CC BY
28
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ORIGINAL
PAPERS
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Л.М. Михайлова, А.Б. Сыркин, 1993 УДК 616-006.04-085.277.3-092:615.9 Л.М. Михайлова, А.Б. Сыркин
Предклиническая токсикология СЯС680578
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
СЯС680578 — новый отечественный оригинальный противоопухолевый препарат из класса нитрозоалкил-мочевин. Синтезирован в Институте химии Уральского научного центра. Противоопухолевые свойства исследованы в отделе экспериментальной химиотерапии ОНЦ РАМН.
Данная работа посвящена предклиническому токсикологическому изучению препарата.
Цель исследования — изучение безвредности СЯС680578, выявление токсических и побочных эффектов и прогнозирование их в клинике.
Материалы и методы. Исследование проведено на 230 мы-шах-гибридах И1 (СВАхС57ВЬ/6^), 80 мышах-самках линии БНК, 138 белых беспородных крысах обоего пола, 17 кроликах и 12 собаках обоего пола. В работе использовали препарат в рекомендуемой для клинического применения лиофилизированной лекарственной форме, при этом строго учитывался рекомендуемый в клинику способ применения (внутривенно, 1- и 5-кратно). Изучение проводили с применением токсикологических, гематологических, биохимических, физиологических и психофармакологических методов исследования.
Острую токсичность СИС680578 изучали при однократном внутрибрюшинном и внутривенном введении мышам, крысам и собакам 0,1 — 2,5% раствора СЖС680578, приготовленного на 5% растворе глюкозы. На мелких животных определяли расчетные токсические дозы (11)10, 0550) по методу Литчфильда и Уилкок-сона. В исследованиях на собаках устанавливали уровни токсических доз: летальную дозу (1Л)), высокую токсическую дозу (ВТД) и низкую токсическую дозу (НТД).
При изучении хронической токсичности СИС680578 вводили в 0,1% концентрации в разовых дозах 10, 30 и 60 мг/кг мышам внутрибрюшинно ежедневно в течение 15 дней, а собакам в 1% концентрации в разовых дозах 10, 5 и 3 мг/кг внутривенно ежедневно в течение 5 дней.
Наблюдение за животными проводили в течение 1 — 3 мес, оценивая сроки гибели, число павших животных, клиническую картину интоксикации, поведенческие реакции, макроскопическое состояние внутренних органов павших и забитых в конце срока наблюдения животных. Фрагменты органов и тканей этих животных брали для морфологического исследования. Оценивали действие препарата на гемопоэз, желудочно-кишечный канал, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек, изучали влияние СИС680578 на функции ЦНС.
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
L.M. Mihailova, A.B.Syrkin Preclinical Toxicology of CRC680578
Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors
CRC680578 is a new Russian original antitumor drug belonging to the class of nitrosoalkylureas. It has been synthesized at the Chemistry Institute of the Ural Research Center. The drug antitumor activity has been studies at the Experimental Chemotherapy Unit of the CRC, RAMS.
This paper deals with preclinical toxicological study of the drug.
The purpose of the study was to investigate safety of CRC680578, to discover its toxic and side effects, and to make clinical prognosis of the effects.
Materials and Methods. The study was performed in 230 hybrid mice Fl (CBAxC57Bl/6j), 80 female mice of the SHK line, 138 white mongrel rats of both sexes, 17 rabbits and 12 dogs of both sexes. The drug was used as freeze-dried pharmaceutical form with due account to the way of administration recommended for the clinical application (intravenously in 1 or 5 injections). The study was performed using toxicological, hematological, biochemical, physiological and psychopharmacological methods of investigation. CRC680578 acute toxicity was studied in single intraperitoneal or intravenous administration of 0.1—2.5% CRC680578 solution in 5% glucose solution to mice, rats and dogs. In the study on small animals we established toxic doses (LDlO, LD50) by the Litchfield and Wil-coxon techniques. Lethal dose (LD), high toxicity dose (HTD) and low toxicity dose (LTD) were determined in experiments on dogs.
To study chronic toxicity of CRC680578 we administered the drug as 0.1 % solution to mice at 10, 30 and 60 mg/kg intraperitoneally daily for 15 days, and as 1% solution to dogs at 10, 5 and 3 mg/kg intravenously daily for 5 days.
Observation of the animals was carried out for 1—3 mo with taking account of death time, number of deaths, clinical symptoms of intoxication, behavioral reactions, macroscopic status of viscerals of dead animals and those sacrificed by the end of the observation term. Organ and tissue fragments of these animals were studied morphologically. The drug was evaluated for effect on hemopoiesis, gastrointestinal tract, function of the cardiovascular system, liver kidneys, CNS.
R e s u 11 s. As a result of the CRC680578 toxicological study we established lethal, highly toxic, low toxic and atoxic doses of the drug as administered intravenously or intraperitoneally to mice, and intravenously to rats and dogs.
