CC BY
30
576.852.22/24.095.1
ПОПЫТКА СТИМУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА И ОЧИСТКА ! - Г A JIА К Т О 3 И ДА 3 bl Str. lactis 192
Г. ЦИХОШ, Е. РЫМАШЕВСКИ, М. КУЯВСКИ
Институт технологии молочного дела Сельскохозяйственно-техническая академия в Ольштыне, Польша
Протеолитичеекая и сбраживающая активность молочно-кислых бактерий в значительной степени зависит от химического состава питательной среды, используемой для их размножения. Исследование пригодности ряда субстратов для культивации молочно-кислых бактерий показало [1], что лучшей является питательная среда из молока, частично гнд-ролизованного пепсином. Молочно-кислые бактерии, культивируемые па этой питательной среде, характеризовались самой высокой протеолитической и сбраживающей активностью, а также наибольшей выживаемостью клеток в процессе сублимационной сушки, распылительной сушки с применением адсорбентов влаги и при замораживании.
Доказано [2, 3], что существует возможность «управления» метаболизмом бактерий с помощью соответствующего подбора компонентов питательной среды. Биосинтез фермента может стимулироваться путем добавления в питательную среду субстрата данного фермента. В работах [3] по метаболизму Str. thermophilus отмечено, что ß-галактозидаза синтезируется в процессе культивации бактерий как в присутствии глюкозы, так и лактозы и галактозы, однако влияние отдельных сахаридов различно. Добавление лактозы или галактозы в логарифмической фазе роста клеток повышало активность ß-галактозидазы в 2—4 раза. В свою очередь, добавление глюкозы к питательной среде с лактозой снижало активность ß-галактозидазы примерно на 35%. Следовательно, глюкоза подавляла биосинтез фермента клетками Str. thermophilus 821.
Результаты работ [4, 5] указывают на существование различий между активностью ß-галактозидазы отдельных штаммов молочно-кислых бактерий. Эти различия охватывают оптимальные pH и температуру, термостабильность, а также влияние некоторых ионов на активность ß-галактозидазы.
Цель этой работы — оценить влияние добавления глюкозы и галактозы к питательной среде и предварительной очистки ферментных экстрактов на активность ß-галакто-зидазы Str. lactis 192.
В опыте использовали Str. lactis 192 из коллекции предприятия по производству молочных биопрепаратов «Биолакта» в г. Ольштыне. В качестве питательной среды применяли сыворотку из молока, частично гидролизованного пепсином по Рымашевскому [1]. обогащенную добавкой глюкозы или галактозы _(1%), минеральных солей (MnSCU, MgS04,
ZnS04 по 0,012%) и дрожжевым экстрактом (0,5%). Культуру вели в ферментере типа Biotec (модель 1601) емкостью 5 дм3 при температуре 30°С п pH 6,7. Избыток молочной кислоты нейтрализовали 25%-ным раствором NH4OH. Процесс культивации бактерий проводили до момента окончания фазы логарифмического роста. Биомассу отделяли от питательной среды с помощью центрифуги Шарплесса (Penwalt — Англия) при 5500 g, после чего трижды промывали стерильным
0,05 М натрий-фосфатным буфером pH 7.0, центрифугируя после каждой промывки указанным способом. Центрифугированную и промытую биомассу замораживали при —20°С, а затем дезинтегрировали механическим методом под давлением (дезинтегратор BiotexX-25 — Швеция). Дезинтегрированную биомассу мацерировали в течение 4ч в 0,05М патрнй-фосфатном буфере pH 7,0, а затем снова центрифугировали при 5500g в течение 15 мин (центрифуга Beckman J-21C), получая таким образом внутриклеточный экстракт и осадок клеточной стенки. Осадок мацернро-валп в течение 4ч в 2М NaCl, после чего центрифугировали указанным способом, получая экстракт клеточной стенки.
Очистку «сырых» экстрактов проводили по методу[6], применяя: а) осаждение охлажденным до —20°С ацетоном; б) высаливание 50% сульфатом аммония; в) диализ очищенных экстрактов, который проводили против
0,05 М натрий-фосфатного буфера pH 7,0 при 4°С (277 К) в течение 48 ч.
Оценка эффективности очистки «сырых» экстрактов включала оценку «сырых» экстрактов и полученных после каждого этапа очистки. Наряду с надосадочной жидкостью исследовали растворенный осадок. Характеристику проводили на основании следующих данных:
содержание белка по [7];
активность (3-галактозидазы по [2].
Из результатов следует, что активность р-галактозидазы, содержащейся во внутриклеточном экстракте и экстракте клеточной стенки Str. lactis 192, в значительной степени зависела от добавления глюкозы и галактозы к питательной среде [4].
