CC BY
57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.371:579.841.95].012.6
Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Павлов В.М.
ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ВАКЦИННОГО ШТАММА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
БЕЗ ОДНОЙ КОПИИ ГЕНА iglC И БЕЗ ГЕНА гесЛ
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279, Оболенск, Московская область,
Российская Федерация
Используемая в России для профилактики туляремии живая вакцина на основе штамма Francisella tularensis subsp. holarc-tica 15 линии НИИЭГ является высокоэффективной, однако проявляет определенную реактогенность и нестабильность. Поэтому разработка стабильной живой туляремийной вакцины с минимальным побочным действием остается актуальной проблемой. Методом аллельного обмена в вакцинном штамме F tularensis проведено удаление одной копии гена iglC, продукт которого необходим для внутриклеточного размножения вакцинного штамма, и гена recA, играющего ключевую роль при гомологичной рекомбинации. Для замены интактных участков хромосомы F. tularensis на модифицированные сконструировали суицидный вектор pGM5 на основе бирепликонной плаз-миды pHV33. Модифицированные фрагменты хромосомы содержали участок ДНК F. tularensis без структурной части гена iglC размером 545 п.о. (в плазмиде pGMAiglC) и участок ДНК без структурной части гена recA размером 1060 п.о. (в плазмиде pGMArecA) соответственно. По сравнению с вакцинным штаммом 15 сконструированный мутант 15/23-1ArecA размножался в макрофагоподобных клетках линии J774A.1 в 8-10 раз медленнее. Мыши линии BALB/c на иммунизацию штаммом 15/23-1ArecA реагировали меньшим снижением веса (~ 2 %), чем на штамм 15 (~ 14 %). Бактерии штамма 15/23-1ArecA практически не высевались из селезенок мышей BALB/c через 14 сут после заражения, в то время как бактерии штамма 15 обнаруживали в органах и на 21-е сутки. Штамм F. tularensis 15/23-1ArecA, обладающий сниженной реактогенностью, можно использовать в качестве основы для создания стабильной и безопасной живой туляремийной вакцины. Ключевые слова: вакцинный штамм Francisella tularensis; аллельный обмен; ген iglC; ген recA.
В настоящее время для профилактики туляремии на территории стран бывшего СССР используют вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 линии НИИЭГ [1]. В странах Западной Европы и Северной Америки в экспериментальных целях применяют живую вакцину на основе штамма F. tularensis LVS (Live Vaccine Strain), полученного в результате многочисленных пассажей F. tularensis 15 in vitro [2].
Оба вакцинных штамма F. tularensis имеют ряд недостатков, основными из которых являются высокая реактогенность и нестабильность. Повышенная реактогенность проявляется у 6-10% вакцинированных людей в виде подъема температуры, возникновения лихорадки и воспаления регионарных лимфоузлов. Эти негативные явления чаще наблюдаются при вакцинации детей. Поэтому применение живой туляремийной вакцины, приготовленной на основе штамма 15, для вакцинации людей с ослабленным иммунитетом и детей нежелательно [3]. Штамму LVS присущи те же недостатки, что и штамму 15, и это, в частности, препятствует его лицензированию в качестве вакцинного штамма в США [4].
Штамм F. tularensis LVS и, возможно, штамм 15 содержат множественные генетические отличия от природных изолятов, включая как точечные мутации, так и большие делеции [5]. Отмечается диссоциация вакцинных штаммов при культивировании, пересевах и хранении на агаровых питательных средах [6, 7]. Вклад каждого генетического дефекта в аттенуацию и протектив-ные свойства штаммов LVS и 15 остается неизученным. Возможность реверсии вакцинного штамма к исходной вирулентной форме при пассировании in vivo также нельзя исключить из-за наличия функционирующей системы рекомбинации.
Поэтому в настоящее время разработка живой туля-ремийной вакцины, лишенной указанных недостатков, остается актуальной проблемой. Главным требованием, предъявляемым к создаваемым прототипам живой туляремийной вакцины, является сниженная реактогенность при сохранении протективных свойств. Генетическая стабильность штамма при культивировании in vitro и in vivo и исключение возможности реверсий также являются желательными свойствами новых вакцинных штаммов. Геном штамма-прототипа живой туляремийной вакцины должен нести маркеры для его дифференциации от штаммов дикого типа [8]. Оптимальный путь получения таких штаммов - направленный мутагенез генов патогенности F. tularensis. Ранее были предложены методы делеции генов или фрагментов генов в туляремийном микробе в результате ал-лельного обмена. В этих методах модифицированный фрагмент генома переносили в клетки F. tularensis посредством межвидовой мобилизации рекомбинантных плазмид, созданных на базе плазмидного вектора pPV [9], либо с помощью трансформации рекомбинантных плазмид, содержащих репликон плазмиды pFNL 10 с fe-мутацией гена repA [10].
