CC BY
51
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 5
УДК 635.33:575.822
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, СХОЖИЕ С МГЭ II КЛАССА,
В ГЕНОМАХ ВИДОВ РОДА Brassica L.*
А.М. АРТЕМЬЕВА, А.Г. ДУБОВСКАЯ, А.Е. СОЛОВЬЕВА, Ю.В. ЧЕСНОКОВ
На основе данных литературы и собственных исследований рассматривается генетическая нестабильность геномов у видов рода Brassica и возможности использования первичных нуклеотидных последовательностей, схожих с мобильными генетическими элементами (МГЭ) II класса (Ас, MuDR, Farl и CACTA), при создании молекулярных маркеров для оценки генетического разнообразия культур семейства Brassicaceae L. Представлены результаты ПЦР-оценки распространения и полиморфизма маркеров на основе элементов Ас, MuDR, Farl и CACTA у образцов, представляющих виды этого семейства в мировой коллекции ВИР (Всероссийский НИИ растениеводства), в связи с обсуждением их филогении.
Ключевые слова: виды рода Brassica, мобильные генетические элементы Ас, MuDR, Farl, CACTA, сохраняемое генетическое биоразнообразие.
Keywords: species Brassica, mobile genetic elements Ас, MuDR, Farl, CACTA, preserved genetic biodiversity.
Разработанная Николаем Ивановичем Вавиловым теория мобилизации и изучения генетических ресурсов растений, которая базировалась на знании ботаники, географии, истории, эволюционного учения, становится все более актуальной в современных условиях глобальных климатических изменений и усиления антропогенного воздействия, приводящего к обеднению генофонда как культурных, так и диких видов. Еще с начала XX века, основываясь на этой теории, Н.И. Вавилов с соратниками организовали целенаправленные экспедиционные сборы, что позволило создать уникальную мировую коллекцию культурных видов растений ВИР (Всероссийский институт растениеводства), в том числе экономически важных культур семейства Brassicaceae L.
Первые образцы овощных и масличных культур семейства поступили в коллекцию ВИР в 1921 году в результате экспедиций Н.И. Вавилова в страны Западной Европы, США и Канаду, затем в Афганистан, Иран, Армению. Российские селекционные и местные сорта были привлечены сначала через Всесоюзную сельскохозяйственную выставку, затем в ходе экспедиций в Северо-Западный регион, на Алтай и Дальний Восток. Были организованы экспедиции в страны древней земледельческой культуры: в Средиземноморье, Эфиопию, Западный Китай — под руководством
Н.И. Вавилова, в Малую Азию — П.М. Жуковского, в Индию — В.В. Марковича и др. Еще при жизни Н.И. Вавилова коллекция капусты, например, уже включала 1500 образцов. В результате этой деятельности сложился «...исходный потенциал видового разнообразия морфологических и физических свойств, необходимых для селекции и генетики» (1). Ботанико-географическое изучение масличных и овощных корнеплодных растений семейства осуществлялось в ВИР под руководством Е.Н. Синской с 1921 года, капустных культур — под руководством Т.В. Лизгуновой с 1926 года. Результатами этих исследований стали монографии, в которых была описана классификация, особенности изменчивости признаков, характеристики сортов и сортотипов, генетические основы селекции (2-5).
Происхождение, эволюция и филогенетические отношения шести представителей рода Brassica, входящих в треугольник U (треугольник
* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-90104-Мол_а. 100
Brassica) — B. nigra (L.) Koch., B. oleracea L., B. rapa L., B. napus L., B. juncea (L.) Czern., B. carinata A. Braun в целом определены. N. U (6) предложил графическое изображение их филогенетических взаимоотношений, когда аллотетраплоидные формы образуют стороны треугольника и находятся между слагающими их диплоидными формами, расположенными на вершинах треугольника. Согласно N. U, B. napus (AACC, 2n = 4* = 38), B. juncea (AABB, 2n = 4* = 36) и B. carinata (BBCc, 2n = 4* = 34) произошли при естественной межвидовой гибридизации между парами диплоидных видов — соответственно B. rapa (AA, 2n = 2* = 20) * B. oleracea (CC, 2n = 2* = 18), B. rapa * B. nigra (BB, 2n = 2* = 16) и B. nigra * B. oleracea.
Степень морфологической вариации этих культивируемых видов огромна. Однако таксономическое положение некоторых диких представителей рода, а также внутривидовых таксонов у капусты огородной B. oleracea и репы B. rapa остается предметом дискуссии (7-9). Так, крупнейший современный ботаник и систематик семейства Brassicaceae C. Gomez-Campo (7) разделил виды рода Brassica на два подрода: Brassica (27 видов) и Brassicaria (Godr.) Gomez-Campo (11 видов). В подрод Brassica входят пять секций: Brassica, Rapa (Miller) Salmeen, Micropodium DC, Brassicoides Boiss. и Sinapistrum Willkomm. Секция Brassica объединяет капусту огородную B. oleracea, капусту абиссинскую B. carinata (n = 17, геном ВС), а также родственные капусте огородной средиземноморские виды (n = 9, геном С). Предполагается, что гены последних интрогрессировали в вид B. oleracea и, следовательно, в становлении различных культурных разновидностей капусты участвовали дикие виды — B. cretica Lam., B. incana Ten, B. rupes-tris Rafin, B. macrocarpa Guss., B. montana Pourret, B. villosa Raimondo and Mazzola, B. insularis Moris., B. hilarionis Post., B. botteri Vis. В то же время T. Gladis и K. Hammer (9) включают их в вид B. oleracea в ранге подвидов. Неясно таксономическое положение близких таксонов, предварительно описанных как виды, — B. alboglabra Bailey и единственного дикого вида на территории бывшего СССР, эндемика Крыма B. taurica Tzvel. Большинство исследователей относят B. alboglabra к B. oleracea, а B. taurica — к B. incana в ранге подвидов (8, 10). До сих пор остается неизвестным происхождение капусты Турнефора B. tournefortii Gouan. (n = 10).
