CC BY
28
О Коллектив авторов,1996 УДК 616-006-097:612.112.94
И. Ф. Абропина, Д. В. Родии, Т. П. Плетнева,
Б. Д. Брондз
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СПЕЦИФИЧЕСКИМ Т-СУПРЕССОРАМ МЫШЕЙ И ПОДАВЛЕНИЕ ИМИ РОСТА ОПУХОЛИ В СОЧЕТАНИИ С АДОПТИВНЫМ ПЕРЕНОСОМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей,
НИИ канцерогенеза; Московский физико-технический институт
Существование специфической супрессии иммунного ответа, опосредованной Т-клетками, доказано экспериментальными исследованиями многих лабораторий [8, 10, 11, 15]. Особенно важное значение феномен супрессии приобретает при канцерогенезе, поскольку является потенциальным механизмом, способствующим росту опухоли. Подавление клеточного иммунитета у мышей-опухоленосителей Т-супрессорами продемонстрировано рядом авторов [4, 9, 12—14].
Ранее нами была разработана модель для изучения специфических Т-супрессоров (СТС) у мышей, индуцированных антигенами комплекса Н-2 [6]. Были получены поликлональные и моноклональные антисуп-рессорные IqM-антитела, инактивирующие СТС и не оказывающие влияния иа функции других субпопуляций эффекторных Т-лимфоцитов — киллеров и продуцентов фактора миграции макрофагов [1, 5]. Позднее была описана модель противоопухолевых цитотокси-ческих Т-лимфоцитов (ЦТЛ) мышей при условии их иммунизации in vivo и последующей дифференцировке киллеров в монокультуре [2]. Было показано, что у мышей-опухоленосителей генерация и функциональная активность противоопухолевых ЦТЛ подавляются in vitro СТС [3].
Целью настоящей работы являлось получение моноклональных антисупрессорных IqG-антител, селективно элиминирующих СТС in vivo и in vitro, и изучение их действия на рост сингенной саркомы у мышей в комбинации с адоптивным переносом противоопухолевых ЦТЛ.
Материалы и методы. В работе использовали мышей конген-ных —C57BL10 (сокращено BIO, Н-2В), B10.D2(H-2d) и некоигенных по комплексу Н-2 линий — BALB / с (H-2d), СВА (Н-2к), полученных в питомнике для разведения (ОНЦ РАМН).
Саркома MX-11 индуцирована метилхолантреном у мышей линии В10. Впоследствии поддерживалась пассажами в асцитной форме.
СТС у мышей B10.D2, В10 и СВА индуцировали введением в латеральную вену хвоста 9 • 107 облученных (2000 рад) клеток селезенки мышей В10, В10. D2 и В10 соответственно. Через 4 дня клетки селезенки иммунных мышей обрабатывали митомицином С («Siqma», St Louis, МО) в течение 30 мин при температуре 37°С в концентрации 25 мкг/мл. После этого клетки дважды центрифугировали и добавляли 1—4- 105 клеток в смешанную культуру лимфоцитов, где реагирующими лимфоцитами являлись клетки лимфоузлов (3 ■ 105 ) интактных мышей той же линии, что и доноры Т-супрессоров, а в качестве стимуляторов использовали облученные
I. F. Abronina, D. V. Rodin, T. P. Pletneva,
B. D. Brondz
GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO SPECIFIC MOUSE T-SUPPRESSORS AND SUPPRESSION OF TUMOR GROWTH BY THE ANTIBODIES IN COMBINATION WITH ADOPTIVE TRANSFER OF ANTITUMOR CYTOTOXIC LYMPHOCYTES
Research Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, Research Institute of Carcinogenesis, Moscow Physicotechnical Institute
The effect of specific suppression of immune response via T-cells was proved by many experimental studies [8, 10, 11, 15]. The suppression is of especial significance in carcinogenesis because it is a potential mechanism of tumor growth promotion. Inhibition of cellular immunity by T-suppressors in tumor-bearing mice was showed by many authors [4, 9, 12-14].
Wc developed previously a model to study specific T-suppressors (STS) in mice after H-2 complex antigen induction [6]. Generation of polyclonal and monoclonal antisuppressor IgM-antibodies led to STS inactivation and had no effect on functions of other effector T-lymphocyte subpopulations, i.e. killers and macrophage migration factor producers [1,5]. Later we described a model of mouse antitumor cytotoxic T-lymphocytes (CTL) after in vivo immunization and further killer differentiation in monoculture [2]. It was showed that generation and functional activity of antitumor CTL in tumor-bearing mice was suppressed by STS [3].