Одним из ключевых генов, кодирующих факторы па-тогенности F. tularensis, является ген iglC [5, 11—13]. Ген iglC отвечает за размножение F. tularensis в фагоцитах и присутствует в хромосоме в двух копиях [9]. Делеция одной копии гена iglC в геноме штамма F. tularensis 15 приводит к его частичной аттенуации [14].
Ключевыми генами системы рекомбинации бактерий являются гены recA и recD [15, 16]. Делеция генов recA или recD приводит к утрате способности к гомологичной рекомбинации и обеспечивает стабилизацию свойств мутантного штамма [16].
В данной работе создан суицидный вектор pGM5 для переноса модифицированных фрагментов генома F. tularensis методом трансформации в вакцинный штамм туляремийного микроба, получен вариант вакцинного штамма F. tularensis 15, отличающийся от штамма 15 отсутствием одной копии гена iglC и гена recA, изуче-
Для корреспонденции: Мокриевич Александр Николаевич, e-mail: [email protected]
ны его способность к размножению in vitro и in vivo и влияние на изменение веса линейных мышей в процессе иммунизации.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры. Штаммы, плазмиды и проверочные праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 1. Праймеры для синтеза модифицированных участков генома F. tularensis приведены в табл. 2 и 3.
Лабораторные животные. В работе использовали инбред-ных мышей линии BALB/c обоего пола (питомник «Пущино», филиал института биоорганической химии Российской академии наук, г. Пущино, Московская обл.). Масса тела мышей 18-20 г, возраст 6-8 нед. Содержание и манипуляции с животными выполняли в виварии, соответствующем требованиям GAC (Good Animal Care [19]) и протоколу № P03-20 комитета по биоэтике ФБУН ГНЦПМБ.
Условия культивирования. Штаммы E. coli выращивали при температуре 37 °С на плотной (LA) и в жидкой питательной среде Лурия-Бертани [20], при необходимости в среды добавляли антибиотики (100 мкг/мл ампициллина или 20 мкг/мл хлорам-феникола). Штаммы F. tularensis выращивали при температуре 37 °С на плотной питательной среде для выращивания туляре-мийного микроба (FT-агар, ФБУН ГНЦПМБ, Оболенск, Московская обл.) и в жидкой питательной среде [21]. При необходимости в среду добавляли 100 мкг/мл полимиксина B, 5% сахарозы и 3 мкг/мл хлорамфеникола.
Манипуляции с ДНК. Выделение плазмидных ДНК из клеток E. coli, плазмидную трансформацию клеток E. coli, генно-инженерные операции проводили по методикам, изложенным в работе [22]. Выделение плазмидной ДНК из клеток F. tularensis выполняли, как описано ранее [23]. Электропорацию бактерий F. tularensis плазмидной ДНК проводили по [24]. В качестве ма-
трицы для амплификации фрагментов ДНК использовали бактериальные суспензии в концентрации 109 кл/мл, инактивиро-ванные нагреванием при температуре 95 °С в течение 15 мин. Дизайн праймеров для амплификации целевых фрагментов хромосомы туляремийного микроба проводили с использованием последовательности генома F. tularensis ssp. holarctica IVS (Gen Bank NCBI, NC_007880.1).
Конструирование суицидного вектора pGM5. Суицидный вектор был получен в результате трехэтапной модификации бирепликонной плазмиды pHV33 [l8], состоящей из плазмид pBR322 и pC194.
1. Получение плазмидыpHV33'mob. Плазмидную ДНК pHV33 линеаризовали рестриктазой BamHI и лигировали с Bam HI-фрагментом ДНК размером 1,7 т.п.о. с mob-областью плазмиды RP4, взятым из плазмиды pPV [9]. Полученным лигатом трансформировали клетки штамма E. coli DH5a, трансформанты отбирали на среде 1A с хлорамфениколом (20 мкг/мл). В результате получили два варианта клонов. Один вариант содержал плазмиду размером ~ 7,2 т.п.о., другой - плазмиду размером ~ 7 т.п.о. Меньшая плазмида была лишена по данным секвени-рования участка плазмиды pC194, прилегающего к области начала репликации, размером ~ 0,2 т.п.о. Делегированный вариант плазмиды pHV33mob был назван pHV33'mob (рис. 1).
