпди
——Т.з1пепэ15 ——Т.копНапдЬга
100
'Т.за^ггнзрогит
63
Н 90 т „
1—Т.еАшит
■ Т.1опа1ЬгасЬ1а1ит
■ Т.гееэе!
100
96
----Т^рНиИГогит
60
■ т.гааёит
Т.оЬ1опд15рошт
100
82
Т.сгосеит
T.pachybasioides Т.ро1у®Рогит
100
100
100
. т. зггоптатпижг
-Тгоэзкит
-Т.тИатаШт
-Т.ттиизрогит
39
Т.тдгсмгвпз
■ Т.сгетеит
■ Т.аигесмпс1е
97
-Т.зр1га1е
37
95
57
Т.деЫтозит
Т.у1гепз
100
100
■ Т.ЛауоГи$сит
■ Т.сгаззит
-Пор"
-Т.Газс1си1а1ит ■ Т.Ге|1Пе
Т.ЬтепЬзит
Тхегкннп
\
100
Рис. 2. Консенсусное филогенетическое дерево по гену Хе/1 а
Рис. 3. Консенсусное филогенетическое дерево по нуклеотидной последовательности П.'31, 5.83 рРНК, П.'32
Таблица 2
Кластеры, содержащие используемые с неиспользуемыми видами рода Trichoderma
- вид Т. геезег имеет максимальную степень идентичности - 98,0 и 95,0 % с видом Т. ghanense соответственно по генам 183 рРНК, 1Т31, 5.83 рРНК, 1Т32, 283 рРНК и 1Т31, 5.83 рРНК, 1Т32;
Клас- тер Используемые виды Неиспользуемые виды, вошедшие в один кластер / подкластер с используемыми видами Бутст- реп- под- держка (%)
1. T. harzianum Rifai T. aureoviride 47
T. inhamatum 47
T. piluliferum 54
2. T. aggressi-vum T. tawa 42
3. T. longibra-chiatum T. konilangbra 100
T. sinensis 45
4. T. reesei T. ghanense 56
5. T. harzianum T. gelatinosum 41
T. nigrovirens 41
T. roseum 99
б. T. pachyba-sioides T. minutisporum 94
7. T. viride T. koningii 100
Таблица 3
Кластеры, содержащие используемые с неиспользуемыми видами рода Trichoderma
Таблица 4
Кластеры, содержащие используемые с неиспользуемыми видами рода Trichoderma
Клас- тер Используемые виды Неиспользуемые виды, вошедшие в один кластер I подкластер с используемыми видами Бутст- реп- под- держка (%)
1. T. reesei T. ghanense 78
T. polysporum 82
2. T. longibra- T. konilangbra 57
chiatum T. pseudokoningii 53
T. saturnisporum 57
3. T. harzianum T. velutinum 33
Rifai T. tomentosum 32
4. T. harzianum T. inhamatum 40
Trichoderma sp. 40
5. T. Pachyba- T. croceum 61
sioides T. oblongisporum 87
Таблица 5
Клас- тер Используемые виды Неиспользуемые виды, вошедшие в один кла-стер/подкластер с используемыми видами Бутст- реп- под- держка (%)
1. T. viride T. glaucum 100
2. T. hamatum T. austrokoningii 53
T. asperellum 73
T. strigosum 53
3. T. longibra-chiatum T. ressei 100
T. effusum 63
T. saturnisporum 63
4. T. pachyba-sioides T. croceum 100
T. inhamatum 82
T. minutisporum 82
T. polysporum 100
5. T. aggressivum T. tawa 56
Сравнительный анализ кластеров филогенетических деревьев по генам 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК; tefla и ITS1,5.8S рРНК, ITS, содержащих используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами, и парное выравнивание нуклеотидных последовательностей показали:
- вид T. aggressivum имеет максимальную степень идентичности - 96,1 и 90,2 % с видом T. tawa соответственно по генам 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК и tef1 a;
Сравнительный анализ кластеров по генам
Гены, виды Макс. идентичность организмов в % / __________бутстреп-поддержка в %_________
l8SpPHK, ITSl,
5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK
tefla
ITSl,5.8S pPHK, ITS2
T. aggressivum
(ингибирование роста коммерчески выращиваемых грибов, например Agaricus bisporus)
T. tawa 9б,1 I 42 T. tawa 90,2 I 56 нет
T. reesei (массовое культивирование ферментов целлюлаз и гемицеллюлаз)
T. ghanense 98,0 I 55 нет T. ghanense 95,0 I 78
T. longibrachiatum (массовое культивирование ферментов ксиланаз)
T. konilangbra 99,0 I 100 нет T. konilangbra 98,3 I 57
нет T. saturnisporum 78,4 I 63 T. saturnisporum 98,5 I 57
T. Pachybasioides (биоконтроль над болезнями растений)
нет T. croceum 97,8 I 100 T. croceum 97,3 I 61
T. minutisporum 96,5 I 94 T. minutisporum 80,б I 82 нет
- вид T. longibrachiatum имеет максимальную степень идентичности - 99,0 и 98,3 % с видом T. konilang-bra соответственно по генам l8S pPHK, ITSl, 5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK и ITSl, 5.8S pPHK, ITS2; 78,4 и
98.5 % с видом T. saturnisporum соответственно по генам tefla и ITSl, 5.8SpPHK, ITS2;