Таблица 1
Острая токсичность CRC680578 при внутривенном применении мышам, крысам и собакам
Table 1
Acute toxicity of CRC680578 in intravenous administration to mice, rats and dogs
Вид животного Пол LD50, мг/кг LD10, мг/кг
р-0,05
Мыши/М1се Самки 210(183—242) 280(243—322)
Самцы 240(222—259) 300(277—324)
Крысы/Rats Самки 103(89—118) 140(121—161)
Собаки/Dogs LD, втд, НТД,
мг/кг мг/кг мг/кг
Самцы 15 10 3
Самки 25 15 3
LD, mg/kg HTD, mg/kg LTD, mg/kg
Animals Sex р-0,05
LD50, mg/kg LD10, mg/kg
Примечание. В скобках — доверительные интервалы. / Note. Numerals In parentheses show confidence Intervals.
Таблица 2
Острая токсичность CRC680S78 при однократном внутривенном введении собакам
Table 2
Acute toxicity of CRC680S78 in single-dose administration to dogs
Пол Доза, мг/кг Клинические проявления интоксикации Исход
Самцы 25 Вялость, анорексия/inactivity, anorexia Пала на 7-е сутки/Died on day 7
Самки 25 Увеличение времени свертывания крови, увеличение СОЭ, лейкоцитопения, саливация Increased blood coagulation time, increased ESR, leukocytopenia. salivation Пала на 9-е сутки Died on day 9
Самки 15 Вялость, анорексия, увеличение СОЭ, увеличение времени свертывания крови, диарея с кровью Inactivity, anorexia, increased ESR, increased blood coagulation time, blood-stained diarrhea Усыплена на 76-е сутки после применения препарата Sacrificed on day 76 after treatment
Самцы 15 Вялость, адинамия, слабость Inactivity, adynamia, weakness Пала на 7-е сутки Died on day 7
Самцы 10 Умеренная лекоцитопения Moderate leukopenia Усыплена на 65-е сутки после применения препарата Sacrificed on day 65 after treatment
Самцы 10 He обнаружены/Not found To же на 8-е сутки/The same on day 8
Самцы 3 He обнаружены/Not found To же на 80-е сутки/The same on day 80
Sex Dose, mg/kg Intoxication clinical manifestation Outcome
Результаты исследования. В результате проведенных исследований по токсичности СЯС680578 определены летальные, высокие токсические, низкие токсические и нетоксические дозы препарата для мышей при внутривенном и внутрибрюшинном применении, для крыс и собак при внутривенном применении.
Дана количественная оценка острой токсичности СЯС680578 по критерию расчетных доз ЬБ5о и ЫЭю (МПД) и установленных доз Ы), ВТД, НТД для собак (табл. 1).
При применении СЯС680578 в однократных летальных и высоких токсических дозах у мелких животных отмечаются адинамия или гиподинамия, атаксия, круговые
CRC680578 acute toxicity was estimated quantitatively by the criterion of calculated doses LD50, LD10 (MTD) and established doses LD, HTD, LTD for dogs (table 1).
On receiving CRC680578 at single lethal and high toxicity doses the small animals presented anemia or hypodynamia, ataxia, rotation, lid-slit narrowing, diarrhea, 10—20% weight loss, nasal sanies.
After receiving CRC680578 at lethal doses the animals died within 10 days from treatment.
The CRC680578 toxicity in single dose administration to dogs is presented in table 2. The clinical intoxication symptoms and abnormal behavioral reactions vanished 30 (small animals) — 60 days (dogs) after treatment.
Таблица 3.
Токсичность CRC680578 при 5-кратном ежедневном внутривенном введении собакам
Table 3
CRC680578 toxicity in daily intravenous administration for 5 days to dogs
Пол Доза, мг/кг Клинические проявления интоксикации Исход
разовая суммарная
Самцы 10 50 Вялость, лейкоцитопения, тромбоцитопения Inactivity, leukocytopenia, thrombocytopenia Пала на 4-е сутки после окончания введения препарата Died on day 4 after treatment
Самцы 5 25 Вялость, лейкоцитопения, тромбоцитопения, увеличение СОЭ, диарея с кровью Inactivity, leukocytopenia, thrombocytopenia, increased ESR, blood-stained diarrhea Усыплена на 94-е сутки после применения препарата Sacrificed по day 94 after treatment
Самки 5 25 Лейкоцитопения, тромбоцитопения Leukocytopenia, thrombocytopenia То же на 3-и сутки The same on day 3
Самки 3 15 Лейкоцитопения, тромбоцитопения Leukocytopenia, thrombocytopenia To же на 37-е сутки The same on day 37
Самки 3 15 He обнаружены/Not found To же на 3-и сутки/The same on day 3
Sex single total Intoxication clinical manifestations Outcome
Dose, mg/kg
движения, сужение глазных щелей, диарея, потеря массы тела на 10—20%, сукровичные выделения из носа.