Секция Rapa объединяет репу B. rapa, рапс B. napus и горчицу са-рептскую B. juncea. Вид B. rapa L. включает важные масличные, овощные и кормовые культуры, листовые и корнеплодные и широко распространен на земном шаре. Вид представлен столь огромным разнообразием форм, возникшим в процессе эволюции и доместикации, что многие внутривидовые таксоны имели в предыдущих классификациях ранг видов (11, 12). G. Olsson (13), доказав свободную скрещиваемость по Бейли (11) и общую кариологию, объединил их в один вид — B. rapa. Последние классификации вида (8, 9, 14) все еще носят предварительный характер из-за недостаточности знаний о происхождении, становлении и внутривидовых взаимоотношениях и требуют доработки на основе молекулярно-генетиче-ских исследований, которые также позволяют устанавливать факторы, вли-яющие на частоту и спектр генотипической изменчивости и определяющие морфобиологические вариации у видов рода Brassica.
В целом триба Brassiceae содержит примерно 240 видов, включая виды рода Brassica. Различные методы анализа позволили разделить виды Brassica на две эволюционные ветви: B. nigra (В геном) и B. rapa (A)/B. oleracea (С), которые генетически обособились 7,9 млн лет назад. Геном A произошел от уже сформированного генома С 3,3-4,0 млн лет назад. Ге-
номная редукция, ставшая результатом делеций, была обнаружена в трип-лицированных блоках B. oleracea, B. rapa и B. napus при сравнении с соответствующими геномными районами Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Примерно у Уэ генов Brassica имеются гомологи в соответствующих областях генома арабидопсиса. Однако геном Brassica содержит намного больше транспозоноподобных последовательностей и псевдогенов.
Полиплоидия, столь широко представленная в роде Brassica, играет одну из основных ролей в эволюции растительных геномов (15). Подобный факт, вероятно, объясняется тем, что полиплоидизация не только приводит к определенному увеличению генома относительно предшествующего, но также сопровождается связанными с этим структурными и функциональными модификациями, которые, несомненно, представляют собой важный источник новообразований (16, 17). Недавние исследования продемонстрировали, что геном формирующихся полиплоидов, как правило, нестабилен, динамичен и к тому же подвержен влиянию генетической и эпигенетической регуляции (18, 19). Одним из факторов, определяющих такое состояние, могут быть мобильные генетические элементы, придающие хозяйскому геному растений пластичность, столь необходимую для адаптации организма к стрессорам.
Мобильные генетические элементы (МГЭ) были описаны 60 лет назад у кукурузы. По механизму перемещения (наличие или отсутствие промежуточной РНК при транспозиции) их подразделяют на два класса: к I классу относятся ретротранспозоны, у которых перемещение происходит через образование РНК-посредника с использованием обратной транспо-зазы для его перевода в ДНК, ко II — ДНК-транспозоны, осуществляющие транспозицию напрямую от ДНК к ДНК. Наши исследования посвящены МГЭ II класса. Первым детально исследованным мобильным элементом стал Activator (Ac) (20, 21). Ас — просто устроенный и сравнительно небольшой (всего 4565 п.н.) автономный мобильный элемент, содержащий концевые инвертируемые повторы (TIR — terminal inverted repeats) длиной 11 п.н., у которых самые дальние от середины нуклеотиды некомплементарны (22). Благодаря размеру, структурной организации и последовательности нуклеотидов в TIR Ас имеет значительное сходство с элементом Tam3 у Antirrhinum majus (23), а также с hobo и P элементами у Drosophila melanogaster (24, 25). Нуклеотидный состав Ас тенденциозен. Так, содержание G + C на участках размером 240 п.н. с 5'- и 3'-конца составляет соответственно 45 и 40 %. В противоположность этому доля G + C в длинной нетранслируемой последовательности равна 68 %, а в кодирующей части элемента — 38 % (26). Столь невыравненная нуклеотидная композиция разных сегментов Ас отражает их неодинаковые функции. Кроме того, многочисленные CpG мотивы на концах Ас могут означать, что эти последовательности защищены белками (возможно, всегда), поскольку многие из них содержат сайт узнавания транспозаз (27, 28).
Следующий МГЭ II класса, который контролирует транспозицию мобильных элементов семейства Mutator (Mu) у кукурузы, — MuDR. Американские ученые установили, что существуют два основных MuDR-гомологичных транскрипта, наличие которых коррелирует с активностью элементов Mu. Все активные формы Mutator содержат MuDR. Например, у типичных Mu-форм имеется от 5 до 30 таких элементов (29), хотя у некоторых был обнаружен всего один элемент MuDR (30, 31). В однокопий-ных линиях элиминация MuDR приводит к потере активности элемента Mutator (30). Мультикопийные Mu-формы, спонтанно утратившие активность, продолжают сохранять в геномах элементы MuDR (32, 33). Несмотря
на присутствие MuDR, инактивированные линии не экспрессируют транскрипты MuDR (29). Следовательно, такие транскрипты могут кодировать белки, необходимые для транспозиции элементов Mu (34). Именно поэтому мы остановили выбор на MuDR для дизайна одного из классов праймеров.
