CC BY
57
Получение и изучение новых карбоксамидов антибиотиков эремомицина и ванкомицина с 4- или 3-аминометилфенилборной кислотой
Е. Н. БЫЧКОВА, А. М. КОРОЛЕВ, Е. Н. ОЛСУФЬЕВА, Е. П. МИРЧИНК, Е. Б. ИСАКОВА
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва
Design of Novel Carboxamides of Eremomycin and Vancomycin with 4- or 3-Amino Methyl Phenyl Boric Acid and Their Investigation
E. N. BYCHKOVA, A. M. KOROLEV, E. N. OLSUFYEVA, E. P. MIRCHINK, E. B. ISAKOVA G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
Амидированием концевой карбоксильной группы антибиотиков эремомицина и ванкомицина пинаколиновыши эфирами 4-или 3-аминометилфенилбороновыши кислотами в присутствии конденсирующего реагента PyBOP получены новые кар-боксамиды этих антибиотиков (IIIa—VIa). Удаление пинаколиновой группы в мягких условиях гидролиза в слабокислой водной среде привело к соответствующим производным с остатком незащищённой борной кислоты (III—VI). Установлено, что активность 4-замещенных производных борол-содержащих антибиотиков эремомицина и ванкомицина практически равна активности исходных антибиотиков, но выше активности соответствующих 3-замещённых производных борол-содержащих производных в отношении 8 штаммов грамположительных бактерий.
Ключевые слова: эремомицин, ванкомицин, 4- или 3-аминометилфенилборная кислота, амидирование, антибактериальная активность, стафилококки, энтерококки.
Amidation of the end carboxyl group of eremomycin and vancomycin by pinacolinic 4- or 3-amino methyl phenyl boron acids esters in the presence of the condensing reagent PyBOP resulted in formation of novel carboxamides of the antibiotics (IIIa—VIa). After elimination of the pinacolinic group under mild hydrolysis in weak acid aqueous medium there formed the respective derivatives with a residue of the nonprotected boric acid (III—VI). It was shown that the activity of the 4-substituted derivatives of the borole-con-taining eremomycin and vancomycin practically was the same as that of the initial antibiotics, while higher than that of the respective 3-substituted derivatives of the borole-containing derivatives against 8 strains of grampositive bacteria.
Key words: eremomycin, vancomycin, 4- or 3-amino methyl phenyl boric acid, amidation, antibacterial activity, staphylococci, ente-rococci.
Введение
Одной из наиболее актуальных проблем современной антибактериальной терапии стала ежегодно растущая устойчивость болезнетворных бактерий к применяемым антибиотикам [1, 2]. Макроциклические гликопептидные антибиотики — ванкомицин и тейкопланин высокоактивны в отношении грамположительных бактерий и относятся к антибиотикам резерва, поскольку они эффективны при лечении инфекционных заболеваний, вызванных, прежде всего, широко распространенными метициллиноус-тойчивыми стафилококками (МЯ8Д), на которые другие лекарственные средства не действуют. К гликопептидам долгое время не наблюдалось развития устойчивости бактерий.
© Коллектив авторов, 2015
Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, д.11. НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе
Однако применение ванкомицина в клинической практике и авопарцина в сельском хозяйстве привело к возникновению штаммов стафилококков и энтерококков, устойчивых к действию гликопептидов (GISA и GRE) [3, 4].
Направленная модификация природных антибиотиков позволяет получать соединения с заданными свойствами: улучшать фармакологические свойства, расширять спектр антимикробного действия и преодолевать резистентность штаммов, устойчивых к данной группе антибиотиков. Усилиями учёных разных стран разрабатываются подходы к созданию нового поколения гликопептидов, преодолевающих резистентность опасных патогенов путём направленной химической модификации природных антибиотиков [3, 5, 6]: Три препарата из класса полусинтетических гликопептидов — оритаванцин, телаванцин и далба-ванцин в настоящее время ограниченно разрешены к применению в клинике для лечения
некоторых видов воспалительных процессов, вызванных чувствительными и резистентными видами грамположительных бактерий [2, 7, 8].
