CC BY
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ... 55
УДК 616.24-006.6-092.4:615.322 Е.А. Сафонова1, А.М. Гурьев2, Т.Г. Разина1, Е.П. Зуева1, Л.А. Ефимова1, К.А. Лопатина1 ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ С ПОМОЩЬЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ФРАКЦИЙ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА АИРА БОЛОТНОГО (ACORUS CALAMUS L.)
ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, Томск 2ГБОУВПО СибГМУМинздравсоцразвития России, Томск
Контактная информация
Сафонова Елена Андреевна, канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории онкофармакологии адрес: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3, тел: +7(3822)41-77-47; +7(903)952-10-73 e-mail: safonova [email protected]
Статья поступила 30.09.2012, принята к печати 31.10.2012.
Резюме
Из суммарного полисахаридного комплекса корневищ аира болотного (Асогиs calamus L.) выделены компоненты, проявляющие фармакологическую активность, и определена их химическая структура. В эксперименте установлена возможность повышения эффективности терапии циклофосфаном мышей с карциномой легких Льюис под влиянием четырех из пяти исследуемых фракций. Показано, что активными в отношении опухолевого роста и процесса метастазирования являются фракции, в составе которых присутствует наибольшее количество D-галактуроновой кислоты. Установлено, что терапевтическое действие этих веществ превосходит таковое у суммарного полисахаридного комплекса. Полученные экспериментальные данные могут стать основой для дальнейшего углубленного изучения компонентов, выделенных из полисахаридного комплекса, с целью создания препаратов, повышающих эффективность лечения больных со злокачественными новообразованиями.
Ключевые слова: полисахариды, карцинома легких Льюис, циклофосфан.
E.A. Safonova1, A.M. Guryev2, T.G. Razina1, E.P. Zueva1, L.A. Efimova1, K.A Lopatina1
INCREASE OF CHEMOTHERAPY EFFICIENCY
BY MEANS OF FRACTIONS ISOLATED
FROM POLYSACCHARIDES
COMPLEX ACORUS CALAMUS L.
1The Institute of Pharmacology of Siberian Branch Russian Academy of Medical Science, Tomsk
2Siberian State Medical University, Tomsk
Abstract
It was isolated pharmacological activ components from polysaccharides complex Аcorus calamus L. and their chemical structure was defined. In experiment the influence of these substances on efficiency of cyclophosphamide therapy on mice with lung Lewis carcinoma was established. As a result of research the most active substances on tumoral growth and metastasis process were defined. Therapeutic action of the fraction surpasses the activity of polysaccharides complex. The obtained experimental data can become a basis for further profound of the fraction studying.
Key words: рolysaccharides, cyclophosphamide, lung Lewis carcinoma. Введение
В настоящее время в онкологической практике применяются хирургический, лучевой и химиотерапевтический методы лечения больных со злокачественными новообразованиями. На поздней стадии заболевания хирургическое удаление опухолевого узла и лучевое воздействие не приводят к полному излечению онкологических больных ввиду развития метастатической болезни и рецидивов заболевания, поэтому химиотерапевтический метод остается наиболее востребованным, а в большинстве случаев, единственным эффективным. Однако противоопухолевые препараты почти всегда применяются длительно и в высоких дозах, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов со стороны здоровых, не поврежденных опухолевым процессом органов и тканей [5]. В связи с этим актуальным является поиск средств для включения в схемы химиотерапии с целью повышения ее эффективности и снижения токсических проявлений цитостатиков. Полисахариды - биополимеры, ко-
торые не токсичны и обладают широким спектром фармакологической активности. Растительные полисахариды способны уменьшать рост и метастази-рование бластом, подавляя ангиогенез и индуцируя процесс апоптоза в опухолевой ткани [8; 11]. Эти вещества стимулируют гемопоэз, оказывают защитное действие на клетки печени, модулируют активность нейтрофилов, индуцируют продукцию ряда цитокинов макрофагами [2; 9; 14; 18].
В ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН г. Томска в течение ряда лет проводится исследование возможности использования СПК из корневищ аира болотного в комплексной терапии перевиваемых опухолей. В экспериментах на различных моделях перевиваемых опухолей (карцинома легких Льюис, меланома В-16, рак легкого-67 и карцино-саркома Уокера-256) и разных видах лабораторных животных (мыши и крысы) показано повышение эффективности цитостатической терапии при добавлении в схему лечения СПК аира болотного [3; 7].
56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ...
Целью настоящего исследования явилась идентификация компонентов, входящих в состав СПК, выделение в чистом виде, установление химической структуры и определение фармакологической активности этих веществ в онкологическом эксперименте.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 80 мышах-самках линии С57БЬ/6 (возраст 3 мес., масса 20-22 г) первой категории, полученных из отдела экспериментального биомоделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат качества № 18805). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). До и в период экспериментов мыши находились в виварии при температуре воздуха +20-22 °С, влажности - не более 50%, объеме воздухообмена (вытяжка: приток) - 8:10, в световом режиме (день: ночь). Животные были размещены в стандартных пластиковых клетках и содержались на стандартном рационе (полнорационный гранулированный корм для мелких лабораторных грызунов, конвенциональных и 8РБ-категории, апатогенный, автоклавируемый; ГОСТ Р 518492001, производитель ЗАО «Ассортимент-Агро», Россия, Сергиев Посад, сертификат соответствия № РОСС ЯИ. ПР73. Н36709).
СПК из корневищ аира болотного получен из фармакопейного растительного сырья фракционным методом на кафедре фармацевтической химии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (г. Томск). Разделение полисахаридного комплекса на фракции и выделение индивидуальных компонентов проводили методами ионообменной хроматографии, ультрафильтрации и порционного осаждения. Для определения содержания белковых примесей и уроновых кислот в исследуемых образцах использовали спектрофотометрический метод [9]. Молекулярно-массовое распределение в образцах определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов («Sigma-Aldrich»).
Дизайн экспериментов одобрен этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН. ЬЬС перевивали внутримышечно по 5-6 млн опухолевых клеток в 0,1 мл физ. р-ра. Для проведения фармакологического исследования было сформировано 8 экспериментальных групп (каждая группа включала по 10 животных): контроль - животные с карциномой легких Льюис, которые получали физиологический раствор в эквиобъемном количестве; мыши, леченные циклофосфаном; 5 групп животных, получавших циклофосфан совместно с фракциями, выделенными из СПК; группа мышей, леченных СПК корневищ аира болотного и циклофосфаном.
Циклофосфан вводили животным однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 11 сут. после перевивки опухоли. Фракции полисахаридного комплекса и СПК вводили мышам в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно, начиная с 7 сут после перевивки опухоли ежедневно в течение 14 сут. Эксперимент заканчивали на 21 сут развития ЬЬС. Оценку эффективности терапевтических воздействий проводили в соответствии с методическими рекомендациями, изложенными в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ» [6], определяя массу основного опухолевого узла, количество и площадь метастазов, частоту метастазирования, ТРО и ИИМ. Из эксперимента животных выводили путем дислокации шейного отдела позвоночника. Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и углового преобразования Фишера [1].
Результаты и обсуждение
Суммарный полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного представляет собой смесь полисахаридов с различной молекулярной массой. Для идентификации фармакологически активных компонентов, входящих в состав СПК, необходимо было выделить их в чистом виде и установить их химическую структуру. В результате разделения СПК из корневищ аира болотного методом ионообменной хроматографии было получено около 40 фракций, из которых при объединении получили 5 основных (см. рис.).
Рис. Хроматограмма полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного. Сорбент - БЕАЕ-цел-люлоза (С1--форма), подвижная фаза - 0.01, 0.1, 0.2,
0.3, 0.4 и 0.5 М растворы №С1.
В полученных фракциях было определено содержание белка и уроновых кислот спектрофотометрическим методом (табл. 1).
В результате анализа полученных фракций методом эксклюзионной ВЭЖХ установлено, что они представляют собой индивидуальные вещества с различной молекулярной массой: вещество PSF-101 - 40 кДа; PSF-102 - 280 кДа; PSF-103 - 370 кДа; PSF-104 - 440 кДа и PSF-105 - 740 кДа. Хроматомасс-спектрометрическим анализом триметил-силилированных производных, полученных из гидролизатов исследуемых фракций, был установлен их мономерный состав (табл. 2).