2. Получение плазмиды pHV33'mobsacB. Для контрселекции клонов с интегрированной в хромосому туляремийного микроба рекомбинантной плазмидой в вектор pHV33'mob был встроен ген sacB Bacillus subtilis. ДНК pHV33'mob линеаризовали рестриктазой EcoRI и липкие концы достраивали с помощью ДНК-полимеразы фага Т4. PstI-фрагмент ДНК размером 2,4 т.п.о. с геном sacB был взят из плазмиды pPV [9] и обработан ДНК-полимеразой фага Т4. Линейную плазмиду pHV33'mob и фрагмент с геном sacB лигировали. Лигатом трансформировали клетки E. coli DH5a. Трансформанты отбирали на среде 1A с хлорамфениколом (20 мкг/мл). Функциональную активность гена sacB в
Таблица 1
Бактериальные штаммы, плазмиды и проверочные праймеры
Название
Характеристика
Источник или ссылка
F. tularensis 15 линии НИИЭГ F. tularensis 15/23-1 F. tularensis 15/23-MrecA E. coli DH5a
pHV33
pHV33'
pHV33s mob
pHV33' mobsacB
pPV
pGM5
pGMMglC
pGMArecA
pBluescriptlISK(-)
23SalL25
23SalR25
23CF
23CR
CCF
CCR
Штаммы subsp. holarctica, вакцинный штамм
F. tularensis 15 линии НИИЭГ с инактивированной одной из двух копий гена iglC F tularensis 15/23-1 без гена recA
F- (<p80dlacZAM15) recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17(rt - m+) supE44 relAl deoR A(lacZYA-argF) U169
Плазмиды Фенотип в E. coli AmpR, CmR, TcR Фенотип в F. tularensis CmR, Tcs Фенотип в E. coli AmpR, CmR, TcR Фенотип в F. tularensis CmR, Tcs pHV33' с mob-областью плазмиды RP4 pHV33'mob с геном .sacB B. .subtilis AmpR, CmR, sacB, mob AmpR, CmR, sacB
AmpR, CmR, sacB, 3 т.п.о. область генома F. tularensis 15 с делецией 545 п.о. в гене iglC
AmpR, Cm-®, sacB, 3 т.п.о. область генома F. tularensis 15 с делецией 1060 п.о. в
гене recA
AmpR
Проверочные праймеры 5'-ACGCGTCGACAAACACTAATAAAGCC-3' 5'-GCGTGTCGACACAAGAAGCTGCTAATGCT-3' 5'-AAGGATAAGACCTGTCTG-3' 5'-TTGAAACCATACCGGGTA-3' 5'-ACAATTGGAAGAGAAAAGA-3' 5'-CTATCTGACAATTCCTGA-3'
«ГКПМ-Оболенск»* Данная работа То же «ГКПМ-Оболенск», [17]
[18]
Данная работа То же
[9]
Данная работа То же
«Fermentas» (Литва)
[9] [9] [14] [14]
Данная работа То же
*«ГКПМ-Оболенск» - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) Роспотребнадзора.
Таблица 2
Праймеры для амплификации 5'- и З'-фланкирующих областей гена iglC
FtiglCL15
Левое плечо
ACGCGTCGACTACAATGCTAGAAACCTT Sali
2S
1476
1557
FtiglCLO TCGGGATCCTATACATGCAGTAGGA BamHI
Правое плечо
FtiglCRO AAAGGATCCCTGCATAGTAAGATCGGA BamHI
FtiglCR15 GCGTGTCGACTTAGCCGTGCCAATTACCA Sali
Примечание. а Подчеркнуты сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции. * п.о. - пар оснований.
Таблица 3
Праймеры для амплификации 5'- и З'-фланкирующих областей гена recA
25
27
29
FSA RBA
FBA
RSA
Левое плечо
AAAGTCGACCTGGTGGTTTGATGGTT Sali
AAAGGATCCTTAAACTGATTCTAGCGCCTTT
BamHi
Правое плечо
AAAGGATCCTAAGCAGTTACTCAAGATGAG BamHi
AAAGTCGACTACCATTCTCAAGGTACT Sali
26 З1
З0
27
плазмиде pHV33'mobsacB проверяли по подавлению роста бактерий E. coli DH5a(pHV33'mobsacB) на среде с 5 % сахарозой.
3. Создание плазмидного вектора pGM5 для аллельного обмена в туляремийном микробе. Для удаления BamH-сайта из плазмиды pHV33'mobsacB BamHI-фрагмент с mob-областью был заменен на Sau3A-фрагмент хромосомной ДНК из E. coli DH5a. С целью увеличения количества уникальных сайтов для клонирования фрагмент полилинкера плазмиды pBlueskript II SK(-), фланкированный сайтами Eco52I[XmaIII]-SalI, был встроен в плазмиду pHV33'mobsacB между сайтами узнавания Eco52I[XmaIII] и SalI. Схема суицидного вектора pGM5 для сайтнаправленного мутагенеза туляремийного микроба приведена на рис. 2.
Конструирование плазмиды для мутагенеза гена iglC. Области генома до и после гена iglC размером 1476 п.о. (5'-левое плечо) и размером 1557 п.о. (З'-правое плечо), включая первые 78 нуклеотидов и последние 8 нуклеотидов гена iglC соответственно, амплифицировали с использованием в качестве матрицы ДНК F. tularensis 15. Праймеры для левого плеча, FtiglCL 15 и FtiglCLO, содержали рестрикционные сайты SalI и BamHI соответственно. Праймеры для правого плеча, FtiglCRO и FtiglCR15, содержали рестрикционные сайты BamHI и SalI соответственно (см. табл. 2).
