CC BY
11Сведения об авторе:
Пономарев Алексей Петрович, доктор биол. наук, профессор кафедры биологии и экологии ФГБОУ ВПО «Владимирский государственный университет имени А. Г и Н. Г Столетовых»; д. 87, ул. Горького, г. Владимир, Россия, 600 000; тел.: +7 (910) 779-17-09; e-mail: [email protected]
Author affiliation:
Ponomarev Alexey Petrovich, D. Sc. in Biology, Professor, Senior Researcher of the Department of Biology and Ecology of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Vladimir State University named after A. G. and N. G. Stoletovs»; house 87, Gorky str., Vladimir city, Vladimir region, Russia, 600000; phone: +7 (910) 779-17-09; e-mail: [email protected]
DOI: 10.25690/VETPAT.2020.72.2.001 УДК: 619:619.98:578.56
Нефедьева М. В., Титов И. А., Малоголовкин А. С.
ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ С ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНА A238L
Ключевые слова: африканская чума свиней, иммуномодулирующие белки, ген A238L, клонирование, плазмидный вектор, зеленый флуоресцентный белок (EGFP), рекомбинантный вирус, культура клеток COS-1, гомологичная рекомбинация, количественная ПЦР в режиме реального времени.
Резюме: Африканская чума свиней (АЧС) - смертельная опасная вирусная болезнь свиней и кабанов, которая приводит к значительным экономическим потерям. Несмотря на прогресс в изучении иммунопатологии при АЧС, на сегодняшний день создание универсальной эффективной и безопасной вакцины против вируса АЧС не увенчалось успехом. Это связано со сложной структурой вируса, высокой вариабельностью генома и наличием большого количества им-муномодулирующих белков. Как и в случае с другими крупными ДНК-вирусами, геном вируса АЧС кодирует несколько белков, которые способствуют уклонению вируса от иммунного ответа хозяина. Одним из них является мощный иммуносупрессор белок 5EL (ген A238L) - IkB гомолог и ингибитор кальций нейрин фосфатазы, вызывающий запрограммированную гибель клетки. Целью исследования явилось получение рекомбинантного вируса АЧС с делецией гена A238L методом гомологичной рекомбинации и изучение его репродукции in vitro. В результате из штамма вируса АЧС «Волгоград/14с» в перевиваемой культуре клеток COS-1 получен рекомбинантный вирус АЧС Волгоград/14с AA238L. Согласно результатам наших исследований, удаление гена A238L из вирулентного штамма Волгоград/14с не привело к изменению культу-ральных свойств рекомбинантного вируса Волгоград/14с AA238L в перевиваемой культуре клеток COS-1. Репродукция рекомбинантного штамма Волгоград/14с AA238L в первичной культуре клеток макрофагов свиней и культуре клеток COS-1 составляет 4,0-5,0 lg ГАЕ 50/см3. Различий в ЦПД и динамике репродукции исходного и рекомбинантного штаммов не отмечено. Показано, что репортерная флюоресценция гена EGFP наблюдается при разной множественности заражения (0,1 и 1), что свидетельствует об эффективной репликации вируса.
Введение
В настоящее время, одной из наиболее актуальных проблем развития свиноводческой отрасли является неблагополучная ситуация по африканской чуме свиней (АЧС). Вирус африканской чумы свиней представляет собой крупный цитоплазматический ДНК-вирус семейства Asfarviridae, который вызывает острую геморрагическую лихорадку у домашних свиней и диких кабанов (Sus scrofa scrofa), но не вызывает явной инфекции у естественных хозяев - бородавочников (Phacochoerus aethiopicus), кустарниковых свиней (Potamochoerus spp.) и клещей видов Ornithodoros moubata и Ornithodoros erraticus [1].