The purpose of this investigation was to generate monoclonal antisuppressor IgG-antibodies selectively eliminating STS in vivo and in vitro, and to study their effect on growth of syngeneic sarcoma in mice in combination with adoptive transfer of antitumor CTL.
Materials and Methods. The study was performed in mice of congeneic C57BL10 (abbreviated as BIO, H-2b), B10.D2 (H-2d) and H-2 complex non-congeneic BALB/c (H-2d), CBA (H-2k) lines supplied by the CRC nursery.
Sarcoma MX-11 was induced by methyl cholanthrene in B10 mice to be maintained by passages in ascitic form.
STS were induced in B10.D2, B10 and CBA mice by administration of 9xI07 preirradiated (2000 rad) splenic cells from BIO, B10.D2 and CBA mice, respectively, to tail lateral vein. At 4 days splenic cells from the immune mice were treated with mitomycin C (Sigma, St Luis, MO) for 30 min at 37°C at 25 mcg/ml. Then the cells were centrifuged two times and 1-4- 105 cells were added to mixed lymphocyte culture with lymph node cells (3 • 105) from intact mice of the same line as T-suppressor donors as reacting lymphocytes and irradiated (2000 rad) splenic cells (9 • 105) from mice of the immunizing line as stimulators. The mixture of three cell types was cultured 4 days in complete medium (RPMI-1640, 5% human serum, 200mM L-glutamine, HEPES, 5 ■ 103 2-mercaptoethanol, 50 U/ml gen-tamycin) in round-bottom microplates in 0.2 ml3 volume with H-thymidine (1 mcCi per well), added at 16 hours before the experiment. Suppressor index was calculated by formula
0a-ci)-ib-c2)/(a-c,) ■ 100%,
(2000 рад) клетки селезенки (9 • 10s ) иммунизирующей линии. Смесь трех типов клеток культивировали 4 дня в полной среде (RPMI = = 1640, 5% сыворотки человека, 200 мМ L-глутамина, ХЕПЕС, 5 • 10-3 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл гентамицина) в круглодонных микропластинках в объеме 0,2 мл-1 Н-тимидина (1 мк/Ки на лунку), добавляли за 16 ч до окончания эксперимента. Супрессорный индекс (в %) вычисляли по формуле
(я-c,) - (e-c2)/(a-Ci) ■ 100%,
где а ив — включения Н-тимидина при добавлении в аллогенные культуры нормальных и иммунных лимфоцитов, ci и С2 — включение метки в сингенные культуры при добавлении тех же клеток.
Клеточную суспензию для иммунизации мышей BALB/c при получении мышно-мышиных гибридом получали по разработанной нами ранее методике [7]. 100—150- 106 СТС B10.D2 анти-В10 адсорбировали на монослое перитонеальных макрофагов нормальных мышей линии В10 в течение 2 ч при 30°С, затем элюировали проказой в концентрациях 25 и 100 мкг/мл. 20 ■ 106 элюированных СТС иммунизировали самок-мышей BALB/c трижды (два раза внутрибрю-шинно и один раз внутривенно) с интервалом 2 пед между первой и второй иммунизацией и 3 нед между второй и третьей. Слияние лимфоцитов иммунной селезенки мышей BALB/c с миеломной линией Х63.653 осуществляли на 4-й день после последней иммунизации с помощью полиэтиленгликоля. Клетки гибридомы D6 размножали in vitro в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 200 мМ L-глутамина и 50 ед/мл гентамицина. Отбор гибридомы D6 из других вариантов производили по нейтрализации функциональной активности СТС их предварительной обработкой in vitro культуральными супернатантами различных гибридом перед добавлением в смешанные культуры лимфоцитов.
Для определения в непрямой реакции иммунофлюоресценции класса моноклональных антисупрессорных антител, секретируемых гибридомой D6, Ю6 клеток Т-супрессоров, выделенных методом «пен-нинга» из иммунной селезенки мышей B10.D2 анти-ВЮ, обрабатывали сначала 0,1мл антисупрессорных антител в разведении I : 4 30 мин при 4°С, дважды отмывали, а затем — меченными изотионатом флю-оресцеина овечьими анти-IqG- или анти-1цМ-антителами («Siqma», St Louis, МО) 30 мин при 4°С. Реакцию оценивали путем подсчета количества светящихся клеток в флюоресцентном микроскопе («Leitz»).