Полученные ампликоны обрабатывали рестриктазами SalI и BamHI, объединяли, смешивали с плазмидной ДНК pGM5, рестрицированной по сайту SalI и дефосфорилированной, и ли-гировали. Лигазной смесью трансформировали клетки E. coli. Отбор трансформантов проводили по фенотипу ApRCmR. Полученные клоны проверяли в ПЦР с праймерами FtiglCL 15 и FtiglCR15 на наличие в плазмиде модифицированного участка ДНК F. tularensis без гена iglC. Штамм E. coli DH5a(pGMAiglC) содержал плазмиду pGMAiglC с делегированным геном iglC.
Плазмиду pGMAiglC использовали для аллельного обмена интактного участка хромосомы F. tularensis 15 на модифицированный - без гена iglC.
Интеграция плазмиды pGMAiglC в хромосому F. tularensis 15. Плазмиду в клетки F. tularensis 15 вводили методом электропорации. В результате на 3-и сутки инкубации были получены два типа колоний: крупные и мелкие. При пересеве колоний на плотную питательную среду с хло-рамфениколом через 24 ч инкубации вырастала только культура из крупных колоний. В бактериях этой культуры по данным ПЦР с проверочными праймерами 23CF и 23CR содержался наряду с интактным фрагментом, и модифицированный фрагмент - без гена iglC.
Аллельный обмен. Бактерии F. tularensis 15 с интегрированной плазмидой pGMAiglC суспендировали в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) pH 7,2 до концентрации 5109 кл/ мл, титровали с 10-кратным шагом до седьмого разведения и высевали по 0,2 мл из каждого разведения на FT-агар, содержащий 100 мкг/мл полимиксина B и 5 % сахарозы. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 72 ч. Среди выросших клонов отбирали варианты с фенотипом чувствительности к хлорамфениколу и устойчивости к сахарозе (CmsSucR). Для обнаружения вариантов F. tularensis с делецией одной копии гена iglC использовали метод ПЦР с парами праймеров: FtiglCL25-FtiglCR15 и FtiglCR25-FtiglCL 15 (см. табл. 2).
Конструирование плазмиды для мутагенеза гена recA. Области генома до и после гена recA размером 1592 п.о. (5'-левое плечо) и размером 1392 п.о. (З'-правое плечо), включая первые 28 нуклеотидов и последние 28 нуклеотидов гена recA соответственно, амплифицировали с использованием в качестве матрицы хромосомной
_ ДНК из штамма F. tularensis 15 и пар праймеров:
FSA и RBA, FBA и RSA (см. табл. 3). Амплико-ны обрабатывали рестриктазами Sali и BamHI, объединяли, смешивали с плазмидной ДНК pGM5, рестрициро-ванной по сайту Sali и дефосфорилированной, а затем лигирова-ли. Лигазной смесью трансформировали клетки штамма E. coli. Отбор трансформантов проводили по фенотипу ApRCmR. Полученные клоны проверяли в ПЦР с праймерами FSA и RSA на наличие в плазмиде модифицированного участка ДНК F. tularensis без гена recA.
Интеграция плазмиды pGMArecA в хромосому F. tularensis 15/23-1. Плазмиду в клетки F. tularensis 15/23-1 вводили методом электропорации. В крупных по размеру колониях по дан-
1592
1З92
Рис. 1. Схема плазмиды pHV33'mob.
Рис. 2. Схема плазмиды pGM5.
ным ПЦР с проверочными праймерами FSA и RSA, содержался, наряду с нативным фрагментом генома и модифицированный фрагмент без гена recA.
Аллельный обмен гена recA. Суспензию культуры трансформанта F. tularensis 15/23-1 с интегрированной плазмидой pGMArecA высевали на FT-агар, содержащий 100 мкг/мл поли-миксина B и 5% сахарозы. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 72 ч. Среди выросших клонов отбирали варианты с фенотипом CmsSucr. Для обнаружения бактерий F. tularensis с делецией гена recA использовали метод ПЦР с праймерами FSA и RSA.
Размножение бактерий в макрофагах. В работе использовали клетки линии J774A.1 (Российская коллекция клеточных культур, г. Санкт-Петербург) и перитонеальные макрофаги, выделенные из мышей линии BAlB/c [25]. Клетки вносили в 24-луночные планшеты («Costar», США) в количестве 105 клеток в лунку и инкубировали в полной питательной среде Dulbecco Eagle (10% феталь-ной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина) при температуре 37 °С, в атмосфере 5% СО2 и влажности 100% в течение 24 ч. Бактериальные суспензии F. tularensis, мутантных и исходных штаммов, вносили в лунки c монослоем макрофагов в соотношении 100 : 1 и выдерживали при температуре 37 °С и атмосфере 5% С02 в течение 2 ч. Внеклеточные бактерии инактивировали добавлением в культуральную среду 2 мкг/мл гентамицина и инкубацией в течение 1 ч. Для определения количества бактерий, захваченных макрофагами, через 3 ч после внесения бактерий в лунки добавляли по 0,5 мл 0,05% раствора дезоксихолата натрия для разрушения макрофагов. Через 15 мин из лизатов делали высевы на FT-агар. Ту же операцию повторяли через 24 и 48 ч размножения бактерий в макрофагах. Подсчет числа бактериальных колоний проводили через 72 ч инкубации при температуре 37 °С.
