CC BY
43
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИИ
Постнатальный овоцитогенез и возможное участие в нём клеток костного мозга
В современной биологии развития существует догма о том, что млекопитающие рождаются с уже фиксированным количеством яйцеклеток [овоцитов] и постнатальный овоцитогенез невозможен. Однако у взрослых женских особей мух дрозофил [Drozophila melanogaster] вклад в овоцитогенез вносят так называемые герминальные [герминативные] стволовые клетки [ГСК] [1]. В прошлом году группа Johnson J. из Massachusetts General Hospital [Boston, USA], занимающаяся поисками подобной популяции у млекопитающих, заявила, что у мышей [подобно дрозофилам] существует постнатальный овоцитогенез, осуществляемый за счёт ГСК [2]. Исследователи предположили, что клетки, отвечающие за постнатальное формирование половых клеток [ГСК] находятся непосредственно на периферии яичника, однако их количество не позволяет им осуществлять функции нормального овоцитогенеза.
В недавней работе этой же группы авторов, опубликованной в журнале Cell, показано, что яичники взрослых самок мышей способны довольно быстро производить до сотен овоцитов, несмотря на небольшой пул незрелых [премейо-тических] герминальных клеток. Кроме того, авторы впервые показывают участие стволовых клеток костного мозга в постнатальном овоцитогенезе.
Исследователи предположили, что ГСК взрослого яичника должны экспрессировать маркеры эмбриональных стволовых [ЭСК] и первичных половых клеток. Так, SSEA1 + клетки были обнаружены только в срединной части яичника, а сами овоциты этот маркер не экспрессировали. Для подтверждения гипотезы о содержании пула ГСК среди SSEA1 + клеток, проводили магнитную позитивную селекцию по SSEA1. В дальнейшем было показано, что SSEA1 + клетки экспрессируют POU-домен транскрипционного фактора Oct-4 [маркёр ЭСК], а также маркеры первичных половых клеток. Однако эти клетки не экспрессировали маркер, характерный для клеток, претерпевающих мейоз [белок синаптонемного комплекса - Scp3]. Также эти клетки не экспрессировали маркеры овоцитов [Hdac6, Gdf9,Zp3], а значит овоциты и выделенные SSEA1 + клетки - это две различные популяции. После введения доксирубицина наблюдали гибель овоцитов в течение суток. Однако на вторые сутки в яичниках начинался спонтанный ово- и фол-ликулогенез, по-видимому, за счёт ГСК. Таким образом, авторы выделили и охарактеризовали популяцию герминальных стволовых клеток, содержащихся в яичнике взрослой самки мыши.
Однако оставалось неясным, каким образом такое малое количество SSEA1+ ГСК может обусловливать полный овоцитогенез в течение такого короткого времени? Исследователи предположили, что существует еще какая-то клеточная
популяция, оказывающая влияние на этот процесс. По их предположению, это происходило за счет экстрагонадных факторов, поэтому авторы изучали экспрессию герминативных маркеров на поверхности стволовых клеток костного мозга (СККМ). В этой гипотезе есть и «эмбриологическая логика» -первичные половые и гемопоэтические клетки мигрируют из одного общего региона - проксимального эпибласта, и заселяют свои ниши.
Исследователями была показана экспрессия маркёров ЭСК (0^-4) и герминативных клеток клетками костного мозга взрослых мышей. Кроме того, была показана экспрессия ЫоЬох- специфического маркера ранних ооцитов, взаимодействующего с факторами 0^-4 и Сс^-Э и влияющего на фолликулогенез. По-видимому, высокоочищенную [флюоресцентный сортинг) 11п−/8са-1−/с-К^+/МуИ+ [МуИ - герминативный маркер) клеточную популяцию костного мозга, коэкспрессирующую и другие маркёры ГСК, можно считать предшественниками яйцеклеток в постнатальном овоцитогенезе.
Трансплантация СККМ у мышей дикого типа, а также у трансгенных - неспособных продуцировать овоциты и химически стерилизованных мышей, приводила к восстановлению процесса овогенеза. У мышей, которым был пересажен костный мозг на 1 -7 дни после химиотерапии, были обнаружены сотни фолликулов на разных стадиях созревания, чего не наблюдалось в контроле. Результат подтверждался и через 11 месяцев после трансплантации. Похожие результаты были получены и в экспериментах по пересадке клеток периферической крови с использованием СРР-трансгенных животных.
Несмотря на то, что фертильность мышей-доноров остаётся неизученной, показана нормальная морфология, взаимодействие в составе фолликула и экспрессия герминальных и ооци-тарных маркеров клетками костного мозга. Это характеризует СККМ как потенциальный источник половых клеток, которые способны поддерживать оогенез во взрослом организме.
Работа породила дискуссию в научном мире и ряд вопросов.
- Каков клеточный механизм овогенеза и возможно ли слияние клеток костного мозга с герминативными предшественниками?
- Способны ли обнаруженные клетки претерпевать нормальное развитие, быть оплодотворенными и дать начало новой особи?
- Возможно ли повторить похожие эксперименты с мужскими особями и генерировать сперматогенез?
Т олько при положительных ответах на все эти вопросы можно будет назвать изучаемые клетки истинно половыми. Тем не менее, этой работой группа иоИпБоп и. опровергает догму биологии развития о невозможности постнатального овоцитогенеза у млекопитающих. Остаётся неизвестным наличие этого
Клеточная трансплантология и инженерия № 2, 2005
I I I I I I
[Ж^ШП
Новости клеточных технологий
биологического феномена у остальных видов млекопитающих, включая человека.