Антисупрессорные моноклональные антитела получали из культурального супернатанта гибридомной линии D6. Для получения очищенного антисупрессорного иммуноглобулина культуральный супернатант концентрировали, добавляли к нему 1 М трис-НС1буфер (pH 8, 5), помещали на хроматографическую колонку с сефарозой, конъюгированной с белком А, и элюировали 0,05 М раствором цитрата натрия и лимонной кислоты (pH 3,5). Пробы содержали
0,05 мг/мл антисупрессорного IqG, разведенного в фосфатном буфере с 0,1% ЭТС.
Аллоспецифические ЦТЛ получали из лимфоузлов мышей B10.D2 анти-ВЮ на 4-й день после иммунизации клетками облученной ал-логеипой селезенки (107 клеток, 2000 рад) в подушечки задних лап. Противоопухолевые ЦТЛ получали из лимфоузлов мышей В10 на 4-й день после 2-кратной иммунизации клетками, облученной син-генной саркомы МХ-11 (107 клеток, 30 000 рад) с интервалом 12 дней. ЦТЛ инкубировали в монокультуре в полной среде с 10% ЭТС, содержащей 20 ед/мл рекомбинантного интерлейкина-2 («Cetus») и определяли их цитотоксическую активность против меченных 5|Сг клеток-мишеней (опухолевые клетки — МХ-11, индуцированные кон-канавалином А, бласты — В10). 103 51Сг-меченных клеток-мишеней смешивали с 1—4- 104 эффекторных клеток в среде RPM1-1640 с 10% ЭТС в 96-луночных пластинках в объеме 0,2 мл и инкубировали пластинку 16 ч при 37° С и 5% СОг- Цитотоксический индекс (в %) определяли по формуле:
((в-с,) / (а-с2)) • 100%,
где а. в и С2 — выходы 5|Сг соответственно при полном разрушении КМ раствором додецилсульфата натрия при добавлении эффекторных лимфоцитов и нормальных лимфоцитов, с\ — спонтанный выход 5|Сг в среду.
При обработке in vitro 5—10 • 106 СТС либо ЦТЛ дважды отмывали центрифугированием, инкубировали в 0,5 МЛ антисупрессорные моноклональные антитела в разведении I : 4 из культураль-
vvhere a and b were H-thymidine incorporations after addition of normal and immune lymphocytes to allogeneic cultures, c/ and q were label incorporations in syngeneic cultures after addition of the same cells.
Cell suspension for BALB/c mouse immunization during murine-murine hybridoma generation was prepared according to technique developed by the authors earlier [7]. 100-150- 106 STS from B10.D2 anti-BlO were adsorbed on a monolayer of peritoneal macrophages from normal B10 mice for 2 h at 30°C, then eluted with pronase at 25 and 100 mcg/ml. BALB/c female mice were immunized with 20 ■ 106 eluted STS three times (twice by intraperitoneal and once by intravenous routes) at a 2-week interval between the first and second injections and a 3-week interval between the second and the third injections. Fusion of immune splenic lymphocytes from BALB/c mice with myeloma line X63.653 was effected on day 4 after the last immunization using polyethylene glycol. Hybridoma D6 cells were propagated in vitro in DMEM containing 10% fetal calf serum (FCS), 200 mM L-glutamine and 50 U/ml gentamycin. Hybridoma D6 was selected from other variants by STS functional activity removal as a result of in vitro pretreatment with culture supernatants of various hybridomas before adding to mixed lymphocyte cultures.
To determine the class of monoclonal suppressor antibodies secreted by D6 by indirect immunofluorescence 106 T suppressor cells isolated by penning from immune spleen of BI0.D2 anti-BlO mice were treated with 0.1 ml antisuppressor antibodies in 1:4 dilution for 30 mill at 4°C, washed two times and treated with FITC-labeled sheep anti-IgG or anti-IgM antibodies (Sigma, St Luis, MO) for 30 min at 4° C. Reactivity was assessed by counting fluorescent cells in a fluorescent microscope (Leitz).
Antisuppressor monoclonal antibodies were extracted from hybridoma D6 culture supernatant. To obtain purified antisuppressor immunoglobulin the culture supernatant was concentrated, added with
1 M tris-HCl buffer (pH 8.5), transferred into chromatographic column with protein A-conjugated sepharose, and eluted with 0.05 M sodium citrate and citric acid solution (pH 3.5). The samples contained 0.05 mg/ml antisuppressor IgG diluted in phosphate buffer with 0.1% FCS.