Персистенция штаммов F. tularensis в организме мышей. Стандартную суспензию ночной агаровой культуры готовили в ЗФР с использованием стандарта мутности. Из полученной взвеси с концентрацией 5109 КОЕ/мл готовили десятикратные разведения и для заражения использовали бактериальную суспензию с концентрацией 5102 КОЕ/мл. Экспериментальных животных (по 15 мышей в группе) иммунизировали подкожно штаммами F. tularensis 15/23-1ArecA и F. tularensis 15 по 102 КОЕ на животное. На 4, 7, 14 и 21-е сутки после заражения проводили эвтаназию животных (по 3 мыши), селезенки объединяли, гомогенизировали и суспендировали в 5 мл ЗФР. Из полученной взвеси готовили ряд десятикратных разведений. Высевы проводили на FT-агар и инкубировали при температуре 37 °С в течение 72 ч.
Реактогенность штаммов F. tularensis. Интегральной характеристикой реактогенности штаммов нами в данной работе была
Рис. 3. Схема рекомбинации плазмиды pGMAiglC и хромосомы F. tularensis.
I - вариант встраивания плазмиды pGMAiglC по левому плечу (left, L);
II - вариант встраивания плазмиды pGMAiglC по правому плечу (right, R).
принята динамика изменения веса экспериментальных животных. За массой животных после иммунизации штаммом F. tularensis 15/23-1ArecA в дозе 102 КОЕ следили в течение 21 сут. Для сравнения использовали мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15 в той же дозе. Мышей взвешивали группой по 5 животных в одно и то же время суток.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel.
Результаты и обсуждение
Особенностью созданного вектора pGM5 для сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба является его способность трансформировать клетки F. tularensis и крайне медленная репликация внутри туляремийного микроба, что существенно замедляет рост трансформантов с такой плазмидой на среде с хлорам-фениколом. Вероятно, такое поведение плазмиды связано с инактивацией гена repH плазмиды pC194, входящего в состав pGM5. Плазмидный скрининг медленно растущих на среде с хлорамфениколом клонов дал отрицательный результат, хотя их анализ методом ПЦР с использованием праймеров CCF и CCR показывал наличие гена cat плазмиды pGM5 (данные не приведены). По данным анализа нуклеотидной последовательности, в плазмиде pGM5 присутствует гибридный ген, состоящий из промотора гена repH pC194 и структурной части гена cat (данные не приведены). Возникновение подобной перестройки в плазмиде pHV33, являющейся основой для pGM5, наблюдали и ранее [26].
Для получения штамма F. tularensis без одной копии гена iglC была сконструирована плазмида pGMAiglC, ко-
8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Рис. 4. Электрофореграммы ампликонов, полученных с помощью праймеров FtigЮL25 - FtigЮR15 и FtiglCR25 - FtiglCЫ5 для выявления интеграции плазмиды по левому (а) и правому (б) плечам соответственно. а - 1-5, 7-11 - ПЦР-продукты, полученные на матрице ДНК из клонов F. tularensis; 6 - НшИП -фрагменты ДНК фага X; б - 1-6, 8-11 - ПЦР-продукты, полученные на матрице ДНК из клонов Е tularensis; 7 - НшИП -фрагменты ДНК фага X.
торая содержала фрагмент ДНК F. tularensis (3 т.п.о.) из области гена iglC, отличающийся от нативного фрагмента ДНК F. tularensis делецией в гене iglC размером 545 п.о. В результате трансформации плазмиды pGMAiglC в F. tularensis 15 были отобраны клоны с интегрированной в хромосому плазмидой. Схема возможных вариантов интеграции pGMAiglC в хромосому приведена на рис.3.
Для определения частоты интеграции плазмиды по левому и правому плечу от гена iglC (см. рис. 3) были проанализированы 10 клонов с интегрированной плазмидой (рис. 4). Появление ампликона размером 4 т.п.о. с праймерами FtiglCL25 и FtiglCR15 возможно, если в анализируемых клонах прошла гомологичная рекомбинация по левому плечу гена iglC. Интеграция плазмиды по левому плечу была выявлена в 4 клонах. Ампликон размером 4 т.п.о. с праймерами FtiglCR25 и FtiglCL 15 синтезируется, если гомологичная рекомбинация прошла по правому плечу от гена iglC. Интеграция плазми-ды по правому плечу была обнаружена в 6 клонах.
