CC BY
367
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 1. С. 186-195 Химия
УДК 579.222.2 + 57.082.52
Получение сухой формы биопрепарата для очистки от нефтяных загрязнений и изучение его свойств при долговременном хранении *
К.В. Петриков, Е.П. Власова, А.А. Ветрова, А.А. Овчинникова,
О.Н. Понаморёва, В.А. Алфёров, И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов
Аннотация. Показано, что выживаемость микроорганизмов родов Pseudomonas и Rhodococcus после контактной сушки выше, чем после лиофильной. Хранение сухих биопрепаратов в герметичной таре при температуре -20°С обеспечивает наилучшее сохранение численности жизнеспособных микроорганизмов. При этом бактериальные клетки сохраняют свою деградативную активность в отношении углеводородов нефти.
Ключевые слова: хранение микроорганизмов, Pseudomonas, Rhodococcus, лиофильная сушка, контактная сушка, биопрепарат, биодеградация нефти.
Введение
В настоящее время ухудшение экологической обстановки во многих странах мира вызвано загрязнением окружающей среды вследствие потерь нефти при её добыче, транспортировке и переработке. Низкие темпы самоочищения почв и водоёмов, приводят к тому, что без проведения мероприятий по очистке количество загрязнённых нефтью и нефтепродуктами земель будет неуклонно расти [1]. Важную роль при очистке почв от нефти и нефтепродуктов играет биологический фактор — активность микроорганизмов. В связи с этим, большое внимание уделяется изучению процессов биологической ремедиации природных экосистем [2].
Очистка и восстановление обширных территорий в Российской Федерации методами ex situ (вне места загрязнения) невозможны в связи с масштабами загрязнений. Одним из основных методов биоремедиации in situ
* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (гос. контракты №П1705, №П1749) и гранта РНП 2.1.1.612.
(на месте загрязнения) является интродукция биопрепарата (одного или нескольких активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов) в места загрязнения. При этом в почве формируется конкурентоспособная ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов.
Одним из аспектов проблемы получения промышленных форм биопрепаратов, отвечающих требованиям экономичности и эффективности, является вопрос сохранения жизнеспособности и катаболической активности бактерий, поскольку нативная биомасса микробных клеток теряет свои качества, необходимые для использования в биопрепарате, в течение нескольких дней.
Распространённым способом подготовки микробной биомассы к хранению является высушивание: лиофильное (сублимационное) — из замороженного состояния при очень низком давлении или контактное — в мягких условиях после смешивания клеточной суспензии с сорбентом-носителем.
В процессе лиофилизации биомассу микроорганизмов, смешанную с раствором криопротекторов — веществ, снижающих повреждающее воздействие холода, замораживают при температуре от -20 до -70оС. После чего препарат помещают в сушильную камеру, где создается вакуум, при этом влага испаряется, минуя переход в жидкую фазу, непосредственно изо льда, в результате чего структура препарата не нарушается. При высушивании методом сублимации создаются условия, при которых вещество претерпевает минимальные биохимические изменения. Возможность денатурирования биологически активных веществ при этом методе сводится к минимуму, благодаря тому, что замораживание блокирует их растворение.
Контактная сушка является распространённым способом подготовки биоматериалов к длительному хранению. При этом микробную биомассу смешивают с защитной средой и носителем и высушивают при умеренной температуре 35-40°С. В отличие от лиофильной сушки, при этом методе микробные клетки не подвергаются воздействию низких температур, что позволяет существенно увеличить их выживаемость. Но, с другой стороны, сохраняется повреждающее воздействие на микроорганизмы за счёт их обезвоживания. Таким образом, численность микроорганизмов после высушивания может быть значительно ниже, чем до сушки. Этот недостаток может быть устранен, как и в случае лиофилизации, путём использования различных защитных сред: растворов, содержащих вещества, снижающие повреждающее действие обезвоживания. Теоретические основы механизмов защиты микробных клеток изучены слабо, поэтому поиск новых эффективных защитных средств является областью практических исследований.
1. Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В качестве объектов исследования были использованы два штамма микроорганизмов-нефтедеструкторов из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН: Pseudomonas
эр. 142МР(рМР142), содержащий плазмиду биодеградации полиароматиче-ских углеводородов рМР142, и ЯНойососсив эр. 867 [3].
Получение биомассы микроорганизмов. Чистые культуры микроорганизмов выращивали при 24° С в колбах Эрленмейра на орбитальной качалке (п = 200 об/мин) в течение 24 часов («суточная культура»). В качестве ростовой среды использовали 200 мл богатой среды Лурия-Бетани [4]. Отделение клеток производили путём центрифугирования на центрифуге К70 (Janetzki, Польша) при скорости 5000 об/мин. в течение 15 минут при 4°С. Затем к осадку добавляли физиологический раствор (1:1 по массе), ресуспендировали и снова центрифугировали. Полученную биомассу использовали в дальнейшей работе.