Allospecific CTL were isolated from lymph nodes of B10.D2 anti-BlO mice on day 4 following immunization with irradiated allogeneic splenic cells (107 cells, 2000 rad) by padal injection. Antitumor CTL were obtained from BIO mouse lymph nodes on day 4 after two immunizations with irradiated sarcoma MX-11 cells (107 cells, 30,000 rad) at a 12-day interval. CTL were incubated in monoculture in complete medium with 10% FCS containing 20 U/ml recombinant interleukin-2 (Cetus) to determine their cytotoxic activity against 5lCr-labeled target cells (tumor cells MX-11, induced by concanavallin A, blasts B10). 103 5lCr-labeled target cells were mixed with 1 -4x 104 effector cells in RPMI-1640 with 10% FCS in 96-well plates at 0.2 ml volume, the plate was incubated 16 h at 37°C in 5% COj. Cytotoxicity index (%) was calculated by formula
((/)-c/)/(«-o)) - 100%,
where a, b and q were 5lCr yields after complete TC destruction with sodium dodecyl sulphate solution, after addition of effector lymphocytes and normal lymphocytes, respectively; e; was 51Cr spontaneous yield into the medium.
In in vitro processing 5-10xl06 STS or CTL were washed two times, incubated in 0.5 ml antisuppressor monoclonal antibodies in 1:4 dilution from hybridoma D6 culture supernatant or in 0.1 ml phosphate buffer with 0.1% FCS containing 400 ng antisuppressor IgG for 30 min on ice, centrifuged and incubated again in 0.5 ml non-toxic guinea pig complement in 1:10 dilution for 30 min at 37°C. In control experiments STS or CTL were treated with growth medium for hybridomas or phosphate buffer with 0.1% FCS free from suppressor monoclonal antibodies or purified antisuppressor immunoglobulin.
In in vivo experiments 0.1 ml phosphate buffer with 0.1% FCS containing 400 ng antisuppressor IgG was administered intravenously to B10.D2 anti-BlO mice for 1-3 days after allogeneic immunization. Control mice received intravenously phosphate buffer with 0.1% FCS free from purified antisuppressor IgG.
80
70-
60"
50-
40-
30
20
10
0
1
и
I
I2
с
с
Рис. 1. Подавление функциональной активности СТО в смешанных культурах лимфоцитов при обработке in vitro анти-супрессорными антителами и антисупрессорным IqG.
СТС B10.D2 анти-BIOft), В10 анти-В10.Р2 (Ь) и СВА анти-ВЮ.02 (с) перед добавлением не обрабатывали (А) либо обрабатывали в присутствии комплемента антисупрессорными моноклональными антителами из культурального супернатанта гибридомы D6 в разведении 1 : 4 (В), ростовой средой для гибридом (С), 400 нг аффинно-очищенного антисупрессорного IqG в фосфатном буфере с 0,1% ЭТС (D), фосфатным буфером с 0,1% ЭТС (£). Эффект отмены супрессии достоверен (B,D) для р < 0,01—0,001. Здесь и на рис. 2: 1— 4-105 СТС, 2 — 2 105 СТС, 3 — 1 • 105 СТС. По вертикали — супрессорный индекс, %.
Fig.1. Inhibition of STS functional activity in mixed lymphocyte culture after in vitro treatment with antisuppressor antibodies and antisuppressor IgG.
STS from B10.D2 anti-B10 (a), B10 anti-B10.D2 (b), CBA anti-B10.D2 (c) no pretreatment (A), pretreatment with antisuppressor monoclonal antibodies from hybridoma D6 culture supernatant in 1 :4 dilution in the complement presence (S), with hybridoma growth medium (C), 400 ng affinity-purified antisuppressor IgG in phosphate buffer with 0.1% FCS (D), with phosphate buffer containing 0.1% FCS (E). Suppression removal is statistically significant (B,D) at p< 0.001. Here and in fig. 2: 1, 4 ■ 10s STS; 2, 2 • 105 STS; 3, 1 • 105 STS. Numbers on the vertical show suppression index (in %).