Гибель животных от применения CRC680578 в летальных дозах происходит в течение первых 10 дней.
Токсичность CRC680578 после однократного введения собакам представлена в табл. 2. Клинические проявления интоксикации и нарушения в поведенческих реакциях исчезают через 30 (мелкие животные) — 60 дней (собаки).
При вскрытии павших животных после применения препарата в летальных и высоких токсических дозах отмечаются геморрагический синдром (геморрагическая инфильтрация тканей печени и почек), кровоизлияния в перикард, кровоизлияния в легкие, кровенаполнение кишечника, увеличение селезенки. Остальные органы без видимой патологии.
При однократном применении СЖС680578 в низких токсических дозах клинических проявлений интоксикации и существенных изменений в поведенческих реакциях не выявлено. При вскрытии таких животных отмечаются точечные кровоизлияния в легкие и поджелудочную железу и полнокровие селезенки.
При изучении хронической токсичности СЖС680578 установлено, что разовая доза препарата 60 мг/кг (суммарная 900 мг/кг) оказалась летальной для мышей, разовые дозы 30 и 10 мг/кг (суммарная 450 и 150 мг/кг соответственно) являются переносимыми. Летальная доза для собак при 5-кратном введении (ЖС680578 10 мг/кг (суммарная 50 мг/кг). Препарат в разовой дозе 5 мг/кг (суммарная 25 мг/кг) вызывает у собак значительные токсические проявления (ВТД). Разовая доза 3 мг/кг (суммарная 15 мг/кг) охарактеризована как НТД (табл. 3).
Autopsy of the dead animals after administration of the drug at lethal and highly toxic doses discovered hemorrhagic syndrome (hemorrhagic infiltration of liver and kidney tissues), pericardial hemorrhage, edema, pulmonary hemorrhage, intestinal congestion, enlarged spleen. The rest of the organs showed no visible pathology.
Administration of CRC680578 at low toxicity single doses did not lead to intoxication symptoms or considerable impairment of behavioral reactions. In autopsy the animals presented splenal plethora, petechial pulmonary and pancreatic hemorrhage.
When studying CR680578 chronic toxicity we found out the single dose of 60 mg/kg (total 900 mg/kg) was lethal for mice, the single doses of 30 and 10 mg/kg (total 450 and 150 mg/kg, respectively) appeared tolerable. The dose of 10 mg/kg in a 5-injection course (total 50 mg/kg) was lethal for dogs. At the single dose of 5 mg/kg (total 25 mg/kg) the drug produced substantial toxic effects (HTD) in dogs. The single dose of 3 mg/kg (total 15 mg/kg) was evaluated as LTD (table 3).
The clinical intoxication pattern and macroscopic visceral changes after repeated administration of CRC680578 were similar to those in single dose administration.
As a result of the investigations performed we found hematotoxicity to be the limiting toxic effect. The he-matotoxicity of CRC680578 consisted of leukocytopenia (due to decrease in the granulocyte and lymphocyte counts) and thrombocytopenia. Leukocyte and platelet nadir was observed by day 3—14 after treatment. ESR decreased within the same time, while the erythrocyte count and hemoglobin level remained normal.
Таблица 4
Прогнозирование токсических и побочных эффектов при внутривенном применении CRC680578 в клинике
Table 4
Clinical prognosis of toxic and side effects of CRC680578 intravenous administration
Наблюдаемый эффект в эксперименте Ожидаемый эффект в клинике
1. Гастроинтестинальная токсичность (саливация, потеря массы тела, анорексия, диарея) Gastrointestinal toxicity (salivation, weight loss, anorexia, diarrhea) 2. Гематотоксичность (лейкопения, тромбоцитопения) Hematotoxicity (leukopenia, thrombocytopenia) 3. Геморрагический синдром Hemorrhagic syndrome 4. Функциональные нарушения ЦНС CNS function Impairment 1. Тошнота, анорексия. При передозировке возможны рвота, потеря в массе, диарея Nausea, anorexia. Overdosage may lead to vomiting, weight loss, diarrhea 2. Лейкопения, тромбоцитопения. Показатели, лимитирующие применение препарата Leukopenia, thrombocytopenia. Dose-limltlng parameters 3. При передозировке кровь в кале, возможны кровотечения (кишечные, желудочные) Overdosage may lead to blood-stained feces, hemorrhage (intestinal, gastral) 4. Гиподинамия, пассивность, вялость, снижение интереса, заторможенность. При передозировке — адинамия, гипотермия, ухудшение памяти, забывчивость Hypodynamia, inactivity, decreased Interest, slow reaction. Adynamia, hypothermia, memory disturbance, obliviousness
Experimental effect observed Clinical effect expected
Рис. 1. Влияние CRC680578 на число лейкоцитов в периферической крови собак.