Контактная сушка. Готовили защитную среду на основе 0,05 М натрий-калиевого фосфатного буфера (рН 6,8), содержащую 4% полиглюкина, 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 2% аскорбиновой кислоты. Кислотность среды доводили до значения рН 6,8—7,2 титрованием 45% раствором гидроксида натрия. Полученную, как описано выше, биомассу смешивали с защитной средой в пропорции 1:1 по массе. Затем смесь медленно добавляли в емкость, содержащую сорбент (песок перлитовый, ГОСТ 10832-91), обеспечивая равномерное распределение раствора по объему сорбента интенсивным перемешиванием. Количество сорбента определяли исходя из расчёта: на 1 г смеси биомассы с защитной средой необходимо 0,25 г сорбента. Образец наносили тонким слоем на ровную, гладкую, стерильную поверхность, не допускающую прилипания (стеклянная пластина). Препарат высушивали при 37°С в течение 24-48 часов до постоянной массы.
Полученный порошок хранили при комнатной температуре, в холодильнике при температуре 2-4°С и в морозильной камере при -20°С.
Лиофильная сушка. В качестве защитных сред использовали: 20% раствор сахарозы; раствор 4% тиомочевины, 8% сахарозы, 4% полиглюкина (раствор №1); раствор 6% тиомочевины, 10% сахарозы (раствор №2). Соотношение биомасса: защитная среда составляло 1:1 по массе. Перед лиофили-зацией биомассу, смешанную с защитной средой выдерживали при температуре -20°С 24 часа. Лиофилизацию проводили на установке для лиофильной сушки КС30 (Еп§ега, Чехия), при температуре 35°С и давлении 4 мкм рт. ст. (0,5 Па). Полученную сухую биомассу хранили при комнатной температуре в герметичной упаковке.
Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов. Для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл суспензии (т.е. концентрации живых клеток) применяли метод стандартных серийных разведений [5] с последующим высевом на агаризованую среду Лурия-Бетани.
Определение деградативной способности микроорганизмов. Для
оценки эффективности биопрепарата проводили лабораторный модельный эксперимент по нефтедеструкции. Для этого навеску сухого препарата (1 г) помещали в 10 мл физиологического раствора. Перемешивали в течение 20
минут для регидратации клеток бактерий. В колбы Эрленмейра объемом 750 мл вносили 100 мл минеральной питательной среды Эванса для культивирования микроорганизмов [6]. В каждую колбу добавляли 1,73 г сырой нефти и 1 мл рабочего раствора биопрепарата (концентрация микроорганизмов 107-108 КОЕ/мл).
Для сравнения деградативной активности ставили контроль: вместо биопрепарата в колбы с нефтью вносили 10 мл суспензии свежевыращенных на богатой среде Лурия-Бетани микроорганизмов (концентрация 108 КОЕ/мл).
В качестве нулевого контроля для оценки абиотической убыли нефти использовали колбы с нефтью без внесения биоматериала.
Все образцы готовили в трёх повторах.
Суммарную концентрацию углеводородов нефти определяли спектрометрическим методом на концентратомере АН-2 (ООО «НХА-С.Пб.», Санкт-Петербург), после экстракции четыреххлористым углеродом.
Проверка фенотипической стабильности плазмиды. Стабильность плазмиды pNF142 в клетках бактерий микроорганизма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) проверяли методом отпечатков 100 колоний, выросших на среде Лурия-Бетани, на агаризованую среду Эванса, содержащей нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии.
2. Результаты и обсуждение
Использование лиофилизации для хранения микроорганизмов не всегда оправдано: воздействие стрессовых факторов на микробные клетки снижает их выживаемость. Как было показано [7], для грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas процент жизнеспособных микроорганизмов составляет не более 16% после лиофильной сушки, а для грамположительных бактерий рода Rhodococcus — не более 52%. Кроме того, лиофилизация может привести к потери некоторых полезных свойств, возможно, из-за потери плазмид [8]. Контактная сушка проводится при значительно более мягких условиях, за счёт чего использование этого типа высушивания позволяет повысить численность живых клеток.
Как сорбент-носитель для контактной сушки был выбран вспученный перлитовый песок, который получают высокотемпературным обжигом водосодержащего вулканического стекла, называемого перлитом. Это легкий, инертный, негорючий, нетоксичный материал. Обладая высокой открытой пористостью (до 75%), перлитовый песок в течение 3-5 минут впитывает 10 г воды на 1 г сорбента. Эти качества делают его удобным носителем для микроорганизмов.