Одним из эффективных направлений создания новых лекарственных средств является синтез антибиотиков двойного действия («dual action drugs») — химерных (гетеродимерных) структур на основе антибактериальных препаратов разных классов [9]. Особый интерес для конъюгации с антибиотиками представляют производные борной кислоты. Такие соединения способны к взаимодействию с различными биологически важными элементами структуры живой клетки — спиртами. аминоспиртами, углеводами, РНК и некоторыми пептидами. Это свойство может лежать в основе биологической активности подобных производных. Присоединение фрагмента, содержащего остаток борной кислоты, к молекуле антибиотика может существенно изменить его химические и биологические свойства [10].
До последнего времени бор-содержащие производные не привлекали внимания медицинских химиков. В настоящее время препарат Бортезо-мид (Велкаде) — [(1Я)-3-метил-1-({(28)-3-фе-нил-2-[(пирпазин-2-илкарбонил)амино]-пропа-ноил}-амино)-бутил]борная кислота [11]. Это первый терапевтический ингибитор протеосом, который применяется в клинике для лечения множественной миеломы и лимфомы. Недавно был открыт и исследован Б-боро-А1а (NH2-CHR-B(OR') — ингибитор ферментов аланин ра-цемазы и D-Ala-D-Ala лигазы, обладающий активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [12].
В настоящее время разрабатываются основные подходы и методы конъюгации бензоксабо-рол-содержащих производных, имеющих различные реакционноспособные группы, пригодные для конъюгации, со сложными полифункциональными антибиотиками — гликопептидами
[13], полиеновым макролидом амфотерицином B
[14] и макролидом кларитомицином [15]. Для ряда гибридных соединений, сочетающих в своей структуре замещённый бензоксаборол и антибиотик эремомицин (I), ванкомицин (II), или агли-кон тейкопланина продемонстрировали преимущества перед исходными антибиотиками [13].
Установлено, что введение борол-содержащего заместителя в молекулу антибиотика не приводит к заметному уменьшению активности в отношении чувствительных штаммов стафилококков и энтерококков. В то же время некоторые борол-содержащие конъюгаты проявляют активность в отношении устойчивых изолятов стафилококков GISA и энтерококков GRE.
Получение борол-содержащих антибиотиков представляет сложную синтетическую задачу. Внутримолекулярное взаимодействие фрагмента
борной кислоты и полифункционального антибиотика может препятствовать протеканию некоторых реакций, сопровождаться отщеплением фрагмента борной кислоты (деборированием), а также проблемой взаимодействия с реагентами и растворителями, содержащими подвижные протоны (например, спирты, амины и др.). Использование борол-содержащих соединений с незащищённой борольной группировкой часто сопровождается нежелательными процессами, что приводит к низким выходам целевых конъю-гатов [13, 14]. Необходимо также учитывать лабильность самих гликопептидных антибиотиков в условиях протекания реакций.
Материал и методы
В работе использованы: сульфат эремомицина (I), полученный на опытной установке ФГБНУ «НИИНА». Применялись реагенты и растворители Aldrich (США), Fluka (Швейцария) или Merck (Германия); гидрохлорид ванкомицина (II) — фирмы Sigma (США). Полноту прохождения реакций, процессы очистки и выделения, а также чистоту полученных соединений контролировали методами ТСХ и ВЭЖХ. ТСХ проводили на алюминиевых пластинках с силикагелем 60 F254 (20x20 см) (Merck, Германия). Аналитическую ВЭЖХ осуществляли на хроматографе LC-20 (Shimadzu, Япония) с использованием УФ-детектора. Запись велась на длине волны 280 нм. Использована следующая система и колонка (для системы 1): 0,6% HCOONH4, pH 7,8 и MeCN 8—15% 15 мин, 15—40% 15 мин, 40—70%, 10 мин (колонка Kromasil С8, 4,6x250 мм, размер 5 мкм). Препаративное выделение и очистку соединений осуществляли на колонках с силанизированным силика-гелем Kieselgel 60 silanisiert, 0,063—0,200 мм (Merck, Германия). УФ-спектры получали на приборе Unico UV/VIS, Япония. Масс-спектры HRMS получали при ионизации электрораспылением (ESI MS) на приборе Bruker «micrOTOF-Q II» (Bruker Daltonics GmbH, Бремен, Германия); образцы растворяли в водном МеОН или AcCN (0,1 мг/мл) и анализировали, вводя со скоростью 3 мкл/мин.