а — при однократном применении препарата в дозе 15 мг/кг; b — при многократном применении препарата в дозе 15 мг/кг ,
(5-кратно ежедневно в разовой дозе мг/кг). Здесь и на рис. 2 по горизонтали — дни наблюдения; по вертикали — число клеток в 1 мм крови. Fig.l. CRC680578 effect on peripheral blood leukocyte count in dogs.
a, single administration at 15 mg/kg, b, multiple administration at a total dose of 15 mg/kgiat 3 mg/kg daily for 5 days). Here and in fig.2 numbers on the horizontal show days of observation, numbers on the vertical represent cell count per 1 mm blood.
Фон 3 7 30
Рис. 2. Влияние CRC680578 на число тромбоцитов в периферической крови собак при однократном введении (светлые столбики) в дозе 15 мк/кг и многократном введении (столбики со штриховкой) в дозе 15 мг/кг (5-кратно ежедневно в разовой дозе 3 мг/кг).
Fig.2. CRC680578 effect on peripheral blood platelet count in dogs in single administration (clear bars) at 15 mg/kg and multiple administration (hatched bars) at 15 mg/kg (3 mg/kg daily for 5 days).
Клиническая картина интоксикации и макроскопические изменения внутренних органов при повторном введении CRC680578 аналогичны таковым при однократном применении.
В результате проведенных исследований установлен вид токсичности препарата, лимитирующий его применение. Это — гематотоксичность. Гематотоксическое действие CRC680578 выражается в лейкоцитопении (за счет снижения числа гранулоцйтов и лимфоцитов) и тромбоцитопении. Максимальное снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов отмечено на 3—14-е сутки после применения препарата. Отмечено увеличение СОЭ в те же сроки, число эритроцитов и количество гемоглобина остается в пределах физиологической нормы. Выявлено, что CRC680578 при многократном применении оказывает более сильное действие на периферическую кровь животных (рис. 1,2). При применении летальных и высоких токсических доз отмечены гастроинтестинальная токсичность (саливация, анорексия, диарея, уменьшение массы тела), геморрагический синдром и влияние препарата на функциональное состояние ЦНС (депримирующее действие, гипотермия, адинамия, атаксия), не выявлено токсического действия препарата на функции печени, почек и сердца, но имеются выраженные морфологические признаки повреждающего действия препарата на эти органы. Токсическое действие CRC680578 коррелирует с величиной примененной дозы и имеет обратимый характер.
CRC680578 в нетоксических дозах не оказывает побочного действия на ЦНС, сердечно-сосудистую систему, печень и почки. Отмеченные морфологические изменения в органах желудочно-кишечного канала при применении CRC680578 в нетоксических дозах незначительны.
В результате проведенных исследований обнаружено, что наиболее чувствительным видом животных к токсическому действию препарата являются собаки (затем крысы и мыши). Выявлено отсутствие зависимости токсического действия от пола мелких лабораторных животных. Однако отмечена наибольшая чувствительность к действию CRC680578 собак-самцов при однократном применении препарата.
При изучении специфической токсичности CRC680578 выявлено отсутствие местного действия, пирогенных и аллергенных свойств. Препарат обладает эмбриотоксическим и мутагенным действием.
Полученные экспериментальные данные по пред-клиническому токсикологическому изучению CRC680578 позволяют прогнозировать токсическое и побочное действие препарата при применении его в клинике (табл. 4).
Поступила 4.02.92. / Submitted 4.02.92.
Multiple administration of CRC68Q578 produced a greater effect on peripheral blood of the animals (figs. 1,2). The drug at lethal and highly toxic doses caused gastrointestinal disorders (salivation, anorexia, diarrhea, weight loss) hemorrhagic syndrome, CNS function impairment (deprimation, hypothermia, adynamia, ataxia) . The drug produced no toxic effect on functioning of the liver, kidneys and heart, though there was vivid morphological evidence of the drug damaging action on these organs. CRC680578 toxicity was dose-dependent and reversible.
At atoxic doses CRC680578 exerted no side effect on the CNS, cardiovascular system, liver or kidneys. The morphological changes in gastrointestinal organs associated with administration of CRC680578 atoxic doses were mild.
As a result of the investigations we found dogs (with rats and mice to follow) to be the most sensitive to the drug toxic effect. In the small animals the toxicity was not sex-specific. However, male dogs were the most sensitive to CRC680578 as administered at single doses.
In study of specific toxicity CRC680578 induced no local reactions, exerted neither pyrogenic nor allergenic action. The drug toxicity profile also included em-bryotoxicity and mutagenicity.
The experimental data obtained in the preclinical toxicological study of CRC680578 allowed prognosis of the drug toxic and side effects in clinical application (table 4).