Сходством с транспозазами Mutator обладают FHY3 (far-red elongated hypocotils 3) и FAR1 (far-red impaired response) — гомологичные белки, необходимые для контролируемого фитохромом А ответа на воздействие светом дальней красной области спектра (X и 730 нм) у Arabidopsis thaliana (35, 36). В геноме арабидопсиса существуют 12 дополнительных сопутствующих генов FHY3/FAR1. У полипептидов из этого семейства длина варьирует от 531 до 851 аминокислоты и в молекуле по всей длине от 12,0 до 82,4 % позиций представлены идентичными аминокислотами. Проработка существующих баз данных и филогенетический анализ позволили установить, что последовательности, схожие с последовательностями генов FHY3/FAR1, имеются у разных покрытосеменных растений. Они подразделяются на несколько филогенетических кластеров, перемежающихся семейством Mutator, кодирующим транспозазы, и подобными им последовательностями (36).
К характерным особенностям одной из групп транспозонов II класса, получивших название элементов САСТА, относится наличие наиболее отдаленных от середины инвертированных концевых повторов (TIR) длиной обычно 10-28 п.н., которые заканчиваются консервативным мотивом 5'-САСТА-3'. При этом внутренние последовательности элементов САСТА высоковариабельны. Кроме того, указанная группа МГЭ II класса перед инсерцией обычно образует целевой сайт дупликации из 3 п.н. Субконце-вые повторы, как правило, служат местом связывания транспозаз и совместно с концевыми инвертированными повторами действуют как cis-элементы транспозонов (37, 38). Впервые элементы САСТА обнаружили в 1953 году у кукурузы (39). Это были En (Enhancer)-I (Inhibitor) и Spm (Suppressor-Mutator)-dspm МГЭ. С тех пор подобные элементы нашли у львиного зева (38), сои (40), моркови (41), сорго (42), петунии (43), гороха (44), риса (45) и арабидопсиса (46).
Следует отметить, что, несмотря на столь обширный материал баз данных и множество опубликованных результатов, среди видов растений, изученных на наличие упомянутых выше МГЭ II класса, нет представителей рода Brassica. Исключение составляет A. thaliana с полностью секвени-рованным геномом (www.arabidopsis.org), у которого ранее были обнаружены элементы Far1 и САСТА. Однако роды Arabidopsis и Brassica относятся к разным трибам семейства.
Сравнительный анализ, проведенный с привлечением методов биоинформатики, показал, что геномы модельного растения A. thaliana L. и капусты огородной B. oleracea L. (n = 9, геном СС), от которого произошел вид B. rapa, несут одни и те же мобильные элементы, хотя и в разных соотношениях, обусловленных в том числе различиями в размере генома (47). Этот результат соответствует высокой степени геномного консерватизма у двух видов, дивергировавших 15-20 млн лет назад (48). У Arabidopsis, который содержит все известные типы мобильных элементов, геном полностью секвенирован (49), тогда как у Brassica до сих пор только очень малая часть таких элементов изучена на молекулярном уровне, при этом главным объектом исследования были МГЭ I класса. Ранее установлено, что в геноме B. oleracea среди МГЭ II класса наиболее широко распространены элементы САСТА (47). В роде Brassica САСТА транспозон Bot1 прошел несколько раундов амплификации только в геноме B. oleracea в отличие от генома B. rapa, что сыграло главную роль в недавней диверген-
ции двух геномов (50). Теми же авторами выявлен специфичный для С-генома сегмент Bot1. В геномах B. rapa и B. napus (AACC) они обнаружили присутствие Bot1-подобных элементов САСТА, определили их размер и идентифицировали TIR-последовательности. В наших исследованиях с помощью S-SAP анализа (sequence-specific amplification polymorphism) удалось установить, насколько широко Bot1-подобные элементы CACTA распространены в геноме B. rapa, и было показано, что полученные на основе их последовательностей специфичные маркеры можно использовать для уточнения внутривидовой классификации B. rapa. Кроме того, эти эксперименты продемонстрировали эффективность совместного применения двух типов молекулярных маркеров, созданных на основе различных групп повторяющихся последовательностей ДНК (тандемно организованных микросателлитов и дисперсно покрывающих геном мобильных элементов САСТА) для филогенетических построений у вида B. rapa (51).
Целью настоящей работы было установление наличия в геномах видов рода Brassica последовательностей, схожих с мобильными генетическими элементами II класса — Ас, MuDR, Far1 и CACTA. Это позволяет глубже раскрыть генетическую природу изменчивости, филогенетического родства и механизмов эволюции видов, что Н.И. Вавилов относил к основным задачам генетико-селекционного изучения коллекций генетических ресурсов.
Методика. Исследование проводили на генетически и морфологически разнообразных представителях четырех из пяти секций подрода Brassica. Всего было изучено 45 образцов из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР), включая горчицу полевую Sinapis arvensis L., содержащую геном S.
ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, которая содержала Трис-HCl (66 мЫ, pH 8,4), сульфат аммония (16 iM), хлорид магния (2 мУ), Tвин 20 (0,1 %), глицерин (7 %), бычий сывороточный альбумин (100 мкг/мл), dNTP (по 0,2 !M), праймер (для каждого по 5 nM) и 1,25 ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили в следующих условиях: денатурация при 95 °С (1 мин), элонгация при 72 °С (1 мин), температура отжига и число циклов амплификации — оптимизированы в зависимости от эксперимента (52-54) (амплификатор C1000 фирмы «BioRad», США); электрофоретический маркер молекулярных масс — 100 kb Ladder («Gibco BRL», Великобритания, «Fermentas», Литва). Праймеры были гомологичны участкам последовательности Ас и MuDR в геноме кукурузы, а также Far1 и CACTA — в геноме арабидопсиса. Для Ас использовали праймеры (соответственно прямые и обратные) E16 (5'-AAT CCC GTA CCG ACC GTT ATC-3') и E17 (5'-AGA GAG GCA GAG CAG CGT TC-3'), E15 (5'-CAG GGA TGA AAG TAG GAT GGG A-3') и D3 (5'-GAA ACG GTC GGG AAA CTA GCT C-3'), E20 (5'-TGA CAG ATG AGC CTT GGT TGT AAT-3') и E21 (5'-CGA ACG GGA TAA ATA CGG TAA TCG-3'), D2 (5'-CCC GTC CGA TTT CGA CTT T-3') и E22 (5'-TTA ACT TGC GGG ACG GAA AC-3'); для MuDR (соответственно прямые и обратные) — D12 (5'-GGT TGA AGC AGT TAA GGC CTC A-3') и D13 (5'-ATG CTA TTC AAG AAA TGA GGA GGC-3'), D14 (5'-TCA TCT ACG GAA GGG TTG TC-3') и D15 (5'-GGT CGT TTA TCT CTT CGA ACC TGT-3'), E4 (5'-CGC GGT ATT TGT TGC TGA GA-3') и E5 (5'-TTG CTG AGA AGG AGG CCA AG-3'), E6 (5'-CCT CAT CGA ATG TGG TAT GGA TTA-3') и E7 (5'-TTT CCC ATA GCT CTG GAT CTT CTG-3'); для Far1 (соответственно прямые и обратные) — D10 (5'-CAT GGC TTG CTG ATT CGT GAA-3') и D11 (5'-TTG GGC AGA ACT CAA ATG CTC-3'), E11 (5'-TCG GCA TGC TTT GAT GAT TC-3') и E13 (5'-TGG TTG CAA GCT CTG TTG AGA-3'); для САСТА — D5 (5'-
CCC TTG GTT GTG CAT GAA GA-3') (прямой), а также D6 (5'-GCA CCT GAC GCA TCC AGA A-3') и D7 (5'-AGC AGT GCG GCT CTC ATA GG-3') (обратные).
Результаты. В качестве объектов изучения отобрали достаточно разнообразных генетически представителей четырех из пяти секций подрода Brassica, в том числе полиплоидных (табл. 1).
Для выполнения молекулярно-генетического анализа с применением ПЦР нами были сконструированы праймеры, гомологичные 5'- и 3'-области последовательности Ас в геноме кукурузы (52), а также участкам из области MudrB (53) МГЭ MuDR, имеющимся в базе данных GenBank (Na-
1. Образцы рода Brassica L., исследованные на наличие последовательностей, схожих с МГЭ II класса, и использованные при этом праймеры (мировая коллекция ВИР, Всероссийский НИИ растениеводства)
№ по каталогу ВИР
Название
Происхождение | Набор пар праймеров
Капуста огородная Brassica oleracea L. (геном C) Белокочанная B. oleracea convar. capitata var. capitata f. alba
Белоснежка Украина D5-D7, E16-E17
Русиновка Беларусь D5-D7, E16-E17
Краснокочанная B. oleracea convar. capitata var. capitata f. rubra
Herbst rot Германия D5-D7, E16-E17
Late Winter Нидерланды D5-D7, E16-E17
Савойская B. oleracea convar. capitata var. sabauda Hammer Нидерланды
Chieftain Savoy Канада
Кольраби B. oleracea convar. acephala var. gongylodes Kashmere Пакистан D5-D7, E16-E17
Knaufs Ideal Германия D5-D7, E16-E17
к-2418
к-2516
к-172 к-173
к-328
к-346
к-231
к-279
к-151
к-362
к-363
к-592
к-609
к-285
к-292
D13-D14, D5-D7, E16-E17 D5-D7, E16-E17
Брюссельская B. oleracea convar. acephala var. gemmifera
Pilar F1 Нидерланды
Листовая B. oleracea convar. acephala var. acephala Пальмира Россия
Краски Востока Россия
Цветная B. oleracea convar. botrytis var. botrytis Отечественная Россия
Cambridge 6 Великобритания
Брокколи B. oleracea convar. botrytis var. italica Clipper F1 Нидерланды
Emerald city Fj Япония
D5-D7, E16-E17
D5-D7, E16-E17 D13-D14, D5-D7, E16-E17
D5-D7
D5-D7,
D5-D7
D5-D7
E16-E17
Средиземноморские виды, родственные B. oleracea L. (геном С)
вр. 2 к-6587 к-6343 к-7356
вр. 9
к-312
к-117
к-591
к-264
к-415
к-437
к-679
к-4719
к-4721
к-4920
к-4963
к-4619
к-4630
к-4667
к-4512
к-2666
к-2669
T)
B. incana Германия
B. villosa Италия
B. cretica Италия
B. insularis Италия
B. tournefortii Gouan. (геном Капуста Турнефора Франция
B. rapa L. (геном А)
Капуста пекинская B. rapa ssp. pekinensis Hanelt Ducre Корея
Капуста розеточная B. rapa ssp. rosularis Hanelt Cяо-байе-тацай Китай
B. napus L. (геном AC)
Брюква B. napus rapifera Мустиала Швеция
Гофманская белая Германия
Бангольмская Германия
Вышегородская Россия
Куузику Эстония
Рапс B. napus oleifera Metzg. f. annua, Juvel Швеция
f. annua, Westar Канада
f. annua, Ратник Россия
f. biennis, Polo Польша
Горчица сарептская B. juncea (L.) Czern. Тавричанка 10 Россия
Yalisko Мексика
Siromo Австралия
Суздальская Россия
Горчица черная B. nigra (L.) Koch. (геном Местная Франция
Дания
D5-D7, E16-E17 D5-D7 D5-D7 D5-D7
E11-E14, D5-D7
D5-D7
D5-D7
D5-D7
D5-D7
D5-D7
E11-E14,
D13-D14,
D5-D7,
D5-D7
E16-E17
E16-E17
E11-E14, D5-D7 E11-E14, D5-D7 E11-E14, D5-D7 D5-D6, D5-D7 (геном AB)