Анализ ПЦР 6 клонов, выросших на среде с сахарозой, с праймерами FtiglCL25 - FtiglCR15 и FtiglCR25 -FtiglCL15 показал, что 4 клона содержали ампликон размером 4,55 т.п.о., характерный для реципиентного штамма F. tularensis 15, а 2 клона давали ампликоны размером 4,55 и 4 т.п.о., что указывает на делецию одной из двух копий гена iglC. Анализ ПЦР ДНК одного из двух клонов (F. tularensis 15/23-1) с праймерами 23CF и 23 CR, специфичными к области хромосомы с геном iglC, показал наличие двух ампликонов размерами ~ 990 и ~ 450 п.о. которые соответствуют области генома с геном iglC и области без гена iglC соответственно. Анализ этого клона методом ПЦР с использованием праймеров CCF и CCR не выявил гена cat плазмиды pGMAiglC (данные не приведены).
Для получения штамма F. tularensis 15/23-1 без гена recA была сконструирована плазмида pGMArecA, которая содержала фрагмент ДНК F. tularensis (3 т.п.о.) из области гена recA, отличающийся от нативного фрагмента ДНК F. tularensis делецией в гене recA размером 1060 п.о. В результате трансформации плазмиды pGMArecA в F. tularensis 15/23-1 были отобраны клоны с интегрированной в хромосому плазмидой. Среди клонов, растущих на среде с сахарозой, было отобрано 6 клонов с фенотипом CmsSucR. С помощью ПЦР с праймерами FSA и RSA выявили 4 клона, у которых ампликоны имели размер 2949 п.о., тогда как у 2 клонов ампликоны имели размер 4009 п.о., что указывало на наличие в геноме делетиро-ванного или интактного варианта гена recA соответственно. Один из вариантов штамма с делетированным геном recA был обозначен как F. tularensis 15/23-1ArecA.
В штамме F. tularensis 15/23-1ArecA была подавлена возможность гомологичной рекомбинации. Данный факт
был выявлен на экспериментальной модели, использованной ранее для изучения рекомбинации в клетках ту-ляремийного микроба [16] (данные не приведены).
Скорость роста штамма Е tularensis 15/23-1ДесА на плотных и жидких питательных средах практически не отличалась от таковой у исходного вакцинного штамма. Деле-ция одной копии гена iglC и гена гесА из генома вакцинного штамма Е. tularensis 15 подавляла способность бактерий размножаться в клетках J774A.1 в 8-10 раз по сравнению с исходным штаммом. Бактерии контрольного и экспериментального штаммов в перитонеальных макрофагах размножались за 24 и 48 ч сходным образом (рис. 5).
Персистенцию бактерий штамма Е. tularensis 15/23-1ДгесА в организме мышей линии ВА1В/с определяли в течение 21 сут после подкожного введения бактерий. Динамика изменения обсемененности селезенок представлена в табл. 4.
Представленные в табл. 4 результаты свидетельствуют о том, что динамика элиминации бактерий штаммов Е. tularensis 15 и 15/23-1ДгесА из селезенок достоверно различается. Бактерии штамма Е. tularensis 15/23-1ДгесА практически не обнаруживали в селезенках мышей после 14 сут, в то время как в селезенках мышей, иммунизированных штаммом 15, туляремийный микроб обнаруживали на 21-е сутки методом высева на плотную питательную среду.
Lg КОЕ/мл
10,00п
9,00-
8,00-
7,00-
6,00-
5,00-
4,00-
3,00-
2,00- Ш
1,00-
0,00- У//,
сЯ
15
15/23-1ДгесА 15 15/23-1ДгесА
Клетки линии J774.1A
Перитонеальные макрофаги Штаммы, F. tularensis
3 ч
24 ч
48 ч
Рис. 5. Сравнение способности к размножению вакцинного штамма Е. tulаrensis 15 и штамма 15/23-1ДгесА в макрофагопо-добных клетках линии 1774.1А и перитонеальных макрофагах мышей линии ВА1В/с.
Таблица 4
Количество бактерий F tularensis в селезенках мышей, иммунизированных штаммами F tularen.sis 15 и 15/23-1АгесЛ в дозе 102 КОЕ (^ КОЕ/орган), в разное время после введения
Время наблюдения, сут F. tularensis 15, lg КОЕ/орган F. tularensis 15/23-1ДгесА, lg КОЕ/орган
4 5,1 ± 0,23 4,7 ± 0,28
7 5,8 ± 0,16 4,6 ± 0,27
14 3,1 ± 0,23 2,5 ± 0,21
21 2 ± 0,10 0
Для оценки реактогенности полученного варианта F. tularensis проводили взвешивание экспериментальных животных после иммунизации. График зависимости отклонения средней массы тела мышей в группах по сравнению с начальной массой тела мышей этих групп от времени после иммунизации животных приведен на рис. 6.