Вирус АЧС циркулирует в популяциях свиней на африканском континенте в течение многих десятилетий [2]. В 60-х и 70-х годах прошлого века данное заболевание также затронуло домашних свиней в европейских странах, таких как Испания, Португалия, Италия и Франция [3]. В Российской Федерации АЧС регистрируется с 2007 года [4-6]. В 2014 году вспышки были зарегистрированы в некоторых частях Европейского Союза, включая Польшу, Литву, Латвию и Эстонию. В каждой из этих стран также были выявлены случаи заражения диких кабанов [7]. В популяции диких кабанов было зафиксировано распространение болезни на большие расстояния в регионы далекие от первичных вспышек болезни. В Европе в 2017-2018 годах случаи заболевания диких кабанов и вспышки заболевания среди домашних свиней отмечены в Бельгии, Болгарии, Чешской Республике (район Злин), Венгрии, Молдове и Румынии [8]. В августе 2018 года сообщили о первой вспышке АЧС в Азии в городе Шэньяне, расположенном на северо-востоке Китая [9]. С тех пор АЧС была зарегистрирована во многих провинциях и продолжает распространяться по всему Китаю [9, 10]. Болезнь также распространилась на соседние страны, в частности, в 2019 году зарегистрированы первые случаи АЧС во Вьетнаме, Монголии, Камбодже и Гонконге [11-14].
АЧС продолжает свое распространение на новые территории, в связи, с чем ее изучение сохраняет свою актуальность. Вирус АЧС, выделенный в РФ, относится ко II генотипу и 8 сероиммунотипу. По данным Россельхознадзора, начиная с 2007 года и по настоящее время, на территории РФ было зарегистрировано 1393 вспышки АЧС, 834 из которых в популяции домаш-
них свиней, и уничтожено порядка более миллиона животных [15].
АЧС является одной из наиболее значимых болезней свиней, поскольку возникновение новых очагов инфекции приводит к вынужденному уничтожению поголовья свиней. На данный момент не существует эффективных вакцин и противовирусных препаратов для профилактики и лечения данного заболевания. Это связано, прежде всего, с особенностями жизненного цикла вируса и его взаимодействием с иммунной системой хозяина.
В зависимости от штамма вируса, способа заражения и иммунологического статуса животного инфицирование может привести к спектру клинических проявлений, наблюдаемых в сверхострой форме со 100 % летальностью, острой, подострой и хронической формах заболевания [16].
Для вируса АЧС характерно высокое генетическое и антигенное разнообразие и наличие генов, связанных с вирулентностью, уклонением от иммунного ответа и модуляцией клеточного процесса [17-20]. До настоящего времени в мире было идентифицировано двадцать четыре генотипа на основе секвенирования гена, кодирующего капсид вируса (р72, B646L) и 8 серо-иммунотипов на основе реакции задержки гемадсорбции и иммунопробе [21-23]. Вирус преимущественно поражает клетки мононуклеарной фагоцитарной системы (моноциты и макрофаги) и размножается в цитоплазме [20, 24].
Многие крупные ДНК-вирусы кодируют белки, которые помогают вирусу уклониться от иммунного ответа хозяина [25,
26]. К основным белкам вируса АЧС, участвующим в иммунном уклонении, относятся, например, 5HL (ген A179L), 4СЬ (ген A224L), С-типа лектиноподобный белок (ген EP153R), CD2v (ген EP402R), кШ (ген 1329Ц), (ген DP71L) [17,
27]. В данную группу также попадает 5EL (ген А238L), который ингибирует активацию фактора транскрипции №"-кВ и активность кальций/кальмодулин-зависи-мой фосфатазы кальцинейрина (СаЫ) [2831]. Таким образом, вирус АЧС может ин-гибировать активацию транскрипции генов, участвующих в запуске воспалительных процессов в организме при инфицировании макрофагов. Кроме того, 5EL является иммуномодулирующим белком вируса АЧС, который помимо №"-кВ также ин-гибирует активацию путей ядерного фактора активированных Т-клеток (№АТ), которые отвечают за регуляцию синтеза
провоспалительных цитокинов [32]. Было показано, что 5EL ингибирует экспрессию TNF-a посредством транскрипционных ко-активаторов - CREB-связывающего белка (CBP) и p300, а экспрессия 5EL ингибирует транскрипцию гена COX-2 и продукцию простагландинов, что может уменьшить воспалительный процесс в ответ на инфекцию [1, 33-35].