Для оценки степени воздействия повреждающих факторов на микроорганизмы при высушивании определяли выживаемость бактерий в сухом препарате. Для этого в биомассе, полученной глубинным культивированием на богатой среде, измеряли число КОЕ. Затем биомассу сушили по методике, описанной выше, и определяли число КОЕ после сушки.
Как видно из рис. 1, выживаемость микроорганизмов при контактной сушке значительно выше, чем при лиофильной. При этом очевидно, что грамположительные бактерии более устойчивы к действию повреждающих факторов, что подтверждается литературными данными [9]. Следует отметить, что использование контактной сушки значительней выгоднее, так как не требует использования дорогостоящих морозильных камер и установок для лиофильной сушки.
90
80
10
0 J----------1 II--------------------------------1 .... I-------
Pseudomonas Микроорганизм Rh°dococcus
□ контактная сушка □ лиофильная сушка
Рис. 1. Сравнение выживаемости микроорганизмов после контактного и лиофильного способов сушки
Однако, несмотря все указанные преимущества, полагают, что лиофи-лизация обеспечивает большую стабильность при хранении для широкого круга микроорганизмов, чем высушивание при обычных условиях, поскольку происходит значительно более полное удаление влаги из препарата [10]. Для сравнения выживаемости микроорганизмов, высушенных разными способами, соответствующие образцы хранили при комнатной температуре, сравнивая численность КОЕ через 1, 2 и 6 месяцев.
Как показывает анализ данных, представленных таблице, установить прямую зависимость между скорость гибели клеток и типом высушивания довольно сложно. Для псевдомонад снижение выживаемости за первый месяц на 19% выше после контактной сушки, чем после лиофильной. Для родококков наблюдается обратная картина: выживаемость после контактной в два раза выше. Тем не менее, за полгода выживаемость клеток упала более чем в сто раз и стала сравнима в пределах ошибки для всех вариантов. Таким образом, можно полагать, что для длительного хранения способ высушивания не имеет определяющего значения. Возможно, это объясняется тем, что за такой период времени различия в структуре образцов, подвергнутых разным типам сушки, нивелируются за счёт воздействия факторов, снижающих выживаемость.
Тем не менее, предпочтительней использование контактной сушки, так как общая численность клеток будет выше, за счёт высокой выживаемости клеток в процессе сушки, а материальные затраты значительно ниже.
Выживаемость микроорганизмов при хранении в герметичной таре после различных способов высушивания, %
Штамм Тип сушки Время хранения, мес.
1 2 6
Pseudomonas sp.142NF Контактная 13 ± 2 6 ± 2 0,2 ± 0,1
Лиофильная 32 ± 5 3 ± 1 0,2 ± 0,1
Rhodococcus sp.S67 Контактная 15 ± 3 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1
Лиофильная 6 ± 1 2 ± 1 0,3 ± 0,1
Однако, кроме способа подготовки биоматериала к длительному хранению, важным фактором является соблюдение оптимальных условий хранений: герметичность упаковки и температурный режим.
Известно, что воздействие кислорода воздуха и водяных паров уменьшает число жизнеспособных клеток в сухих препаратах [10], что было подтверждено и для изученных в данной работе микроорганизмов. При хранении образцов, полученных контактной сушкой, в негерметично закрытой таре, наблюдалась очень быстрая гибель клеток: за месяц выживаемость псевдомонад упала до 0,1%, родококков — до 3,3% (сравн. с данными табл. 1). Поэтому при хранении сухих форм микробной массы использование герметичных упаковок позволяет значительно повысить число КОЕ в биопрепарате.
Другим фактором, оказывающим большое влияние на выживаемость микроорганизмов при хранении, является температура. Для многих бактерий наблюдается значительное увеличение выживаемости при снижении температуры хранения. Из данных рис. 2 и 3 видно, что для исследуемых в данной работе штаммов наблюдается аналогичная закономерность. За полгода выживаемость микроорганизмов, хранящихся при температуре -20°С, значительно выше, чем в других образцах. По-видимому, то происходит за счёт снижения скорости окислительных процессов, происходящих в клетках [11].
Известно, что при высушивании микроорганизмы могут утрачивать свои свойства, в том числе и за счёт потери плазмид [8]. В настоящей работе проверяли фенотипическую стабильность плазмиды биодеградации штамма Pseudomonas sp. 142NF и деградативную активность препаратов после высушивания.
На плазмиде pNF142, присутствующей в штамме Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), расположены гены, контролирующие деградацию ароматических субстратов, в частности, нафталина. Проверка способности утилизировать нафталин показала 98-100% сохранение плазмиды во всех вариантах хранения этого микроорганизма.
0 1 2 3 4 5 6
Время хранения, мес.