На введение бактерий штамма 15/23-1ДгесА мыши BALB/c реагировали незначительным снижением массы тела (менее 3%) в период 3-10 сут и уже к 11-м суткам масса тела достигала исходного значения и далее увеличивалась, тогда как снижение массы тела при иммунизации штаммом 15 было более значительным (около 15%) на 5-10-е сутки, и только к 21-м суткам масса тела животных вернулась к исходному значению.
В данной работе показана возможность использования созданного суицидного вектора pGM5 для переноса генетических конструкций в клетки туляремийного микроба. Такой перенос осуществляется в результате плазмидной трансформации, тогда как ранее для этих целей использовали метод мобилизации плазмид [9]. Данный подход позволяет в ряде случаев сократить количество этапов при проведении аллельного обмена в туляремийном микробе.
Используя вектор pGM5, был получен двойной мутант F. tularensis 15/23-1ДгесА, отличающийся от штамма F. tularensis 15 отсутствием одной копии гена iglC и гена recA.
Штамм 15/23-1ДгесА обладает сниженной реакто-генностью для экспериментальных мышей и его можно рассматривать в качестве основы при создании новой менее реактогенной вакцины против туляремии. Результаты детальной проверки сконструированного нами штамма на соответствие методическим указаниям МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» [8] (определение реактогенности испытуемого вакцинного штамма для морских свинок, без вредности и остаточной вирулентности по морфологическим показателям, стабильности биологических свойств, иммуногенной активности, а также по изучению стабильности полученного штамма при культивировании, сушке и хранении) будут представлены в последующих публикациях.
Работа выполнена по государственному контракту № 34-Д от 08.08.13 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)».
Сведения об авторах:
142279, Московская обл., Серпуховский р-н, Обо-ленск, ФБУНГНЦПМБ:
Мокриевич Александр Николаевич - канд. мед.наук, зав. отделом особо опасных инфекций (ООН), e-mail: [email protected];
-♦— 15 15/23-1ДгесА
Рис. 6. Динамика изменения массы тела мышей линии ВА1В/с после иммунизации штаммами F tularensis 15 и 15/23-1ДесЛ в дозе 102 КОЕ.
По оси абсцисс - время наблюдения, сут; по оси ординат - изменчивость массы тела, %. Светлые ромбы - 15/23-1ДгееЛ, черные ромбы - 15.
Вахрамеева Галина Михайловна - науч. сотр. лаб. микробиологии туляремии отдела ООИ;
Титарева Галина Михайловна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. микробиологии чумы отдела ООИ;
Бахтеева Ирина Викторовна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. микробиологии чумы отдела ООИ;
Миронова Раиса Ивановна - науч. сотр. лаб. микробиологии сибирской язвы отдела ООИ;
Комбарова Татьяна Ивановна - науч. сотр. лаб. биологических испытаний;
Кравченко Татьяна Борисовна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. микробиологии сибирской язвы отдела ООИ;
Дятлов Иван Алексеевич - д-р мед. наук, проф., чл.-корр. РАМН, директор, e-mail: [email protected];
Павлов Виталий Михайлович - д-р биол.наук, зав. лаб. микробиологии туляремии отдела ООИ, e-mail: [email protected].
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975.
Olsuf'ev N.G. Taxonomy, microbiology and laboratory diagnosis of the causative agent of tularemia. Moscow: Meditsina; 1975. (in Russian)
2. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4): 631-46.
3. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х; 1999. Medunitsyn N.V. Vaccinology. Moscow: Triada-Kh; 1999. 272 p. (in Russian)
4. Conlan J.W., Oyston P. C. F. Vaccines against Francisella tularensis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105: 325-50.
5. Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y. et al. Potential Source of Francisella tularensis Live Vaccine Strain Attenuation Determined by Genome Comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12): 6895-906.
6. Eigelsbach H.T., Downs C.M. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig. J. Immunol. 1961; 87: 415-25.
7. Sandstrom G. The tularemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994; 59: 315-20.
8. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба. Методические указания. МУ 3.3.1.2161-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2007. Basic requirements for tularemia microbe vaccine strains. Guidelines. 3.3.1.2161-07. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology. 2007. (in Russian)
9. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMSMicrobiol. Lett. 2003; 222: 273-80.
10. Maier T.M., Havig A., Casey M., Nano F.E., Frank D.W., Zahrt T.C. Construction and characterization of a highly efficient Francisella shuttle plasmid. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70: 7511-9.
11. Broekhuysen M., Larsson P., Johansson A., Bystrom M., Eriksson U., Larsson E. et al. Genome-wide DNA Microarray Analysis of Francisella tularensis Strains Demonstrates Extensive Genetic Conservation within the Species but Identi.es Regions that are Unique to the Highly Virulent F tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 2924-31.
12. Twine S.M., Mykytczuk N.C., Petit M.D., Shen H., Sjostedt A., Wayne C.J. et al. In vivo proteomic analysis of the intracellular bacterial pathogen, Francisella tularensis, isolated from mouse spleen. Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 2006; 345: 1621-33.