При культивации Str. lactis 192 на питательной среде с добавкой галактозы отметили наибольший расход гидроокиси аммония и наибольшую степень сбраживания лактозы (табл. 1). Добавление галактозы к питательной среде повышало активность (3-галактози-дазы в экстракте клеточной стенки (табл. 2).' В свою очередь, активность р-галактозида-
Таблица 1
Содержание углеводов Расход
Питатель- при культиви- NH4OH.
ная среда ровании см3, во вре-
до |после мя культивирования
Без добавления сахаридов 5.20 4,20 355
С добавлением 1 %:
галактозы 6,20 3,24 410
глюкозы 6,20 4,38 380
зы во внутриклеточном экстракте была одинаковой при культивации Str. lactis 192 на питательной среде с добавкой галактозы и без добавления сахаридов.
Самую высокую активность ß-галактози-дазы отметили во внутриклеточном экстракте Str. lactis 192, культивируемых па питательной среде с добавкой глюкозы (табл. 2). Она в 2.4 раза превышала активность экстракта клеточной стенки этой же культуры и в 2,5 раза — активность экстракта клеточной стенки, полученного из биомассы, культивируемой на питательной среде с добавкой галактозы.
Активность ß-галактозндазы была самой низкой во внутриклеточном экстракте и экстракте клеточной стенки, полученных из биомассы, культивируемой на питательной среде без добавления сахаридов. Поэтому можно утверждать, что добавление глюкозы или галактозы к питательной среде стимулировало биосинтез ß-галактозндазы Str. lactis 192. Добавление глюкозы стимулировало биосинтез ß-галактозидазы в большей степени, нежели добавление галактозы, что отметили в обоих исследуемых экстрактах Str. lactis 192.
В связи с низкой активностью ß-галактозидазы экстрактов, полученных из биомассы, культивируемой на питательной среде без добавления сахаридов, эти экстракты не подвергали очистке.
Кроме глюкозы и галактозы, другие сахариды (фруктоза) и полисахариды могут влиять на биосинтез, фермента. Однако в молоке имеется только лактоза или же образовавшиеся в результате гидролиза глюкоза и галактоза (или один из этих сахаридов). Поэтому применение добавок указанных сахаридов к питательной среде было предметом исследований.
Следует отметить, что различия в расходе
гидроокиси аммония были следствием различной сбраживающей активности клеток анализируемого штамма, зависящей от вида сахарида.
Результаты ранних исследований [1, 5] показывают, что ионы аммония не влияют на биосинтез ß-галактозидазы. Однако путем обеспечения постоянного уровня pH они способствуют оптимальному росту клеток.
В дальнейшей части настоящей работы использовали экстракты из биомассы, культивируемой па питательной среде с добавлением сахаридов.
Предварительная очистка экстрактов клеточной стенки Str. lactis 192, культивируемых на питательной среде с добавлением глюкозы и галактозы (табл. 2), дала положительные результаты. Отметили значительное повышение активности ß-галактозидазы после осаждения экстрактов охлажденным ацетоном.
Для экстракта клеточной стенки Str. lactis
192, культивируемых на питательной среде с добавкой галактозы, осаждение ацетоном привело к повышению активности ß-галакто-зидазы, содержащейся в осадке, в 5,3 раза, тогда как высаливание сульфатом аммония в 57 раз повысило активность ß-галактозидазы в надоеадочной жидкости и в 2,6 раза снизило активность этого фермента в осадке (табл.2). Подобные изменения активности ß-галактозидазы наблюдали для экстракта клеточной стенки Str. lactis 192, культивируемых на питательной среде с добавкой глюкозы (табл. 2). Осаждение ацетоном повышало активность ß-галактозидазы, содержащейся в осад~ ке, в 1,4 раза, а высаливание сульфатом аммония снижало активность фермента в осадке. Иначе изменялась активность ß-галактозидазы, содержащейся в надоеадочной жидкости. После осаждения ацетоном активность фермента составляла 0,0061 мкМ ортонитрофенола, освобожденного из ONPG в течение 1 мин, а после высаливания сульфатом аммония она повысилась в 6 раз (до 0,0368 мкМ ортонитрофенола).
При очистке внутриклеточных экстрактов Str. lactis 1ц? положительные результа-
ты отметили только для экстракта из биомассы, культивируемой па питательной среде с добавкой галактозы (табл. 2), причем повышение активности ß-галактозидазы после осаждения ацетоном и высаливания сульфатом аммония было подобным, составляя примерно 30%. Сравнивая активность обеих фракций, полученных в процессе очистки рассматриваемого экстракта, следует отметить, что незначительная часть фермента (7,2% после осаждения ацетоном и 8,4% после высаливания сульфатом аммония) осталась в надоса-дочной жидкости (табл. 2).