Таким образом, в результате анализа проведенного исследования выявлено, что в составе полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного содержится 5 основных компонентов, отличающихся по мономерному составу и молекулярной массе. Установлено, что 3 компонента являются нейтральными полисахаридами (PSF-101, PSF-102, PSF-104) а 2 представляют собой кислые полисахариды (PSF-103, pSF-105).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ... 57
Таблица 1
Содержание уроновых кислот и белка во фракциях полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного
№ п/п Фракция ПСК Выход, % от массы ПСК Характеристика
Содержание уроновых кислот, % Содержание белка, %
1 Р8Р-101 41,96±4,56 - -
2 Р8Р-102 7,34±1,23 3,52±0,73 -
3 Р8Р-103 27,21±2,99 83,93±2,14 -
4 Р8Р-104 11,19±1,15 7,37±0,73 -
5 Р8Р-105 5,95±1,25 31,76±1,23 1,70±0,08
Мономе рный состав фракций полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного Таблица 2
№ п/п Моносахарид Содержание моносахаридов, %
Р8Р-101 Р8Р-102 Р8Р-103 Р8Р-104 Р8Р-105
1 Б-арабиноза - - 0,61 0,44 -
2 Б-рамноза - 0,24 6,46 1,7 11,06
3 Б-ксилоза - 1,28 7,44 5,18 4,71
4 Б-манноза - 2,07 0,42 2,54 1,74
5 Б-галактоза - 31,33 12,53 38,77 25,86
6 Б-глюкоза 99,78 63,83 5,06 40,97 30,91
7 Б-галактуроновая кислота - - 67,48 3,20 25,71
8 неидентифицированные компоненты - - - 7,2 -
Таблица 3
Влияние СПК аира болотного и выделенных из него фракций на эффективность лечения циклофосфаном мышей-самок линии С57ВЬ/6 с карциномой легких Льюис________________________________________________
Группа наблюдения, доза Ч количество введений (количество животных) Масса опухоли (Х±т), г ТРО, % Частота метастазирования, % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Б метастазов на 1 мышь (Х±т), мм2 ИИМ, %
1. Контроль (10) 6,41±0,45 - 100 27,80±8,30 73,20±33,53 -
2. Циклофосфан, 125 мг/кг Ч 1 (9) 4,87±0,50 1-2Р<0,05 24 89 5,78±1,66 1-2Р<0,01 2,97±0,91 1-2Р<0,01 81
3. Р8Е-101, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч 1 (10) 4,55±0,17 29 80 7,90±2,98 3,78±1,97 77
4. Р8Е-102, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч 1 (10) 4,31±0,44 33 40 2-4Р<0,01 3,60±1,95 2,53±1,63 95
5. Р8Е-103, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч 1 (10) 4,13±0,33 2-5Р<0,05 36 40 2-5Р<0,01 1,00±0,54 2-5Р<0,01 0,19±0,10 2-5Р<0,01 99
6. Р8Е-104, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч 1 (10) 4,54±0,33 29 60 3,00±1,26 1,07±0,73 2-6Р<0,05 94
7. Р8Е-105, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч 1 (10) 4,50±0,17 30 30 2-7Р<0,01 0,70±0,37 2-7Р<0,01 0,06±0,04 2-7Р<0,01 99
8. Полисахарид-ный комплекс, 20 мг/кг Ч 14 + ЦФ 125 мг/кг Ч1 (10) 4,94±0,17 23 80 3,00±0,80 0,58±0,13 2-7Р<0,05 91
Нейтральные полисахариды идентифицированы как:
■ а-(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 40 кДа (Р8Е-101);
■ а-Б-галакто-(1,4)-а-Б-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа (Р8Р-102);
■ р-Б-ксилопиранозил-а(1,3)-Б-галакто-а(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 440 кДа (Р8Р-104).
Химическая структура кислых полисахаридов идентифицирована как а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-Б-га-лактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа (Р8Р-103) и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа (Р8Р-105).