ного супернатанта гибридомы D6 или в 0,1 МЛ фосфатного буфера с 0,1% ЭТС, содержащего 400 нг антисупрессорного IqG в течение 30 мин на льду, центрифугировали и повторно инкубировали в 0,5 мл нетоксичного комплемента морской свинки в разведении 1 : 10 в течение 30 мин при 37°С. В контроле СТС или ЦТЛ обрабатывали ростовой средой для гибридом либо фосфатным буфером с 0,1% ЭТС, не содержащим антисупрессорных моноклональных антител и очищенного антисупрессорного иммуноглобулина.
In vivo мышам B10.D2 анти-В10 вводили внутривенно в течение 1—3 дней после аллогенной иммунизации 0,1 мл фосфатного буфера
80
70-
60-
50-
40-
30-
20
ЮН
0
I-
1
1
с
,
I
I
Group 1 of B10 mice with sarcoma MX-11 received 400 ng antisuppressor IgG on days 2, 5, 8, 11, 17, 20, 23 and 28. Group
2 received 107 antitumor CTL on days 6, 9, 13, 17 and 20 of growth. Group 3 received 400 ng antisuppressor IgG and 3xl07 antitumor CTL on the same days of tumor growth as the first two groups. Control B10 mice received intravenous injections of phosphate buffer with 0.1% FCS. Tumor volume was considered proportional to the product of two perpendicular measurements using vernier callipers.
Significance of difference between values and groups of 5-6 mice was assessed by Student’s Mest.
Results. The in vitro treatment of murine STS with antisuppressor monoclonal antibodies from hybridoma D6 culture supernatant and with antisuppressor IgG in the complement presence led to suppression of their functional activity in mixed lymphocyte culture in a dose-dependent manner (fig. 1). Antisuppressor monoclonal antibodies neutralized activity of STS from B10.D2 anti-BlO, B10 anti-B10.D2 and CBA anti-BlO mice.
Administration of antisuppressor IgG to B10.D2 anti-BlO, B10 anti-B10.D2 and CBA anti-BlO prevented STS generation (fig.2). Similarly to in vitro experiments the suppression inhibition did not depend on mouse lineage, i.e. suppressor generation was inhibited in B10.D2 anti-BlO, B10 anti-B10.D2 and CBA anti-BlO.
It was shown by indirect immunofluorescence assay that antisuppressor monoclonal antibodies bound to epitope expressed on T-suppressors and belonged to IgG immunoglobulins because T-cell fluorescence was observed in assays with FITC-labeled anti-IgG as the second antibody and was absent when anti-IgM antibody was used.
Unlike STS in vitro treatment of killer cells with antisuppressor monoclonal antibodies failed to inhibit their functional activity (fig.3). This treatment did not change cytotoxic activity either in allospecific CTL from B10.D2 anti-BlO or in antitumor CTL from B10 anti-MX-11.
Administration of antisuppressor IgG to mice with sarcoma MX-11 induced but slight tumor growth inhibition during days 6 to 30 (fig. 4). A similar slow down in growth of MX-11 was observed in adoptive transfer of antitumor CTL alone to B10 mice. All mice
с 0,1% ЭТС, содержащего 400 нг антисупрессорного IqG. Контрольной группе мышей внутривенно вводили фосфатный буфер с 0,1% ЭТС, не содержащий очищенный антисупрессорный IqG.
Первой группе мышей В10 с саркомой МХ-11, как было описано выше, на 2, 5, 8, 11, 17, 20, 23 и 28-й дни вводили 400 нг антисупрессорного IqG, второй — на 6, 9, 13, 17 и 20-й дни роста опухоли — 107 противоопухолевых ЦТЛ, третьей — 400 нг антисупрессорного IqG и 3 • 107 противоопухолевых ЦТЛ в те же дни роста опухоли, что и первым двум группам. В контроле мышам В10 внутривенно вводили фосфатный буфер с 0,1% ЭТС. Величину объема опухоли считали пропорциональной произведению двух перпендикулярных измерений опухоли штангенциркулем.
Достоверность разницы между значениями и группами из 5—6 мышей определяли по критерию Стьюдента.
Результаты. Обработка in vitro СТС мышей анти-супрессорными моноклональными антителами из культурального супернатанта гибридомы D6 и антисупрес-сорным IqG в присутствии комплемента приводила к подавлению их функциональной активности в смешанной культуре лимфоцитов, зависимого от дозы СТС (рис. 1). Антисупрессорными моноклональными антителами нейтрализовали активность как СТС B10.D2 анти-ВЮ, так и СТС В10 анти-ВЮ.D2 и СВА анти-ВЮ.