Иначе изменялась активность фракций, полученных в процессе очистки экстракта клеточной стенки из биомассы, культивируемой на питательной среде с добавкой галактозы (табл. 2). Надосадочная жидкость после осаждения ацетоном содержала незначительное количество белка и характеризовалась следовой активностью ß-галактозидазы по сравнению с осадком. В свою очередь, после высаливания сульфатом аммония надосадочная жидкость содержала больше белка, а активность в пей ß-галактозидазы была примерно в 2 раза выше, чем в осадке. При очистке рассматриваемого экстракта активность ß-галактозидазы возрастала на 30% после осаждения ацетоном
tND СО
-і
0
w
Я «V
1 О
S’gsq
Я т Щ сг
л ■ • -*■
Я г: ■. ■ -,
да — -1'
м Е -S ■!
^ О Cü ^
pN &> ш CD
Е U Д >
Jfc4 Я (1? О
Со w
Ж ‘с н п> с 2 w о £ - .<
W
J=!
=^:
Л
■ а> го 5Q гг' “О S ь Со X М . ":
S^20 í: ц.
g -а я г «_. ” -- .—■ -ft <*>
, -I -
в
2 о S 'тз Of Т? _ <ь й т
Я •—- хз —
О СО JJ
О (V X,Г я ч
LJ н н TJ
О W О О л:
О 1 52 і
ib 43 сг — о
•0‘Л l_J 3 О "в- О S Д ГР н Я О ТЗ Д
г 2 - °
о' Е Р в
■■; Г, |*я£
■■ а> 9 .-ч
о н Я п>
— Í
CÓ ^
а\ я "і _■
¡* н О w to
Ы ° ^
OV § І
3 3
Я1 ^
СО СО
я со £ Р *
- VJ -
3S ■■■■- со
же “ ^
Ä« ■ (Х>
и— Ч
со о
О Я
сг. о
ся 21
::Ж1 =5
■■ ■_pi , “
и я -і ■ :
% я ф S JU гя ■ і ■.Ti . J
•-Í ф ? Г Г7 И Т ! п ■~| с.1 .О
Т a б л и її, a 2
Этап очистки
О
* ..
% *
О її
U VI.
^ ч
О си О VO
о
ÜJ
Активность ß-ra-лактозидазы, мкМ ортоиитро-фенола, освобсЖі из ONPG/мпн
Специфическая активность, мг белка/1 мкМ ортонитрофенола
О
Характеристика из биомассы,
«Сырой» экстракт Осаждение ацетоном
надосадочная , жидкость
растворенный
осадок
Высаливание осадка сульфатом аммония 50% надосадочная жидкость
растворенный
осадок
«Сырой» экстракт Осаждение ацетоном
надосадочная
жидкость
растворенный
осадок
Высаливание осадка сульфатом аммония 50% надосадочная жидкость
растворенный
осадок
внутриклеточного экстракта Sir. 1 act is 192 культивируемой па питательной среде
10
139 3,9 542,10 20
30
10
307 0,78 239,50 20
30
10
239 5,20 178,20 20
30
10
27 1,40 37,80 20
- ^0
10
37 0,80 $'] (¡0 20
30
100 2,10 210,00
217 1,60 347,20
50 2,24 112,00
10
20
30
10
20
30
10
20
30
..10:.
50 0,86 43,00 2G
30
10
50 1,72 N£00 20
30
С добавкой галактозы
65,00
130.00 173,33
141,82 283,64
312.00
0,0600
0,0300
0,0225
0,0055
0,0028
0,0025
0,0765
0,0423
0,0275
0,0075 ■ 0,0048 0,0038
254
105,88
196,36
294,54
186,67 294,/4 373,33
0,0895 8,94
0,0470 17,02
0,0313 25,56
С добавкой г л ю к о з ы
0,7500
0,3750
0,2500
0,0038
0,0094
0,0063
0,6750
0,3370
0,2250
0,1)468
0,0234
0,0156
0,6750
0,3370
0,2250
2,80
5,60
8,40
426,6І
170,75
256,00
3,32
6,65
9,96
18,38
-36,75
55,13
2,55
5,10
7,64
21
51
97
200
48
54
50
СХ, сО % р О (U о VO
Q-) й)
Н s
Я Е
О ев
о 8
é*
си я
и
п й>
и.