Следующий этап работы был посвящен изучению противоопухолевых и антиметастатических свойств идентифицированных веществ на фоне химиотерапии. В эксперименте показано, что введение циклофосфана мышам с карциномой легких Льюис
приводило к достоверному снижению массы основного опухолевого узла (в 1,3 раза), уменьшению количества (в 4,8 раза) и площади метастазов в легких по сравнению с этими показателями у животных контрольной группы (табл. 3). Наиболее выраженной фармакологической активностью обладала фракция Р8Р-103, так как добавление ее в схему химиотерапии приводило к повышению как противоопухолевого, так и антиметастатического эффекта цитостатика. Так, у этих животных достоверно меньше оказалась масса основного опухолевого узла, снизилось также количество (в 5,8 раза, Р<0,01) и площадь (в 15,6 раза, Р<0,01) метастазов в легких, частота метастазирова-ния составила 40 % (Р<0,01) против 89 % в группе леченных только циклофосфаном, наивысшим оказался и индекс ингибирования метастазирования - 99 %. Совместное применение фракции Р8Р-105 и цикло-фосфана приводило к повышению антиметастатиче-ского эффекта последнего: количество метастазов и площадь метастатического поражения легких мышей снизились в 8,3 и 49,5 раза соответственно (Р<0,01), частота метастазирования достоверно уменьшилась (30 % против 89 % в группе применения цитостатика).
58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ...
Менее выраженным влиянием на эффективность противоопухолевой терапии обладали фракции Р8Р-102 и Р8Р-104. При использовании фракции Р8Р-102 совместно с циклофосфаном отмечено снижение частоты метастазирования по сравнению с таковой в группе монохимиотерапии (40 %, Р<0,01). Добавление в схему химиотерапии фракции Р8Р-104 уменьшало площадь метастатического поражения в легких мышей в 2,8 раза относительно таковой у леченных только циклофосфаном животных (Р<0,05). Курсовое введение фракции Р8Р-101 мышам с ЬЬС совместно с цитостатиком не влияло на его противоопухолевый и антиметастатический эффекты (табл. 3).
Применение суммарного полисахаридного комплекса и циклофосфана у мышей с ЬЬС не повлияло на массу первичной опухоли, значимо ниже -в 5,1 раза (Р<0,05) оказалась площадь метастатического поражения легких относительно этого показателя у леченных только циклофосфаном мышей, отмечена также тенденция к уменьшению количества метастазов, при этом индекс ингибирования мета-стазирования составил 91 % против 81 % получавших монохимиотерапию животных (табл. 3).
Таким образом, в эксперименте установлено, что повышение противоопухолевой и антиметаста-тической активности циклофосфана было более выраженным у животных, в схему лечения которых входили фракции Р8Р-103 и Р8Р-105. В составе фракции Р8Р-103 идентифицировано 67 % галакту-роновой кислоты, 12,5 % галактозы и небольшие количества ксилозы, рамнозы и глюкозы. Фракция Р8Р-105 состоит из трех основных сахаров - глюкозы, галактозы и галактуроновой кислоты, также в ее состав входит рамноза, ксилоза и манноза. Присутствие в данных фракциях галактуроновой кислоты в достаточно большом количестве говорит о том, что эти образцы относятся к кислым полисахаридам. Возможно, именно высокое содержание Б-галактуроновой кислоты во фракциях Р8Р-103 и
PSF-105 играет важную роль в реализации фармакологической активности этих веществ. Известно, что полисахариды, в частности, пектиновые вещества, в состав которых входит D-галактуроновая кислота, проявляют противоопухолевые свойства за счет активации иммунной системы организма [4; 14; 16]. Полисахариды способны взаимодействовать со специфическими рецепторами на макрофагах (TLR, NOD, маннозный рецептор, скванжер рецептор, CD14, CR3), ответственными за распознавание и связывание полисахаридсодержащих структур [13]. Это приводит к вьтработке цитоки-нов, принимающих участие в противоопухолевой защите организма, в частности, макрофагального TNF-a, который способен вызывать некроз опухолевых клеток, не повреждая при этом здоровые [15]. Кроме того, полисахариды, содержащие га-лактуронан, способны увеличивать экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности опухолевых клеток, индуцируя активацию принимающих участие в противораковой защите иммуноцитов, что приводит к торможению роста злокачественного образования [12].