Синтез. Карбоксамиды эремомицина с 4-аминометилфе-нилборной кислотой (III) или 3-аминометилфенилборной кислотой (IV)
К 0.5 мл диметилсульфоксида при перемешивании добавляют 48 мг (0,03 ммоль) сульфата эремомицина, 80 мкл (0,6 ммоль) диизопропилэтиламина, 60 мг ( 0,2 ммоль) гидрохлорида пинаколинового эфира 4-аминометилфенилборной кислоты или 3-аминометилфенилборной кислоты и порциями 32 мг (0,06 ммоль) PyBOP. Прохождение реакции контролируют ТСХ на пластинках с силикагелем в системе: бутанол—уксус-ная кислота—вода (5:2:3). По окончании реакции диметил-сульфоксид удаляют 3-кратным добавлением диэтилового эфира (10 мл x 3), отбрасывая каждый раз слой эфира. Выпавшее густое масло растворяют в 0,5 мл воды и высаживают 10 мл ацетона. Полученный осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ацетоном, диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Получают в виде белых порошков амиды эремомицина или ванкомицина с пинаколиновыми эфирами 4- или 3-ами-нометилфенилборной кислоты, соответственно IIIa и IVa,. Выход IIIa — 45 мг. ВЭЖХ: Rt =26,2 (система 1). Масс-спектр ESI MS: вычислено для C86H107BClN11O27, м.в.= 1771.7119, найдено — m/z 1772,7224 [M+H]+1.
Выход IVa — 43 мг. ВЭЖХ: Rt =26,4 (система1). Масс-спектр, ESI MS: вычислено для C86H107BQN11O27, м.в.= 1771.7119, найдено — m/z 1771,7238 [M+H]+>.
Полученные порошки IIIa или IVa растворяют в минимальном объёме воды и наносят на колонку с силанизирован-
ным силикагелем, уравновешенным водой. Пропускают сначала 50 мл воды, затем систему 0,25 н уксусная кислота — 50% метанол (1:1). Фракции, содержащие индивидуальное УФ-поглощающее соединение, объединяют и упаривают в вакууме с добавлением н-бутанола при температуре ~37°С до минимального объёма водного раствора, к которому добавляют избыток ацетона. Выпавший белый осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают в вакууме. Получают индивидуальные соединения III и IV в виде белых порошков. Выход III — 18 мг (37%). Т. пл.>270°С. ВЭЖХ: Rt = 22,3 (система 1), УФ- спектр: (во-да+СИ3СООИ, pH=6,0), lmax=280,0 нм., Е1%1см=27,7. Масс-спектр, ESI MS: вычислено для C80H97BCIN11O27 м.в. 1689.6337, найдено m/z 1690,6367 [M+H]+1.
Выход IV — 17 мг (35%). Т. пл.>2700С. ВЭЖХ: Rt =22,7 (система 1). УФ- спектр: (во-да+СИ3СООИ, pH=6,0): lmax= 280,0 нм; E1%1cm=27,7. Масс-спектр (ESI MS): вычислено для C8oH97BClNllO27, м.в. 1689.63, найдено m/z 1690,63 [M+H]+1.