*=í Л
О О
С и
Активность ß-ra-лактозидазы, мкМ ортонитро-фенола, освобожд из ONPG/miih
Специфическая активность, мг белка/1 мкМ ортопптрофенола
Характеристика экстракта клеточной стенки Str. laetis 192 из биомассы, культивируемой на питательной среде
1,60 180,80
0,33 83,80
6,40 128,00
3,40
0,50
0,44
0,78
0,80
0,41
1,08
71,40
28,60
42,68
156
38,40
22,14
54,00
10
20
30
10
Ä°
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
10
20
30
0,0560
0,0280
0,0200
0,0038
0,0028
0,0025
0,3000'
0,1450
О.ОЩЗ
0,2150
0,1075
0,0716
0,1125
0,0562
0,0373і
0,3150
0.1720
0,1250
0,0019
0,0038
0,0050
0,4500
0,2250
0,1500
0,0262
0,0094
0,0075
0,4125
0,2062
0,1375
2 Ш
57.14 80,00
88,00
120,00
132,00
21,33
44.14 65,11
15,81 31,63 47,Щ
4,98
9,96
14,93
1,40
2.56 3,52
417,11
208,00
156,00
1,78
3.56 5,33
15335
43,76
54,67
2,62
5,24
7,85
о
■/О
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ, ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, №
и на 15% после высаливания сульфатом аммония.
Полученные результаты предварительной очистки ß-галактозидазы Str. lactis 192 в значительной мере совпадают с результатами работ авторов [8], которые при очистке ß-галактозидазы Str. cremoris Н путем фракционирования сульфатом аммония получили препарат, активность которого составляла 0,4 мг белка/1 мкМ ортонитрофенола, освобожденного из ONPG в течение 1 мин при pH 7,0.
Подобную степень очистки получили авторы [6, 9]. Кроме фракционирования сульфатом аммония, они применяли также хроматографическое разделение на сефадексе G-200 и DEAE-сефадексе А-50. В результате хроматографического разделения получали по три фракции, среди которых только одна характеризовалась высокой активностью ß-галакто-зндазы, превышающей активность «сырого» экстракта в 23 [6] и 53 [9] раза.
Предварительная очистка ß-галактозидазы необходима при биохимической характеристике, проводимой во время подбора штаммов для промышленности. Однако, используя в технологии чистые культуры в виде заквасок, мы имеем дело со взаимодействием отдельных энзиматических групп. Превращения, происходящие в продукте, обусловлены различными энзиматическими процессами, что не наблюдается при воздействии чистого фермента. В связи с этим в настоящей работе рассматриваются лишь наиболее простые и дешевые методы очистки ß-галактозидазы, так как применение в молочной промышленности чистых ферментов маловероятно.
Выводы
1. Добавление глюкозы или галактозы к питательной среде стимулирует биоеин-тез ß-галактозидазы Str. lactis 192, причем добавление глюкозы в большей степени, чем галактозы.
2. В процессе очистки ß-галактозидазы, содержащейся в «сыром» внутриклеточном экстракте и экстракте клеточной стенки, при осаждении ацетоном достигают более высокой степени очистки, нежели при высаливании сульфатом аммония.
ЛИТЕРАТУРА |
1. Rymaszewski J. Wlasciwosci wewnat-
rzkomor kowvchekstraktow wybranych szczepow bakterii fermentacji miekowej// Zesz. Nauk. ART Olszt. — 1978. — 204,
Techn. Zvwn. — 13. — 3 — 48.
2. Hemme D., Nardi M., Jette D. ß-ga-
lactosidases et phospho—ß-galactosidases de Str. thermophilus. Lait. — 1980. —
60. — 595. — 618.
3. Tin son W., Hiller A. J., Ja go G. R, Utilization of lactose, glucose and galactose. Austral //J. Dairy Technol. — 1982. — 37. — 1. — 8—25.
4. Cichosz G., Rymaszewski J., I(u-jawski M. Proba otrzymywania i oczy-szczania ß-galaktozydazv Streptococcus
lactis 192. Mat XVII Sesji Nauk. Kom. Techn. i Chem. Zvmn. PAN, Lodz, — 1986.
1. — 140—143.
5. Rymaszewski J., Cichosz G., К u-jawski M. Properties of ß-galactosidase from cells of Streptococcus lactis 192 and Lactobacillus lactis F-16 strains //Ac. Alim. Pol. — 1985.-11 (35). — 4. — 449—460.
6. R а о M. V. R., Dutt a S. M. Purification and properties of ß-galactosidase from Streptococcus thermophilus //J. Food Sei.— 1981. — 46. — 1419—1423.
7. Lowry O. H., R о s e n b г о u g h t N. J., F a r r A. L., R a n d a 11 R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — 193. — 265 — 274.
8. J a g о t a S. H., R а о М. V. R. Dutta S. M. ß-galactosidase of Streptococcus cremoris H//J. Food Sei. — 1981. — 46. —
161 — 163.
9. Singh H. P., RaoM. V. R„ Dutta S. M. Partial puryfication and properties of Leu-conostoc citrovorum ß-galactosidase. Mil-chwiss. — 1979. — 34. — 457—478.
Поступила 12.06.90