Белковый комплекс NF-kB функционирует как плейотропный фактор транскрипции, который модулирует множество генов в клетках иммунной системы (Т-клетки, В-клетки и моноциты/макрофаги), включая кодирующие иммунорецеп-торы, молекулы клеточной адгезии, белки острой фазы, провоспалительные цитоки-ны, гематопоэтические факторы роста и синтазу оксида азота. В связи с этим, IkB-белок, по-видимому, может играть важную роль в противовирусном ответе у свиней, инфицированных вирусом АЧС [28].
Для получения необходимых знаний о биологии, репродукции и иммунном ответе при АЧС необходимо создание различных модельных объектов и инструментов для их изучения. Создание рекомби-нантных вирусов, полученных путем замены или удаления различных генов, способствует лучшему пониманию многих аспектов цикла репродукции вируса и механизмов функций белков вируса АЧС in vitro.
Целью работы являлось получение рекомбинантного вируса АЧС с делецией гена A238L методом гомологичной рекомбинации и изучение его репродукции in vitro.
Материалы и методы исследований
В работе использовали вирулентный штамм Волгоград/14с (II генотип, 8 серо-иммунотип) вируса АЧС, полученный из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ. Расчет прайме-ров для амплификации плечей рекомбинации и гена EGFP проводился с учетом наличия сайтов рестрикции эндонуклеаз в составе вектора pGEM-T Easy и соответствующей открытой рамки считывания (ОРФ) с помощью программы Oligo 6.0. и вебсервера IDT DNA (https://eu.idtdna.com/ site). ДНК выделяли из вируссодержащей культуральной жидкости с использованием набора «ДНК-сорб-B» («Амплисенс», Россия). Оптимизация температурных режимов ПЦР проводилась на термоцикле-ре T100 («Bio-Rad Laboratories», США). Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле с последующим учетом
на ChemiDoc MP («Bio-Rad Laboratories», США).
Для дальнейшего клонирования ПЦР продукты были получены с использованием набора Phusion® High-Fidelity PCR Kit («New England Biolabs», США). Рестрикцию проводили набором FastDigest Value Pack («Thermo Fisher Scientific», Германия). Для лигирования ПЦР-продуктов с вектором pGEM®-T Easy («Promega», США) использовали T4 DNA Ligase («New England Biolabs», США) с последующей трансформацией бактериальной культуры E. co-li XL1-Blue (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК проводили при помощи набора ISOLATE II Plasmid Mini Kit («Bioline», США). Для подтверждения наличия вставок и их ориентации в плазмидах использовали ПЦР со специфическими прай-мерами и рестрикцию с применением эн-донуклеаз рестрикции (BamHI, Sall и PstI). Отсутствие нуклеотидных замен в реком-бинантных плазмидах подтверждали ну-клеотидным секвенированием.
Для получения рекомбинантных клонов вируса АЧС проведено одновременное инфицирование клеток культуры СOS-1 вирусом АЧС штамм Волгоград/14с и ее трансфецирование рекомбинацион-ной кассетой с делецией гена A238L. Для определения множественности заражения (MOI) проводили подсчет количества клеток культуры при помощи автоматического счетчика LUNA-FL™ («Logos Biosystems, Inc»). Оптимальная концентрация клеток культуры СOS-1 составила 1,8-2,1*105 клеток в 1 мл. Для дальнейшего скрининга клонов использовали метод предельных разведений (6 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1). Для постановки реакции бляш-кообразования, последующего накопления рекомбинантного вируса АЧС и определения ростовых характеристик была также применена перевиваемая культура клеток COS-1. Для поддержания роста и пролиферации клеток, зараженных вирусом, применена среда DMEM/F-12 («Thermo Fisher Scientific», Германия) с 5,0 % эмбриональной фетальной сывороткой (FBS) («Thermo Fisher Scientific», Германия). Отбор рекомбинантных клонов был произведен по репортерной флюоресценции гена EGFP под микроскопом ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Инфекционная активность рекомбинантного вируса оценена в перевиваемой культуре клеток COS-1 и первичной культуре клеток макрофагов свиней.