Карбоксамиды ванкомицина с 4-аминоме-тилфенилборной кислотой (V) и с 3-аминометил-фенилборной кислотой (VI)
Производные ванкомицина с 4-аминоме-тилфенилборной кислотой (V) или с 3-амино-метилфенилбороновой кислотой (VI) получают аналогично соответствующим производным эремомицина IIIa или IVa, исходя из гидрохлорида ванкомицина (45 мг, 0,03 ммоль) и соответствующих гидрохлоридов пинаколиновых эфиров 4- или 3-замещённых аминометилфе-нилборных кислот (60 мг, 0,22 ммоль). Получают индивидуальные соединения Va и VIa в виде белых порошков. Выход Va — 43 мг. ВЭЖХ: Rt =27,75 (система 1). Выход VIa — 43 мг. ВЭЖХ: Rt =27,77 (система 1). Отщепление пинаколи-новой защиты от полученных производных проводят нагреванием их в водном растворе при 37 С в течение 24 ч. Полученные растворы упаривают в вакууме при 37°С с добавлением н-бутанола до небольших объёмов водных растворов, из которых осаждением ацетоном получают белые порошки карбоксамидов ванкомицина с 4-аминометилфенилборной кислотой (V) (37 мг) или с 3-аминометилфе-нилборной кислотой (VI) (38 мг). Дальнейшую очистку этих производных проводят на колонке с силанизированным силикагелем, уравновешенным водой, элюируя водой. Полученные фракции, содержащие индивидуальное УФ-по-глощающее соединение, объединяют и упаривают в вакууме при 37°С с добавлением н-бута-нола до небольшого объёма водного раствора. Осаждением ацетоном с последующим фильтрованием полученного осадка получают индивидуальное соединение V или VI в виде белого порошка. Выход V — 15.мг, (32 %), ВЭЖХ: Rt = 23,6 (система 1). Масс-спектр, ESI MS: вычислено для C73H83BCl2N10O25, м.в. 1580.5001, найдено m/z 1581,5035 [M+H] + 1. Выход VI — 18 мг (38%). ВЭЖХ: Rt = 23,7 (система 1). Масс-спектр, ESI MS: вычислено для C73H83BCl2N10O25, м.в. 1580.5001, найдено m/z 1581,5125 [M+H]+1.
Определение антибактериальной активности
Определение антибактериальной активности изучаемых производных ванкомицина и эремомицина (III—VI) проводилась с использованием микрометода определения минималь-
Синтез производных эремомицина и ванкомицина, содержащих замещённые фенилборные кислоты (Ш—У!).
А. Гидролиз в системе: 0,25 н уксусная кислота: 50% метанол при хроматографии на колонке с силанизированным силикагелем. Б. Гидролиз в воде при 37°С 24 часа.
ной подавляющей концентрации (МПК) методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон с использованием 96-луночных стерильныгх планшетов [16—18]. Метод разведения основан на использовании двойных последовательных разведений исследуемого вещества от максимальной концентрации к минимальной. При этом исследуемое вещество в различныгх концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон). Оценку роста культур проводят визуально, сравнивая рост микроорганизмов в присутствии изучаемых тест-соединений с
ростом культуры без них. Первую наименьшую концентрацию исследуемого вещества (из серии последовательный: разведений), при которой визуально не определяется бактериальный рост, принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК, мкг/мл).
Результаты и обсуждение
В настоящей работе представлен синтез и изучение новых конъюгатов эремомицина и ван-комицина с бор-содержащими соединениями. Реакцию амидирования антибиотиков I или II проводили по методу, разработанному для получения карбоксамидов гликопептидов данного класса [19]. Метод хорошо зарекомендовал себя для получения карбоксамидов гликопептидных антибиотиков. В реакции конденсации использовались реагенты с защищённой борной кислотой — пинаколиновые эфиры 4- и 3-аминоме-тилфенилборной кислоты. Взаимодействием этих реагентов с эремомицином (I) или ванкоми-цином (II) в присутствии конденсирующего реагента РуВОР при рН ~8.5 в диметилсульфоксиде при комнатной температуре получены соответствующие карбоксамиды эремомицина с пинако-линовым эфиром 4- и 3-аминометилфенилбор-ной кислоты (Шя) и (IVa) и карбоксамиды ванкомицина с пинаколиновым эфиром 4- и 3-аминометилфенилборной кислоты (Va) и (^а) (рисунок). Реакция протекает с образованием одного основного целевого продукта.
В процессе очистки (от минорных примесей) полученных производных эремомицина Ша и ГУа на колонке с силанизированном силикаге-лем во время элюции системой 0,25 н уксусная кислота — 50% метанол (1:1) происходит количественное отщепление защитной пинаколино-вой группировки с образованием соответствующих карбоксамидов эремомицина с 4- (III) и с 3-аминометилфенилборной кислотой (IV). Гидролиз пинаколиновых эфиров ванкомицина Уа и У!а в воде при 37°С в течение 24 часов также приводит к свободным карбоксамидам эремомицина и ванкомицина с 4- и с 3-аминометил-фенилбороновой кислотой (V) и (VI) соответственно (рисунок).