Очень интересный комментарий к статье можно найти в последнем номере Reproductive Biology and Endocrinology [3]. В нем одна из определяющих ролей в замеченном явлении передается поверхностному эпителию яичников. Автор критикует Johnson за то, что они игнорируют теорию обновления фолликулов у взрослых млекопитающих за счёт поверхностного эпителия, выдвинутую Edgar Allen and Herbert M. Evans более 70-ти лет назад. Кроме того, в комментарии указывается, что клетки, несущие маркёры ГСК могут мигрировать в кост-
ный мозг, а не наоборот. На этот факт указывают опыты по удалению яичников, в которых клетки, экспрессирующие герминативные маркёры, в костном мозге не находили. Также обсуждаются возможные пути использования результатов исследования в медицине, при лечении бесплодия различного генеза [3]. Кроме того, необходимо помнить, что фолликул, помимо овоцита образован клетками фолликулярного эпителия, соединительной тканью, в его состав входят сосуды, поэтому требуются более четкие указания авторов на то, о происхождении каких элементов фолликула идет речь.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Deng W., Lin H. Assymetric germ cell division and oocyte determination during Drozophila oogenesis. Int. Rev. Cytol. 2001; 203: 93-138.
2. Johnson J., Canning J., Kaneko T., et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature 2004; 428: 145-50.
3. Bukovsky A. Can ovarian infertility be treated with bone marrow- or ovary-derived germ cells? Reprod. Biol. Endocrinol. 2005; 3: 36.
Подготовила B.C. Мелихова по материалам Cell 2005; 122: 303-15.
Геномные изменения эмбриональных стволовых клеток человека при длительном культивировании
Известно, что при длительном культивировании клетки могут претерпевать значительные фено- и генотипические изменения. Как и все активно делящиеся в культуре клетки, эмбриональные стволовые клетки человека [ЭСКч] претерпевают 10-9 спонтанных мутаций на нуклеотид. Ограниченные деления таких мутантов и работа репаративных ферментов позволяет поддержать практически неизменные свойства культуры в целом, если только речь не идет о мутациях, способствующих лучшему выживанию и влияющих на клеточное деление. В организме мутантные клетки элиминируются иммунной системой, однако в культуре этого не происходит.
В журнале Nature Genetics опубликованы результаты международного исследования геномных изменений в длительно поддерживаемых в культуре линий ЭСКч из регистра NIH. В предыдущих работах, в которых рассматривался вопрос генетической стабильности этих же линий,использовался кариотипический подход, в некоторых из них приводились данные об уникальной стабильности культивируемых долгое время [2 года] ЭСК [1 -3]. Однако в прошлом году, в Великобритании группой исследователей были установлены некоторые изменения кариотипа в линиях ЭСКч [4].
В данной работе приводится сравнение генотипов линий ЭСКч на ранних и поздних пассажах. Линии, зарегистрированные в NIH и доступные для исследований, были предоставлены компаниями ES Cell International, WiCell Institute, BresaGen, и Cellartis AB. Для анализа клеточного генома было использовано три различных подхода, независимо выявляющих изменения в клеточной ДНК:
- изучение количества копий ядерной ДНК [плоидность];
- изучение митохондриальной ДНК;
- уровень метилирования генных промоторов.
Всего было проанализировано 9 пар различных линий ЭСКч на различных сроках культивирования и одна непарная линия.
Для геномного анализа исследователи применили генные чипы Affymetrix GeneChip компании Affymetrix. Один такой чип позволяет выявлять полиморфизм единичных нуклеотидов 100 000 генов. Для каждого подхода применялся соответствующий чип.
Для выявления изменений в плоидности был использован кит Affymetrix GeneChip Chromosome. Из девяти парных линий четыре [45%] имели явные изменения в количестве копий геномной ДНК на поздних пассажах. Эти изменения были различны - от амплификаций и делеций больших участков [как, например, полная амплификация 17q плеча], до менее заметных - таких, как 2Mb амплификация вблизи myc-онкогена. Данные, полученные при использовании генного чипирования, были подтверждены методикой FISH и количественной ПЦР. Важно отметить, что все эти изменения касались районов, имеющих отношения к различным типам рака.
Скрининг митохондриального генома показал, что в 22% случаев [две из 9 линий] на поздних пассажах присутствуют изменения нуклеотидной последовательности [мутации] митохондриальной ДНК.
Наконец, исследователи показали аберрации в метилировании ряда генов в ЭСКч. Метилирование этих же генов является эпигенетической характеристикой для некоторых видов опухолевых клеток, как показатель естественного клеточного старения. В целом, восемь из 9 линий ЭСК на поздних пассажах [55-59], по сравнению с ранними пассажами имели более высокий уровень метилирования генных промотеров [11-33].
Таким образом, при изучении генома поздних пассажей ЭСКч, 8 из 9 линий несли одно или несколько генетических изменений, некоторые из которых характерны для злокачественных трансформаций человеческих клеток. Так, изменения в плоидности наблюдались в 45% случаев, последовательности митохондриальной ДНК - в 22%, изменения в уровне метилирования генных промоторов -в 90%.
Линии ЭСКч, поддерживаемые in vitro, подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям, следовательно, нуждаются в тщательном мониторинге как во время культивирования, так и в детальном анализе при использовании in vivo и в клинических целях.
Приведенный в этой работе анализ является на сегодняшний день самым детальным и имеет более «высокое разрешение», чем все предыдущие методы исследования
Клеточная трансплантология и инженерия № 2, 2005