Введение мышам B10.D2 анти-ВЮ, В10 анти-В1(Ш2 и СВА анти-ВЮ антисупрессорного IqG приводило к предотвращению генерации СТС (рис. 2). Так же, как и в опытах in vitro, эффект подавления супрессии не зависел от линейной принадлежности мышей, т. е. подавлялась генерация супрессоров как B10.D2 анти-ВЮ, так и СТС В10 анти-ВЮ.D2 и СВА анти-ВЮ.
В реакции непрямой иммунофлюоресценции было показано, что антисупрессорные моноклональные антитела связывались с эпитопом, экспрессированном на Т-супрессорах, и принадлежали к IqG-классу иммуноглобулинов, поскольку свечение Т-клеток наблюдалось при использовании в качестве вторичных антител, меченных изоционатом флюоресцеина анти-IqG, и не наблюдалось в случае использования анти-1цС-антител.
В отличие от эффекта на СТС обработка антисупрессорными моноклональными антителами киллер-ных клеток in vitro не приводила к отмене их функциональной активности (рис. 3). При этой обработке не происходило изменений как цитотоксической активности аллоспецифических ЦТЛ B10.D2 анти-ВЮ, так и противоопухолевых ЦТЛ В10 анти-МХ-11.
Введение мышам с саркомой МХ-11 антисупрессорного IqG приводило к незначительному, наблюдаемому с 6-го по 30-й день подавлению роста опухоли (рис. 4). Подобный эффект замедления роста МХ-11 наблюдали при адоптивном переносе мышам В10 только одних противоопухолевых ЦТЛ. Все мыши этих экспериментальных групп погибли от роста саркомы в более поздние сроки, чем в контрольных группах. Наиболее значительный эффект торможения роста МХ-11 у мышей ВЮ был получен при комбинированном введении антисупрессорного IqG и противоопухолевых ЦТЛ. В этой группе из 6 животных 4 мыши с МХ-11 погибли в более поздние сроки, чем мыши, получившие только антисупрессорные моноклональные антитела либо только ЦТЛ, в то время как у 2 мышей из этой
ABC
ь
100
ABC
с
Рис. 2. Предотвращение генерации СТС у мышей при введении им in vivo антисупрессорного IqG.
Мышам B10.D2 анти-ВЮ (а), ВЮ анти-ВЮ.D2 (Ь) и СВА анти-ВЮ (с) не вводили (А) либо вводили внутривенно 400 нг очищенного аффинной хроматографией антисупрессорного IqG в фосфатном буфере с 0,1% ЭТС (S), либо фосфатный буфер с 0,1% ЭТС (С). Эффект отмены супрессии достоверен для р < 01— 0,001.
Fig. 2. Prevention of STS generation in mice after in vivo administration of antisuppressor IgG.
Mice B10.D2 anti-ВЮ (a), B10 anti-B10.D2 (b) and CBA anti-B10 (c) received no treatment (A) or received intravenously 400 ng antisuppressor IgG purified by affinity chromatography in phosphate buffer with 0.1% FCS (8), or phosphate buffer with 0.1% FCS (C). Suppression removal is statistically significant at p< 0.001.
а
Рис. 3. Обработка in vitro аллоспецифических и противоопухолевых ЦТЛ антисупрессорными моноклональными антителами.
Результаты двух опытов (а, Ь). ЦТЛ B10.D2 анти-ВЮ и В10 анти-МХ-11 не обрабатывали (Л) либо обрабатывали в присутствии комплемента антисупрессорными моноклональными антителами из культурального супернатанта гибридомы D6 в разведении 1 :4 (8), ростовой средой для гибридом (С), а, b 1: ЦТЛ B10.D2 анти-ВЮ, клетки-мишени — МХ-11. Отношение эффектов к КМ: а — 50 к 1; b — 25 к 1; с—12,5 к 1. Эффект отмены цитотоксичности отсутствует (Ь) для р < 0,1—0,5. По вертикали — цитотоксический индекс, %.
Fig. 3. In vitro treatment of aiiospecific and antitumor CTL with antisuppressor monoclonal antibodies.
Results of two experiments (a and b). CTL from B10.D2 anti-B10 and B10 anti-MX-11 underwent no treatment (Л), treatment with antisuppressor monoclonal antibodies from hybridoma D6 culture supernatant in 1 :4 dilution in the complement presence (Б), with hybridoma growth medium (C). a, b: 1, CTL from B10.D2 anti B10, target cells - blasts from B10; 2, CTL from B10 anti MX-11, target cells - MX-11. Effect-to-TC ratio: a, 50:1; b, 25:1; c, 12.5:1. Cytotoxicity removal absent (b) at p < 0.5.