13. Larsson P., Oyston P.C.F., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius
H.H. et al. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37: 153-9.
14. Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б. и др. Создание и изучение вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis без генов iglC. Сообщение
I. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 117(3): 70-4. Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Mironova R.I., Kombarova T.I., Titareva G.M., Kravchenko T.B. et al. Construction and Investigation of the Vaccine Strain Francisella tularensis without iglC genes. Communication 1. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 117(3): 70-4. (in Russian)
15. Лапин А.А., Кравченко Т.Б., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Дятлов И.А. и др. Изучение влияния Уф-облучения и воздействия налидиксовой кислоты на индукцию RecA-белка в клетках Francisella tularensis 15/10. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 109(3): 36-9.
Lapin A.A., Kravchenko T.B., Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Kombarova T.I., Dyatlov I.A. et al. Study of the UV irradiation and nalid-icsic acid effect on the RecA-protein induction in Francisella tularensis 15/10 cells. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; 109(3): 36-39. (in Russian)
16. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Дятлов И.А. и др. Иммунобиологические свойства штамма Francisella tularensis 15/10 с делетированным геном recA. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 110(4): 65-7.
Lapin A.A., Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Kombarova T.I., Bakhteeva I.V., Dyatlov I.A. et al. Immunobiological properties of Francisella tularensis 15/10 strain with deleted recA Gene. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; 110(4): 65-7. (in Russian)
17. Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M. et al. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17: 3469-78.
18. Ehrlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978; 75:1433-6.
19. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington, DC: National Academy Press; 2010.
20. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир; 1976. Miller D. Experiments in molecular genetics. Moscow: Mir; 1976. (in Russian)
21. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Проблемы особо опасных инфекций. 2009; 102 (4): 66-7.
Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Domotenko L.V., Khramov M.V. Simple liquid nutrient medium for molecular genetic investigations
of Francisella tularensis. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2009; 102(4): 66-7. (in Russian)
22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.
Maniatis T., Frich E., Sembruk Dzh. Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning. Moscow: Mir; 1984. (in Russian)
23. Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like F6168: The base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; 13: 253-6.
24. Pomerantsev A.P., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., Obuchi M., Norqvist A. et al. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNL10. Plasmid. 2001; 46(3): 210-22.
25. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М.: Медицина; 1978. Uchitel' I.Ya. Macrophages in immunity. Moscow: Meditsina; 1978. (in Russian)
26. Goze A., Ehrlich S.D. Replication of plasmids from Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980; 77: 7333-7.
Поступила 12.05.2014
Received 12.05.2014
CONSTRUCTION AND PROPERTIES OF THE FRANCISELLA TULARENSIS VACCINE STRAIN WITHOUT ONE COPY OF THE IGLC GENE AND WITHOUT RECA GENE
Mokrievich A. N, Vakhrameeva G. M, Titareva G. M, Bakhteeva I. V., Mironova R. I., Kombarova T. I., Kravchenko T. B, Dyatlov I. A., Pavlov V. M.
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia
The live vaccine based on the Francisella tularensis subsp. holarctica vaccine strain 15 NIIEG line is used in Russia against tularemia. This vaccine is highly effective, but fairly unstable. Therefore, development of stable live tularemia vaccine with minimal side effect is rather urgent. The method of allel removal in the F. tularensis vaccine strain was used to remove one copy of the iglC gene, which is required to provide intracellular production of the vaccine strain, as well as removal of the recA gene. The latter is crucial for homological recombination. pGM5 suicide vector based on pHV33 bireplicon plasmid was constructed to provide replacement of intact F. tularensis chromosome segments by modified segments. Modified chromosome segments contain F. Tularensis DNA fragment without iglC structural gene segment 545 p. b. (in pGMAiglC plasmid), as well as DNA fragment containing no recA structural gene segment 1060 p.b. (pGMArecA plasmid). The constructed 15/23-1^ecA mutant, in contrast to the vaccine strain 15, was capable of reproducing in the macrophage-like cells J774A.1 line, whereas the efficiency of the reproduction was 8-10 times less. BALB/c mouse responded to immunization by the 15/23-1^ecA strain by smaller weight decrease (~2 %) as compared to the strain 15 (~14 %). Bacteria of the 15/23-1^ecA strain were virtually incapable of germinating from the BALB/c murine spleen 14 days after invasion, whereas bacteria of the strain 15 were found in the murine organs even after 21 days. The F. tularensis 15/23-1^ecA strain having smaller reaction ability can be used as a basis for construction of stable live safe tularemia vaccine.
Key words: Francisella tularensis vaccine strain, allelic exchange, gene iglC, gene recA.
ЮБИЛЕЙ
Исполнилось 80 лет члену редакционной коллегии журнала академику РАН Владимиру Алексеевичу Гвоздеву, зав. отделом Института молекулярной генетики РАН. Поздравляем уважаемого Владимира Алексеевича и желаем ему всего наилучшего!