E11-E14, D5-D6, D5-D7 D13-D14, E11-E14, D5-D6 D13-D14, D5-D6, D5-D7 E11-E14, D5-D6, D5-D7 В)
E11-E14, D5-D7 E11-E14, D5-D6, D5-D7
Продолжение таблицы 1 к-2671 Местная Германия E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-2673 Alaska Австралия E11-E14, D5-D6, D5-D7
Капуста абиссинская B. carinata R. Braun (геном ВС) к-4517 BCRIDA - 171 Индия E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4676 Местная 3/10 Эфиопия E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4677 Местная 10/5 Эфиопия E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4704 BRA 1031/79 Австралия E11-E14, D5-D6, D5-D7
Синтетический гексаплоид B. composita (геном ABC) к-4 Россия D5-D7
Горчица полевая Sinapis arvensis L. (геном S)
_________вр. 11_________ Франция D5-D6, D5-D7
Примечание. МГЭ — мобильные генетические элементы. Праймеры соответствуют приведенным в таблице 2, с которыми у указанного генотипа получена амплификация. Пропуски означают, что название отсутствует.
tional Center for Biotechnology Information — NCBI). Дополнительно аналогичным образом создали праймеры, которые использовались при изучении последовательностей Far1 и CACTA (54).
Проведенное изучение показало достаточно высокую степень межвидового полиморфизма между членами рода Brassica и близкого рода Sinapis. Всего наблюдали 19 полиморфных фрагментов (табл. 2) при размере ам-плифицированных от 150 до 1000 п.н. Были обнаружены фрагменты, видоспецифичные для всех естественных форм, содержащих В-геном: ампли-коны размером 150 п.н., полученные с праймерами E11-E14, и 200 п.н. — с D5-D6, а также фрагменты, свойственные только исходному диплоидному виду (горчица черная, геном В), длиной 270, 330 и 520 п.н., полученные с праймерами E11-E14. В то же время синтетический гексаплоид B. composita (геном АВС) содержал только фрагмент, присутствующий у всех исследованных образцов рода Brassica и у горчицы полевой Sinapis arvensis (геном S) (200 п.н., праймеры D5-D7).
2. Частота встречаемости амплифицированных фрагментов ДНК МГЭ II класса у образцов родов Бга$$1еа Ь. и БіплрІ$ Ь. с разными геномами (мировая коллекция ВИР, Всероссийский НИИ растениеводства)
Пара прай- Размер ампли- Число образцов, несущих аллель/общее число образцов с указанным геномом
меров кона, п.н. А В С АВ АС ВС АВС T S
культурные | дикие
D13-D14 320 - - - - 2/4 1/9 - - - -
E11-E14 150 - 4/4 - - 3/4 - 4/4 - - -
270 - 2/4 - - - - - - - -
330 - 2/4 - - - - - - - -
400 - - - - 3/4 4/9 - - - -
520 - 4/4 - - - - - - - -
620 - - - - - - - - 1/1
1000 - 4/4 - - 1/4 - 2/4 - - -
D5-D6 200 - 3/4 - - 4/4 - 4/4 - - -
280 - - - - - - - - - 1/1
480 - - - - - - 2/4 - - -
820 - 3/4 - - - - - - - -
D5-D7 200 2/2 4/4 15/15 4/4 4/4 9/9 4/4 1/1 1/1 1/1
320 - - - 1/4 - 1/9 - - - -
400 - - - 1/4 1/4 4/9 - - - -
550 - - 12/15 4/4 1/4 4/9 - - 1/1 -
E16-E17 150 200 - - 2/15 1/15
370 - - 12/15 1/4 - 2/9 - - - -
Примечание. МГЭ — мобильные генетические элементы. Прочерки означают, что ампликоны соответствующего размера не выявлялись.
Отмечался фрагмент (550 п.н., праймеры Б5-Б7), свойственный подавляющему большинству членов видов с геномом С — капусте огородной, родственным ей диким средиземноморским видам и капусте Тур-нефора (В. іоигпв/огііі, геном Т). Такой же фрагмент наблюдали у полови-
ны образцов рапса и брюквы с геномом АС. В то же время указанный фрагмент нельзя считать специфичным для генома С, поскольку у образцов капусты абиссинской с геномом ВС он не выявлялся. Однако этим подтверждается известное заключение о близости геномов А и С и удаленности от них генома В. У некоторых разновидностей вида капусты огородной (например, у образца кольраби из Пакистана) обнаруживались редкие аллели, но насколько они специфичны для названных ботанических таксонов, предстоит выяснить в дальнейшем. Наличие общего фрагмента (370 п.н., праймеры E16-E17) у средиземноморского вида B. incana и некоторых образцов культурных разновидностей капусты огородной и рапса может свидетельствовать об участии B. incana в их формировании, возможно, в результате интрогрессии генетического материала вида в предковую форму B. oleracea. По результатам наших исследований можно отметить отдельное положение капусты Турнефора как вида и предположить две возможности его происхождения: вследствие интрогрессии генетического материала комплекса B. oleracea/B. rapa в геном горчицы черной
B. nigra или наоборот. У капусты Турнефора мы не нашли фрагментов, общих для видов, содержащих В-геном, но обнаружили ампликон, присущий многим С-геномным видам. Фрагменты, которые были бы маркерными для генома А, выявить не удалось. Имелся фрагмент, специфичный только для горчицы полевой (280 п.н., праймеры D5-D6). На электрофоретических профилях амплифицируемые фрагменты чаще были представленные одной, редко двумя, еще реже — тремя-четырьмя полосами, то есть полиморфизм был низким.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о наличии в геномах представителей всех изученных видов рода Brassica последовательностей, схожих с МГЭ II класса (Ас, MuDR, Far1, CACTA).