Numbers on the vertical show suppression index (in %).
группы через 2 нед после введения опухолевых клеток произошло отторжение опухолевого трансплантата.
Обсуждение. Иммунизация сингенных мышей-реципиентов BALB/c концентрированными СТС B10D2 анти-ВЮ, специфичными к антигенам Н-2, являлось основой для получения антисупрессорных моноклональных антител. Скрининг по тесту отмены функциональной активности СТС в смешанной культуре лимфоцитов супернатантами различных гибридом позволил выявить гибридому D6, секретирующую антисупрессор-ные моноклональные антитела.
Антисупрессорные моноклональные антитела из культурального супернатанта гибридомы D6 и аффинно-очищенный антисупрессорный IqG в присутствии комплемента подавляли активность СТС в опытах in vitro и in vivo вне зависимости от их линейной принадлежности и не оказывали влияния на действие аллоспецифических и противоопухолевых ЦТЛ. Полученные данные свидетельствовали о возможности распознавания с помощью антисупрессорных моноклональных антител эпитопов на СТС и их отсутствии на поверхности ЦТЛ. Сингенный вариант получения антисупрессорных моноклональных антител и отсутствие линейной специфичности их действия свидетельствуют скорее о возможности распознавания этими антителами эпитопа СТС, сцепленного с рецептором для антигена, чем дифференцировочного маркера универсального типа, отличающего СТС от ЦТЛ. По предварительным данным, антисупрессорные моноклональные антитела связываются с экспрессированным на СТС белком молекулярной массы 22 кД.
Многократное введение в хвостовую вену мышей В10 400 нг/день очищенных аффинной хроматографией антисупрессорных антител приводило к незначительному эффекту торможения роста сингенной саркомы
from the experimental groups died from sarcoma progression at later terms than the controls. The greatest MX-11 growth inhibition was achieved after combined administration of antisuppressor IgG and antitumor CTL. In this group 4 of 6 mice with MX-11 died at later terms than mice receiving antisuppressor monoclonal antibodies alone or CTL alone, while 2 mice from this group presented with tumor graft rejection at 2 weeks after tumor cell administration.
Discussion. Generation of antisuppressor monoclonal antibodies was based on immunization of BALB/c syngeneic recipient mice with concentrated STS specific to antigen H-2 from B10.D2 anti-BlO. Screening based on STS functional activity removal in mixed lymphocyte culture using supernatants of various hybridomas showed hybridoma D6 to secret antisuppressor monoclonal antibodies.
Antisuppressor monoclonal antibodies from hybridoma D6 culture supernatant and affinity-purified antisuppressor IgG in the complement presence inhibited STS activity in vitro and in vivo irrespective of lineage and had no effect on aiiospecific and antitumor CTL activities. These findings proved possible recognition of epitopes on STS and their absence on CTL using antisuppressor monoclonal antibodies. The syngeneic variant of antisuppressor monoclonal antibody generation and the absence of line specificity in their action prove the possibility of utilizing these antibodies to recognize a STS epitope linked to antigen receptor rather than a universal differentiation marker distinguishing STS from CTL. According to some preliminary data antisuppressor monoclonal antibodies bind to protein with molecular weight 22 CHARY expressed on STS.
MX-11. По-видимому, взаимодействие антисупрессор-ных моноклональных антител с Т-супрессорами приводит к нейтрализации их активности и увеличению срока функционирования индуцированных опухолеассоциированными антигенами ЦТЛ, которые могут элиминировать опухолевые клетки.
Комбинированное использование антисупрессор-ных моноклональных антител и противоопухолевых ЦТЛ оказалось более эффективным механизмом подавления роста сингенной саркомы у мышей. Нами показано, что внутривенное введение антисупрессор-ного иммуноглобулина в сочетании с адоптивным переносом противоопухолевых ЦТЛ приводило к подавлению роста МХ-11 у мышей вплоть до ее отторжения у отдельных животных, в то время как использование одних ЦТЛ либо антисупресорного иммуноглобулина только тормозило рост опухоли. Очевидно, в случае комбинированной обработки увеличивается период терапевтического действия на опухоль противоопухолевых киллеров за счет адоптивной иммунотерапии. Таким образорм, сочетание этих воздействий может применяться для регуляции противоопухолевого иммунитета и у человека.