Заключение
В проведенном исследовании были идентифицированы компоненты в составе суммарного полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного, обладающие фармакологической активностью, определена их химическая структура и установлена их способность повышать противоопухолевую и антиметастатическую активность цикло-фосфана. Таким образом, данные полученные в работе, могут служить основой для углубленного изучения фармакологически активных фракций, выделенных из полисахаридного комплекса аира болотного с целью создания на их основе новых высокоэффективных препаратов для повышения эффективности цитостатической терапии.
Литература
1. ГублерЕ.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - 193 с.
2. ДергуноваМ.А., Филатова Т.Г., Жанаева С.Я. и др. Влияние химически модифицированных полисахаридов на развитие селективной депрессии макрофагов печени // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - Т. 123, № 1. - С. 27-32.
3. Зуева Е.П., Лопатина К.А., Разина Т.Г., Гурьев А.М. Полисахариды в онкологии. - Томск: «Печатная мануфактура», 2010. - 108 с.
4. Оводов Ю.С. Пектины. Строение и свойства // Материалы II международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений». - Алма-Аты, Казахстан, 2007. - С. 18-9.
5. Переводчикова Н.И Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. - М.: «Практическая медицина», 2011. - 512 с.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ под ред. Р.У.
Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.- М.:ОАО Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.
7. Сафонова Е.А. Полисахариды растений как корректоры цитостатической терапии экспериментальных опухолей: Авто-реф. дисс ... канд. мед. наук: - Томск, 2011. - 25 с.
8. Attari F., Sepehri H., Delphi L., Goliaei B. Apoptotic and necrotic effects of pectic acid on rat pituitary GH3/B6 tumor cells // Iran Biomed J. - 2009. - 13(4). - P. 229-36.
9. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analyt. Biochem. - 1976. - 72. - Р. 248-54.
10. Diao H., Li X., Chen J. et al. Bletilla Striatapolysaccharide stimulates inducible nitric oxide synthase and proinflammatory cytokine expression in macrophages // Biosci. Bioeng. - 2008. - 105(2). - Р. 85-9.
11. Ghosh K., Chandra K., Ojha A.K. et al. Structural identification and cytotoxic activity of a polysaccharide from the fruits of
Lagenaria Siceraria L. // Carbohydr. Res. - 2009. - 344(5). - Р. 693-8.
12. Iguchi C., Nio Y., Takeda H. et al. Plant polysaccharide PSK: cytostatic effects on growth and invasion; modulating effect on the expression of HLA and adhesion molecules on human gastric and colonic tumor cell surface //Anticancer research. - 2001. - 21. - P. 1007-13.
13. Kim J.Y., Yoon Y.D., Ahn J.M. et al. Angelan isolated from Angelica Gigas N. induces dendritic cell maturation through toll-like receptor 4 // Int. Immunopharmacol. - 2007. - 7(1). - P. 78-87.
14. Kiyohara H., Matsumoto T., Nagai T. et al. The presence of natural human antibodies reactive against pharmacologically active pectic polysaccharidies from herbal medicines // Phytomedicine. - 2006. - 13(7). - Р. 494-500.
15. Niu Y.C., Liu J.C., Zhao X.M. et al. A low molecular weight polysaccharide isolated from Agaricus Blazei suppresses tumor growth and angiogenesis in vivo // Oncol. Rep. - 2009. - 21(1). - Р. 145-52.
16. Scarberry K.E., Dickerson E.B., McDonald J.F., Zhang Z.J. Magnetic nanoparticle-peptide conjugates for in vitro and in vivo targeting and extraction of cancer cells. // J. Am Chem.aoc. - 2008. - 130(31). - Р. 10258-62.
17. Wei S.Y., ZhangP.X., Han N. Effects of Hedysari polysaccharides on regeneration and function recovery following peripheral
nerve injury in rats // Am. J. Chin. Med. - 2009. - 3/(1). - Р. 57-67.
18. Xie G., Schepetkin I.A., Quinn M.T. Immunomodulatory activity of acidic polysaccharides isolated from Tanacetum Vulgare L.
// Int. Immunopharmacol. - 2007. - 7(13). - Р. 1639-50.