Как уже отмечалось, объем сведений о транспозоноподобных последовательностях и псевдогенах у Brassica незначителен, а имеющаяся информация достаточно противоречива. Согласно недавним филогенетическим исследованиям, у шести видов рода Brassica удалось различить кластеры Ty1/copia и LINE-подобных элементов, а третий кластер оказался подразделен на Ty3/gypsy, Attila и вирусоподобные ветви, подтверждая, что многочисленные подветви внутри этой группы могут рассматриваться как gypsy-подобные элементы растений (55). Дендрограммы не дали ветвей, коррелирующих с известными геномными взаимоотношениями видов Brassica (возможно, потому, что члены семейств изученных элементов были представлены в общем предке Brassica в отличие от других повторяющихся последовательностей). Здесь вероятна также конвергентная эволюция или горизонтальный перенос. Полученные результаты о последовательностях ретроэлементов не позволили K. Alix с соавт. (55) сделать выводы о филогении рода, хотя Саузерн-гибридизация подтвердила, что у отдельных видов некоторые подсемейства ретроэлементов могут быть амплифициро-ваны. Другие авторы (56) предприняли исследование по идентификации и характеристике основных повторов в центромерном и перицентомерном гетерохроматине у вида B. rapa. Были идентифицированы три копии цен-тромер-специфичных ретротранспозонов Brassica (CRB), вариабельные пе-рицентромер-специфичные ретротранспозоны (PCRBr), а также 24 копии центромерных повторов (CentBr) размером І76 п.н. Выявлена мозаичная структура, состоящая из девяти PCRBr и широких блоков тандемных повторов (TR238). Определено, что CRB — главный компонент всех центромер диплоидных и аллотетраплоидных видов Brassica. Однако центромерные повторы (CentBr) не были найдены в наиболее отдаленном из про-
анализированных родственных видов — B. nigra. Показано, что PCRBr и TR238 — главные компоненты перицентромерных гетерохроматиновых блоков четырех хромосом B. rapa. Эти повторяющиеся элементы не идентифицированы у B. oleracea и B. nigra, что свидетельствует об их специфичности для А-генома.
Однако все перечисленные МГЭ не относятся к тем МГЭ II класса, которые мы изучили, что позволяет считать проведенные нами исследования приоритетными. Кроме того, на основании результатов, полученных в наших экспериментах, можно сделать вывод о том, что амплифицирован-ные последовательности МГЭ II класса благодаря разнообразию и распространенности в геномах у видов рода Brassica полезны при разработке молекулярных маркеров, в частности S-SAP (5І), а S-SAP-маркеры могут напрямую использоваться для анализа генетического разнообразия видов рода Brassica, геномного картирования и филогенетических построений. К сожалению, из-за низкого полиморфизма не представляется возможным построение филогенетического древа, определяющего ботанико-систематические связи культурных и диких видов рода Brassica, на основе электрофоретического анализа ПЦР-ампликонов. В дальнейшем предстоит установить степень гомологии ПЦР-амплифицированных последовательностей с последовательностями известных МГЭ II класса, в том числе тех, на основе которых разрабатывались праймеры, использованные нами в работе.
Итак, в настоящей работе приведены результаты ПЦР-оценки распространения и полиморфизма маркеров на основе элементов Ас, MuDR, Far1 и CACTA у образцов, представляющих виды семейства Brassicaceae L. в мировой коллекции ВИР, в связи с обсуждением их филогении, эволюции и полиплоидии. Рассмотрена генетическая нестабильность геномов у видов рода Brassica и перспективы использования первичных нуклеотидных последовательностей, схожих с мобильными генетическими элементами (МГЭ) II класса (Ас, MuDR, Far1 и CACTA), при создании молекулярных маркеров для анализа генетического разнообразия культур модельного семейства Brassicaceae L. Этот подход может быть применен при изучении других семейств, что позволит глубже понять генетическую природу изменчивости, молекулярные механизмы эволюции видов и их филогенетическое родство.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вавилов Н.И. Ботанико-географические основы селекции (Учение об исходном материале в селекции). Теоретические основы селекции. Т. 1. Общая селекция растений /Под ред. Н.И. Вавилова. М.-Л., 1935.: 17-74.
2. Синская Е.Н. Масличные и корнеплоды семейства Cruciferae. Тр. по прикл. бот., ген. и сел., 1928, 19(3).
3. Шебалина М.А. Репа, турнепс и брюква. Л., 1974.
4. Лизгунова Т.В. Культурная флора. Т. 11. Капуста. Л., 1984.
5. Шеб алина М.А., Сазонова Л.В. Корнеплодные растения. Культурная флора СССР. Л., 1985.