ЛИТЕРА ТУРА / REFERENCES
1. Аброиипа И. <!>., Броидз Б. Д., Суслов А. П., Зайцева М. Б. и др. Мол. биол. — 1981, —Т. 15, —С. 1131 — 143.
2. Лупатов А.Ю., Броидз Б.Д. II Бюл. экспер. биол.—1992.—№ 2.— С.184—186.
3. Лупатов А. Ю., Броидз Б. Д. //Там же. — 1992. — № 2. — С. 186—188.
4. Berendt M.J., North R.J./П. exp. Med.— 1980. — Vol. 151.— P.69.
5. Brondz B. D., Abronina I. F, Zaitseva М. B., Chervonsky A. V. /I International congress of immunology, 6-th: Abstracts.—Toronto, 1986.
6. Brondz B. D., Karaulov A. V., Abronina I. F., Blandova Z. K. //Mol. Immunol. — 1980. — Vol. 17. — P. 833.
7. Brondz B. D., Karaulov A. V., Abronina /. Blandova Z. К. II Scand. J. Immunol.— 1981. — Vol. 13. — P. 517.
8. Dorf M.E., Benacerraf В. II Immunol. Rev.— 1985. — Vol. 83.— P.23.
9. Fujimoto S., Green М. I., Sehon A. H. II J. Immunol. — 1976.— Vol. 116.— P. 791.
10. Germain R. N.. Benacerraf В. II Scand. J. Immunol.— 1981.— Vol. 13, —P. 1.
11. Green D. R., Floosd P. М., Gershon R. К. II Ann. Rev. Immunol. — 1983.— Vol. 1, —P. 439.
12. Mills C D., North R.J., Dye E.S.Hi. exp. Med. — 1981. — Vol. 154.— P. 621.
13. Naor D. //Adv. Cancer Res. — 1979. — Vol. 29. — P. 45.
14. Perry L. L„ Green М. I. II Fed. Proc. — 1981. — Vol. 40. — P. 39.
15. Tada Т., Okumura K. // Adv. Immunol. — 1979. — Vol. 28. — P. 1.
Поступила 14.09.95 / Submitted 14.09.95
Рис. 4. Подавление роста опухоли у мышей антисупрес-сорным IqG в сочетании с адоптивным переносом специфических противоопухолевых ЦТЛ.
Эффект подавления роста опухоли МХ-11 в результате внутривенного введения антисупрессорного иммуноглобулина, противоопухолевых ЦТЛ и их комбинации достоверен для р < 01—0,001. 1 — контроль, 2—антисупрессорный IqG, 3— противоопухолевые ЦТЛ, 4 — антисупрессорный IqG + противоопухолевые ЦТЛ. По вертикали — диаметр опухоли, мм; по горизонтали — время после введения клеток МХ-11, сут.
Fig. 4. Tumor growth inhibition in mice by antisuppressor IgG in combination with adoptive transfer of specific antitumor CTL.
MX-11 growth inhibition as a result of intravenous administration of antisuppressor immunoglobulin, antitumor CTL and their combination is significant at p< 0.001. 1, control; 2, antisuppressor IgG; 3, antitumor CTL; 4, antisuppressor IgG + antitumor CTL. Number on the vertical show mm of tumor diameter; numbers on the horizontal show days following MX-11 cell administration.
Multiple administration of antisuppressor monoclonal antibodies purified by affinity chromatography at 400 ng/d to tail vein of B10 mice led to a slight inhibition of growth of syngeneic sarcoma MX-11. It seems that interaction of the antisuppressor monoclonal antibodies with T-suppressors results in neutralization of their activity and prolongation of functioning of induced tumor-associated CTL antigens that can eliminate tumor cells.
Combined administration of antisuppressor monoclonal antibodies and antitumor CTL was more efficient in inhibiting syngeneic sarcoma growth in mice. We showed that intravenous administration of antisuppressor immunoglobulin in combination with adoptive transfer of antitumor CTL suppressed MX-11 growth in mice and even caused its rejection in some animals, while the use of CTL alone or antisuppressor immunoglobulin alone induced but milder tumor growth inhibition. There is apparently prolongation of antitumor killers’ action on the tumor as a result of the adoptive immunotherapy. Thus, the combination of these treatments may be used to regulate antitumor immunity in humans.