Новые производные гликопептидов III—VI получены с удовлетворительным выходом 32—38 %. в результате двух стадий синтеза и очистки на колонке на силанизированном силикагелем. Строение полученных соединений вытекает из пути синтеза и подтверждается совокупностью физико-химических и спектральных характеристик.
Изучение антибактериальной активности (таблица) показало, что производные эремомицина и ванкомицина, содержащие остаток 4-заме-щённой фенилборной кислоты III и V соответственно обладают высокой антибактериальной активностью, сравнимой с антибактериальной активностью эремомицина (I)(MnK). Это выражается не только в отношении чувствительных к гликопептидам штаммов S.epidermidis 533, S.haemolyticus 602 и E.faecalis 559, Enterococcus fae-cium 568, но и в отношении стафилококков с пониженной чувствительностью (S.aureus 3797 и S.aureus 3798) (GISA). Производные эремомицина и ванкомицина, содержащие остаток 3-замещён-ной фенилборной кислоты IV и VI, соответственно, по антибактериальной активности (МПК) приближаются к ванкомицину (II). В отношении штаммов резистентных энтерококков E.faecium 569 и E.faecalis 560 (GRE) новые производные не активны так же, как и исходные антибиотики.
Заключение
Амидированием концевой карбоксильной группы антибиотиков эремомицина (I) и ванко-мицина (II) пинаколиновыми эфирами 4- или 3-аминометилфенилборными кислотами в присутствии конденсирующего реагента PyBOP с последующим удалением пинаколиновой защиты в мягких условиях гидролиза, получены новые борол-содержащие карбоксамиды этих антибиотиков (III—VI) с удовлетворительными выходами. Установлено, что активность 4-замещённых производных борол-содержащих антибиотиков эремомицина и ванкомицина практически равна активности исходных антибиотиков, но выше активности соответствующих 3-замещённых производных борол-содержащих производных в от-
Определение МПК (мкг/мл) производных гликопептидов (III—VI) в сравнении с эремомицином (I) и ванко-мицином (II) в отношении Гр+ микроорганизмов
Бактериальные штаммы МПК, мкг/мл
ванкомицин эремомицин III IV V VI
Staphylococcus epidermidis 533 1,0 0,13 0,13 2,0 0,25 2,0
S.haemoliticus 602 0,5 0,13 0,13 1,0 0,25 2,0
S.aureus 3797 4,0 8,0 0,5 4,0 1,0 8,0
S.aureus 3798 4,0 8,0 2,0 8,0 4,0 16,0
Enterococcus faecalis 559 1,0 0,13 0,25 2,0 0,5 2,0
E.faecium 568 2,0 0,13 0,25 4,0 0, 5 2,0
E.faecium 569 >64,0 >64,0 32,0 >64,0 >64,0 >64,0
E.faecalis 560 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0 >64,0
ношении большинства изученных штаммов грамположительных бактерий.
Благодарности.
Авторы выражают благодарность сотруднику Института ФГБНУ «НИИНА» Н. М. Малютиной
за проведение метода ВЭЖХ анализа образцов. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ КИАС № 13-03-00643 А (2013-2015 гг).
ЛИТЕРАТУРА
1. Berdy J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading. Antibiotics 2012; 65: 385—395.
2. Faier R.J., Tor Y. Antibiotics and bacterial resistance in the 21st century. Perspectives in Medicinal Chemistry. 2014; 6: 25—64.
3. Ashford P.A., Bew S.P. Recent advances in the synthesis of new gly-copeptide antibiotics. Chem Soc Rev 2012; 41: 957—978.
4. Hattangady D.S., Singh A.K., Muthaiyan A. et al. Genomic, transcriptom-ic and metabolomic studies of two well-characterized, laboratory-derived vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains derived from the same parent strain. Antibiotics 2015; 4: 76—112.
5. Олсуфьева E.H., Преображенская M.H. Изучение связи структура-активность в ряду полусинтетических антибиотиков группы полициклических гликопептидов. Биоорг хим 2006; 32: 4: 1—21. / Olsufeva E.N., Preobrazhenskaja M.N. Izuchenie svjazi struktura-aktivnost' v rjadu polusinteticheskih antibiotikov gruppy policiklicheskih glikopeptidov. Bioorg him 2006; 32: 4: 1—21. [in Russian]
6. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N.Patents on glycopeptides of the vancomycin family and their derivatives as antimicrobials: January 1999 — June 2003. Ex Opin Ther Pat 2004; 14: 2: 1—33.