6. U N. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. Jap. J. Bot., 1935, 7: 389-452.
7. Gomez-Campo C., Prakash S. Origin and domestication. In: Biology of Brassica coe-nospecies /C. Gomez-Campo (ed.). Amsterdam-Lausanne-New-York-Shannon-Singapore-Tokyo, Elsevier Press, 1999: 33-58.
8. Specht C.E., Diederichsen A. Brassica. In: Mansfeld’s encyclopedia of agricultural and horticultural crops. V. 3. /P. Hanelt (ed.). Berlin, Springer-Verlag, 2001: 1435-1465.
9. Gladis T.H., Hammer K. Die Gaterslebener Brassica-Kollektion — Brassica juncea, B. napus, B. nigra und B. rapa. Feddes Reportium, 1992, 103: 469-507.
10. Snogerup S. The wild forms of Brassica oleracea group (2n = 18) and their possible relations to the cultivated ones. In: Brassica crops and wild allies /S. Tsunoda, K. Hinata, C. Go-
mez-Campo (eds.). Tokyo, Japan Sci. Soc. Press, 1980: 121-132.
11. Bailey L.H. The cultivated Brassicas. Genets. Herbarum, 1940, 4(9): 319-330.
12. Синская E.H. Историческая география культурной флоры. Л., 1969.
13. Olsson G. Crosses within the campestris group of the genus Brassica. Hereditas, 1954, 40: 398-418.
14. Hanelt P. Cruciferae. Rudolf Mansfelds Verzeihnis landwirtschaftlicher und gartnerischer Kulturpflanzen (ohne Zierpflanzen) /J. Schultze-Motel (ed.). Berlin, Academie-Verlag, 1986: 272-332.
15. W e n d e l J.F. Genome evolution in polyploids. Plant Mol. Biol., 2000, 42: 225-249.
16. Otto S.P., Whitton J. Polyploid incidence and evolution. Annu. Rev. Genet., 2000, 34: 401-437.
17. A d a m s K.L., W e n d e l J.F. Polyploidy and genome evolution in plants. Cur. Opin. Plant Biol., 2005, 8: 135-141.
18. Albertin W., Balliau T., Brabant P. et al. Numerous and rapid nonstochastic modifications of gene products in newly synthesized Brassica napus allotetraploids. Genetics, 2006, 173: 1101-1113.
19. Wang J., Wang J., Tian L., Lee H.S., Wei N.E., Jiang H., Watson B., Madlung A., Osborn T.C., Doerge R.W., Comai L., Chen Z.J. Genome-wide non-additive gene regulation in Arabidopsis allotetraploids. Genetics, 2006, 172: 507-517.
20. McClintock B. Mutable loci in maize. Carnegie Institution of Washington Year Book, 1951, 50: 174-181.
21. M c C l i n t o c k B. Mutable loci in maize: Origins of instability at the A1 and A2 loci. Instability of Sh1 action induced by Ds. Carnegie Institution of Washington Year Book, 1952, 51: 212-219.
22. Pohlman R.F., Fedoroff N.V., Messing J. The nucleotide sequence of the maize controlling element Activator. Cell, 1984, 37: 635-643.
23. Hehl R., Nacken W.K.F., Krause A., Saedler H., Sommer H. Structural analysis of Tam3, a transposable element from Antirrhinum majus, reveals homologies to the Ac element from maize. Plant Mol. Biol., 1991, 16: 369-371.
24. O ’ H a r e K., Rubin G.M. Structures of P transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome. Cell, 1983, 34: 25-35.
25. S t r e c k R.D., Macgaffey J.E., Beckendorf S.K. The structure of hobo transposable elements and their insertion sites. The EMBO J., 1986, 5: 3615-3623.
26. Kunze R., Starlinger P., Schwartz D. DNA methylation of the maize transposable element Ac interferes with its transcription. Mol. Gen. Genet., 1988, 214: 325-327.
27. Kunze R., Starlinger P. The putative transposable element Ac from Zea mays L. interacts with subterminal sequences of Ac. The EMBO J., 1989, 8: 3177-3185.
28. Coupland G., Baker B., Schell J., Starlinger P. Characterization of the maize transposable element Ac by internal deletions. The EMBO J., 1988, 7: 3653-3659.
29. Hershberger R.J., Warren C.A., Walbot V. Mutator activity in maize correlates with the presence and expression of the Mu transposable element Mu9. PNAS USA, 1991, 88: 10198-10202.
30. Chomet P., Lisch D., Hardeman K.J., Chandler V.L., F r e e l i n g M. Identification of a regulatory transposon that controls the Mutator transposable element system in maize. Genetics, 1991, 129: 261-270.
31. Qin M., Robertson D.S., Ellingboe A.H. Cloning of the Mutator transposable element MuA2, a putative regulator of somatic mutability of the a1-Mum2 allele in maize. Genetics, 1991, 129: 845-854.
32. Greene B., Walko R., Hake S. Mutator insertions in an intron of the maize knottedl gene result in dominant suppressible mutations. Genetics, 1994, 138: 1141-1150.
33. Martienssen R., Baron A. Coordinate suppression of mutations caused by Robertson’s Mutator in maize. Genetics, 1994, 136: 1157-1170.
34. Hershberger R.J., Benito M.I., Hardeman K.J., Warren C., Chandler V.L., W a l b o t V. Characterization of the major transcripts encoded by the regulatory MuDR transposable element of maize. Genetics, 1995, 140(3): 1087-1098.
35. Hudson M.E., Lisch D.R., Quail P.H. The FHY3 and FAR1 genes encode transpo-sase-related proteins involved in regulation of gene expression by the phytochrome A-signaling pathway. Plant J., 2003, 34: 453-471.