- вид T. pachybasioides имеет максимальную степень идентичности - 97,8 и 97,3 % с видом T. croceum соответственно по генам tefla и ITSl, 5.8S pPHK, ITS2;
96.5 и 80,6% с видом T. minutisporum соответственно по генам l8S pPHK, ITSl, 5.8S pPHK, ITS2, 28S pPHK и tefla.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Комбинированный мультигенный филогенетический анализ показал наличие 5 устойчивых кластеров, содержащих используемые виды рода Trichoderma с неиспользуемыми видами. На основе парного выравнивания нуклеотидных последовательностей, максимальная степень идентичности которых свыше 90 % и с учетом высокой степени бутстреп-поддержки хотя бы для одного кластера - свыше 70 %, нами выделены неиспользуемые виды Trichoderma, близкие к видам с используемыми полезными свойствами, которые могут быть предположительно использованы в тех же целях:
- T. minutisporum, T .croceum - в качестве биоконтроля над болезнями растений;
- T. konilangbra - в качестве массового культивирования ферментов ксиланаз;
- T. ghanense - в качестве массового культивирования ферментов целлюлаз и гемицеллюлаз.
Предсказанные полезные симбиотические свойства этих грибов Trichoderma на основе мультигенного филогенетического анализа нуждаются в экспериментальной проверке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Howell C.R., Hanson L.E., Stipanovic R.D., Puckhaber L.S. Induction
of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani
by seed treatment with Trichoderma virens II Phytopathology. 2000. V. 90. №. 3. P. 248-252.
2. Harman G.E., Howell C.R., Viterbo A., Chet I., Lorito M. Trichoderma spp.-opportunistic avirulent plant symbionts II Nature Microbiol. 2004. Rev. 2. P. 43-5б.
3. CMupHoea И.П. Алексеев С.Б., Мошков Д.А. Триходерма - Продуцент ингибитора вируса иммунодефицита человека II Вопр. медицинской химии. 2000. T. 46. № 4. URL: http:IImedi.ruIpbmc I88004.htm.
4. Kubicek C.P., Harman G.E. Trichoderma and Gliocladium, Basic Biology, Taxonomy and Genetics. L.: Taylor & Francis, 1998. V. 1. P. 278.
5. Harman C.E., Kubicek C.P. Trichoderma and Gliocladium, Enzymes, Biological Control and Commercial Applications. L.: Taylor & Francis, 1998. V. 2. P. 393.
6. Elad Y., Kapat A., Eur J. The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea II Plant Pathology. 1999. № 105. P. 177-189.
7. de Hoog G.S., Guarro J., Gene M J. Atlas of Clinical Fungi II Atlas of Clinical Fungi, 2nd edition. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands. 2000. V. 1.
8. Samuels G.J. Trichoderma: Systematics, the sexual state, and ecology II Phytopathology. 2006. № 96. P. 195-206.
9. Wu Z., Tsumura Y., Blomquist G., Wang X.R. 18S rRNA Gene Variation among Common Airborne Fungi, and Development of Specific Oligonucleotide Probes for the Detection of Fungal Isolates II Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. б9. P. 5389-5397.
10. Бамптон Г.Д., Фролова Л.Л. Сравнительный анализ штаммов Trichoderma на основе гомологии последовательностей 18S рРНК II Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: тез. II Междунар. науч.-практ. конф. Казань, 15-16 сент. 2008 г. Казань, 2008. С. 10-11.
Поступила в редакцию 3 сентября 2009 г.
Frolova L.L., Bampton G.J. Prediction of Trichoderma useful symbiotic properties on base molecular phylogenetic analysis. Currently only 10 % of known Trichoderma species, whose beneficial properties are experimentally confirmed, are used in biotechnology applications. At the same time, other species could also possess beneficial properties. In current work we made an attempt to predict the useful symbiotic properties of currently biotechnologically unused Trichoderma species based on phylogenetic analysis of several known genes sequences publically available through database Genebank and analysis of pairwise alignment of nucleotide sequences.
Key words: Trichoderma; database of nucleotide sequences Genbank; multigenes phylogenetic analysis4 pairwise alignment of nucleotide sequences.