- О- - комнатная —О— 2-4°С —О— -20°С
Рис. 2. Снижение выживаемости микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. 142NF при различных температурах
0 1 2 3 4 5 6
Время хранения, мес.
- -о- - комнатная —2-4°С —о— -20°С
Рис. 3. Снижение выживаемости микроорганизмов штамма Rhodococcus sp. S67 при различных температурах
Для оценки эффективности действия препаратов после хранения проводили лабораторный модельный эксперимент по определению деградатиру-щей способности микроорганизмов по описанной выше методике. Использовали образцы, высушенные контактной сушкой и хранящиеся при -20°С в течение двух недель, и нативную биомассу микроорганизмов, полученную глубинным культивированием на богатой среде. Как видно из рис. 4, наблюдается небольшое снижение степени деструкции нефти в случае сухого биопрепарата. Это можно объяснить гибелью клеток и снижением активности за счёт стрессового воздействия различных факторов при хранении. Однако, снижение деградативной активности составляет для бактерий Pseudomonas и Rhodococcus всего лишь 7% и 2%, соответственно, что является незначительным.
Таким образом, для хранения микроорганизмов-нефтедетрукторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в течение шести месяцев предпочтительней использовать контактную сушку. Наибольшая выживаемость клеток достигается при соблюдении условии хранения препаратов: герметичности и низких
Pseudomonas Штамм Rhodococcus
□ Нативная биомасса ЕЗ Сухой биопрепарат
Рис. 4. Деградация нефти исследуемыми бактериями до и после хранения
температур (-20°С). При этом микроорганизмы сохраняют свою деградатив-ную активность в отношении углеводородов нефти.
Список литературы
1. Ревелль П., Ревелль Ч. Среда нашего обитания. Загрязнение воды и воздуха.
М.: Мир, 1995. С.296.
2. van Hamme J.D., Singh A., Ward O.P. Recent Advances in Petroleum Microbiology // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2003. V.67, №4. P.503-549.
3. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти / И.А. Пырченкова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. T.42, №3. C.298-305.
4. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonas putida // Appl. Microbiol. 1975. V.30. Р.1046.
5. Методы общей бактериологии / Под ред. Герхарда и др. Т.3. М: Мир, 1984. 264 с.
6. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continiuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a Chemostat // Methods in Microbiology. 1970. V.2. P.277-327.
7. Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при различных способах хранения биомассы / К.В. Петриков [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2008. Вып.2. С.226-237.
8. Yoon K.P. Stabilities of artificially transconjugated plasmids for the bioremediation of cocontaminated sites // J. of Microbiology. 2005. V.43. P.196-203.
9. Survival of freeze-dried bacteria / Y. Miyamoto-Shinohara [et al.] // J. Gen. Appl. Microbiol. 2008. V.54. P.9-24.
10. Долинов К.Е. 1Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1969.
232 с.
11. Beatty J.M., Coote G.G., Scott W.J. Some factors affecting the viability of dried bacteria during storage in vacuo // Appl. Microbiol. 1974. V.4. P.648-652.
Петриков Кирилл Владимирович ([email protected]), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Власова Елена Павловна ([email protected]), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Ветрова Анна Андрияновна ([email protected]), аспирант, Пущин-ский государственный университет.
Овчинникова Анастасия Алексеевна ([email protected]), аспирант, Пущинский государственный университет.
Понаморёва Ольга Николаевна ([email protected]), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Алфёров Валерий Анатольевич ([email protected]), к.х.н., профессор, зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Пунтус Ирина Филипповна ([email protected]), к.б.н., научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Филонов Андрей Евгеньевич ([email protected]), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Production the dry forms of a biological product for oil pollution treatment and study its properties under long-term storage
K.V. Petrikov, E.P. Vlasova, A.A. Vetrova, A.A. Ovchinnikova,
O.N. Ponamoreva, V.A. Alferov, I.F. Puntus, A.E. Filonov
Abstract. It was shown that the survival of microorganisms genera Pseudomonas and Rhodococcus after contact drying is higher than after freeze-drying. Storage of dry biological preparations in a sealed container at -20°C provides the best retention of viable microorganisms. This bacterial cells remain biodegradation activity concerning petroleum hydrocarbons.
Keywords: storage of microorganisms, Pseudomonas, Rhodococcus, freeze-drying, contact drying, biological preparation, oil biodegradation.
Petrikov Kirill ([email protected]), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Vlasova Elena ([email protected]), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Vetrova Anna ([email protected]), postgraduate student, Pushchino State University.
Ovchinnikova Anastasiya ([email protected]), postgraduate student, Pushchino State University.
Ponamoreva Olga ([email protected]), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Alferov Valerii ([email protected]), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.
Puntus Irina ([email protected]), candidate of biological sciences, researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Filonov Andrey ([email protected]), candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Поступила 20.10.2009