36. Lin R., Wang H. Arabidopsis FHY3/FAR1 gene family and distinct roles of its members in light control of Arabidopsis development. Plant Physiol., 2004, 136: 4010-4022.
37. Do ring H.-P., Starlinger P. Molecular genetics of transposable elements in plants. Annu. Rev. Genet., 1986, 20: 175-200.
38. Nacken W.K.F., Piotrowiak R., Saedler H., Sommer H. The transposable element TAM-1 of A. majus shows structural homology to the maize transposon En/Spm and has no sequence specificity of insertion. Mol. Gen. Genet., 1991, 228: 201-208.
39. Peterson P.A. A mutable palegreen locus in maize. Genetics, 1953, 38(1): 682-683.
40. Vodkin L.O., Rhodes P., Goldberg R.B. A lectin gene insertion has the structural
features of a transposable element. Cell, 1983, 34: 1023-1031.
41. Ozeki Y., Davies E., Takeda J. Somatic variation during long term subculturing of plant cells caused by insertion of a transposable element in a phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene. Mol. Gen. Genet., 1997, 254: 407-416.
42. Chopra S., Brendel V., Zhang J., Axtell J.D., Peterson T. Molecular characterisation of a mutable pigmentation phenotype and isolation of the first active transposable element from Sorghum bicolor. PNAS USA, 1999, 96: 15330-15335.
43. Snowden K.C., Napoli C.A. PsI: a novel Spm-like transposable element from Petunia hybrida. Plant J., 1998, 14: 43-54.
44. S h i r s a t A.H. A transposon-like structure in the 5' flanking sequence of a legumin gene from Pisum sativum. Mol. Gen. Genet., 1988, 212: 129-144.
45. Motohashi R., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Identification of Tnr3, a suppressor-mutator/enhancer-like transposable element from rice. Mol. Gen. Genet., 1996, 250: 148-152.
46. Miura A., Yonebayashi S., Watanabe K., Toyama T., Shimada H., Ka-k u t a n i T. Mobilization of transposons by a mutation abolishing full DNA methylation in Arabidopsis. Nature, 2001, 411: 212-214.
47. Zhang X., Wessler S.R. Genome-wide comparative analysis of the transposable elements in related species Arabidopsis thaliana and Brassica oleracea. PNAS USA, 2004, 101: 5589-5594.
48. Yang Y.W., Lai K.N., Tai P.Y., Li W.H. Rates of nucleotide substitution in angiosperm mitochondrial DNA sequences and dates of divergence between Brassica and other angiosperm lineages. J. Mol. Evol., 1999, 48: 597-604.
49. AGI, Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 2000, 408: 796-815.
50. Alix K., Joets J., Ryder C.D. et al. The CACTA transposon Bot1 played a major role in Brassica genome divergence and gene proliferation. Plant J., 2008, doi: 10.1111/j.1365-313X.2008.03660.x.
51. Артемьева А.М., Будан X., Клоке Э., Чесноков Ю.В. Использование мобильных генетических элементов САСТА для уточнения филогенетических взаимоотношений внутри вида Brassica rapa L. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, 15(2): 398-411.
52. Дягилева А.В., Паша Л.И., Митин В.А., Туманова Л.Г., Артемьева А.М., Соловьева А.Е., Чесноков Ю.В. Мобильный элемент Activator в геноме Brassica? Мат. VIII Межд. симп. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М., 2009, т. I: 293-294.
53. Паша Л.И., Дягилева А.В., Митин В.А., Туманова Л.Г., Соловьева А.Е., Артемьева А.М., Чесноков Ю.В. Выявление MuDR-подобных последовательностей в геноме рода Brassica. Мат. VIII Межд. симп. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М., 2009, т. II: 213-215.
54. Соловьева А.Е., Ар т е м ь е в а А.М., Чесноков Ю.В. Идентификация последовательностей элементов Ac, MuDR, Far1 и CACTA в геномах видов рода Brassica. Мат. V съезда ВОГИС. М., 2009, ч. I: 329.
55. A l i x K., H e s l o p - H a r r i s o n J.S. The diversity of retroelements in diploid and allotet-raploid Brassica species. Plant Mol. Biol., 2004, 54: 895-909.
56. Lim K.B., Yang T.J., Hwang Y.J., Kim J.S., Park J.Y., Kwon S.J., Kim J., Choi B.S., Lim M.H., Jin M., Kim H.I., De Jong H., Bancroft I., Lim Y., P a r k B.S. Characterization of centromere and peri-centromere retrotransposons in Brassica rapa and their distribution in related Brassica species. Plant J., 2007, 49: 173-183.
ГНУ Всероссийский НИИ растениеводства Поступила в редакцию
им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии, 27 апреля 2012 года
190000 г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44, e-mail: [email protected]
CLASS II MGE-LIKE SEQUENCES IN GENOMES OF Brassica L. SPECIES
A.M. Artemyeva, A.G. Dubovskaya, A.E. Solov ’eva, Yu.V. Chesnokov
Summary
Basing on the literature data and own results, an unstability of genomes in species of Bras-sica genus is considered, and possibility to apply the class II mobile genetic elements-like nucleotide sequences, Ас, MuDR, Far1 and CACTA, for creation of molecular markers which could be used to evaluate genetic diversity is discussed. Using PCR, a distribution and polymorphism of markers based on Ас, MuDR, Far1 and CACTA elements are investigated in samples of Brassicaceae L. from the world collection of the N.I. Vavilov Institute of Plant Industry (VIR), with regard to their phylogeny.