7. Butler M.S., Blaskovich M.A., Cooper M.A. Antibiotics in the clinical pipeline in 2013. Antibiotics 2013; 66: 571—591.
8. Van Bambeke F. Glycopeptides and glycodepsipeptides in clinical development: a comparative review of their antibacterial spectrum, pharmacokinetics and clinical efficacy. Curr Opin Invest Drugs 2006; 7: 8: 740—749.
9. Тевяшова A.H., Олсуфьева E.H., Преображенская M.H. Создание антибиотиков двойного действия как путь поиска новых перспективных лекарственных препаратов. Успехи химии 2015; 84: 1: 61—97. / Tevjashova A.N., Olsufeva E.N., Preobrazhenskaja M.N. Sozdanie antibiotikov dvojnogo dejstvija kak put' poiska novyh perspektivnyh lekarstvennyh preparatov. Uspehi himii 2015; 84: 1: 61—97. [in Russian]
10. Liu C.T., Tomsho J.W., Benkovic S. /.The unique chemistry of benzox-aboroles: current and emerging applications in biotechnology and therapeutic treatments. Bioorgan Med Chem. 2014; 22: 4462—4473.
11. Adams /., Kauffman M. Development of the Proteasome Inhibitor Velcade (Bortezomib). Cancer Invest 2004; 22: 2: 304—311.
12. Putty S, Rai A., /amindar D. et al. Characterization of d-boroAla as a novel broad-spectrum antibacterial agent targeting d-Ala-d-Ala ligase. Chem Biol Drug Design 2011; 78: 5: 11: 757—763.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Олсуфьева E.H. — главный научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
Бычкова E.H. — научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
Королев A. М. — главный научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
13. Printsevskaya S.S., Reznikova M.I., Korolev A.M. et al. Synthesis and study of antibacterial activities of antibacterial glycopeptide antibiotics conjugated with benzoxaboroles. Future Med Chem 2013; 5: 6: 641—652.
14. Tevyashova A.N., Printsevskaya S.S., Olsufyeva E.N. et al. The use of ben-zoxaboroles for constructing of dual-acting antibiotics on the basis of gly-copeptides and amphotericin B. Abstr. 14 International Conference on the Chemistry of Antibiotics and other Bioactive Compounds, ICCA-2015, 2015; October 13- 16: Galveston: Texas: USA: P 20.
15. Lapa G.B., Korolev A.M., Luzikov Y.N. et al. Two approaches to the use of bezo[c][1,2]oxaboroles as active fragments for synthetic transformation of clarithromycin. Abstr. XV Inernational Conference «Heterocycles in Bioorganic Chemistry» Riga. Latvia. 2013; May 27— 30: PO 135: 192.
16. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04). Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 04.03.2004 г. / Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam (Metodicheskie ukazanija MUK 4.2.1890-04). Utverzhdeny i vvedeny v dejstvie Glavnym gosudarstven-nym sanitarnym vrachom Rossijskoj Federacii G.G.Onishhenko 04.03.2004 g. [in Russian]
17. Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств / часть первая. Издание ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России, 2012. / Rukovodstvom po provedeni-ju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv / chast' pervaja. Izdanie FGBU «NCJeSMP» Minzdravsocrazvitija Rossii, 2012. [in Russian]
18. Рекомендациями Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов США (NCCLS), [NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA 2000]. / Rekomendacijami Nacional'nogo Komiteta Klinicheskih Laboratornyh Standartov SShA
19. Printsevskaya S.S., Pavlov A.Y., Olsufyeva E.N. et al. Synthesis and mode of action of hydrophobic derivatives of glycopeptide antibiotic eremomycin and des-(N-methyl-D-leucyl) eremomycin against gly-copeptide-sensitive and — resiatant bacteria. J Med Chem 2002; 45: 1340—1345.
Мирчинк Е. П. — ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новый антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва Исакова Е. Б. — научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