Ростовые характеристики рекомби-нантного и исходного вируса определялись при множественности заражения 0,1 и 1 MOI. Клетки ежедневно проверяли на развитие цитопатического эффекта (ЦПЭ) по сравнению с незараженной культурой клеток. Аликвоты отбирали из супернатан-та каждой лунки сразу после заражения (1 hpi), а затем каждые 24 часа после заражения в течение 5-ти суток (1-5 dpi). Сравнительная оценка показателей роста реком-бинантного и исходного вируса произведена методом количественной ПЦР в режиме реального времени («Real-time CFX96 Touch», Bio-Rad Laboratories, Inc.). Концентрацию ДНК для контрольной плазми-ды р30_pGEM-T Easy определяли с помощью NanoDrop («Thermo Fisher Scientific Inc»), а количество геномных эквивалентов (GE) рассчитывали и использовали для стандартной кривой (10-106 GE). Определение наличия исходного родительского типа в рекомбинантном вирусе подтверждалось ПЦР со специфическими праймера-ми, фланкирующими фрагмент гена A238L штамма Волгоград/14с вируса АЧС.
Результаты и обсуждение
Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов MGF360-15R, A859L, и межгенных регионов между данными участками штамма Волгоград/14с вируса АЧС. На следующем этапе были подобраны олигонуклеотидные праймеры со специфическими гексамерными последовательностями сайтов рестрикции эндону-клеаз SphI, Spei, XhoI и Sali для амплификации плечей рекомбинации и гена EGFP с целью дальнейшего их клонирования в плазмидный вектор.
Плечи рекомбинации представляли собой фрагменты генома вируса АЧС, расположенные слева и справа от гена A238L, и имели длину 972 п.о. и 966 п.о. соответственно. Для дальнейшего скрининга ре-комбинантных клонов в качестве репор-терного гена в конструкции был использован ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок EGFP, под контролем про-мотера гена B646L вируса АЧС. Для амплификации выбранных продуктов были оптимизированы условия проведения ПЦР.
Способы создания делеций генов в геноме вируса АЧС методом гомологичной рекомбинации для замены специфического гена репортерным геном впервые были установлены Rodriguez et al., 1992 [36]. Впоследствии ген b-глюкуронидазы (GUS) использовали в качестве репортера
для отбора рекомбинантных полевых изо-лятов, выращенных в первичных макрофагах свиней или клетках COS-1 [37]. Данные методы были успешно использованы для создания делеций отдельных генов, включая DP71L, DP96R, CD2v, A238L из вирулентных штаммов Malawi LiL20/1, E70 и Pr4 [38-41].
В ходе выполнения работ нами сконструирована рекомбинантная плазмида для делеции гена A238L на основе вектора pGEM®-T Easy vector. Данная плазмида содержала в себе фрагмент нуклеотид-ной последовательности гена MGF360-15R, A859L с участками межгенных регионов штамма Волгоград/14с вируса АЧС и ген EGFP (рис. 1). Отсутствие нуклео-тидных замен в рекомбинантной плазми-де подтверждали нуклеотидным секвени-рованием.
Для гомологичной рекомбинации проведено инфицирование клеток культуры COS-1 культуральным вирусом АЧС штаммом «Волгоград/14с» и одновременное трансфецирование рекомбинацион-ной кассетой с делецией гена A238L с множественностью заражения (MOI) 1. Для контроля трансфекции выбрана рекомби-нантная плазмида pCMV-GFP. В результате инфекции/трансфекции при первичном скрининге обнаружены зеленые флуоресцентные (инфицированные) клетки. Далее проведена серия из 6-ти пассажей методом предельных разведений рекомбинантного вируса с делецией гена A238L на клетках культуры COS-1. Флуоресцентные клетки были обнаружены в разведениях от 10-1 до 10-4 (рис. 2).
После постановки реакции бляш-кообразования и последующего накопления рекомбинантного вируса АЧС Волгоград/14с AA238L была определена его инфекционная активность. По результатам флюоресцентой микроскопии отмечено образование небольших скоплений инфицированных клеток, число которых возрастало по мере культивирования вируса. Титр рекомбинантного вируса в перевиваемой культуре клеток COS-1 составляет 4,0-5,0 lg ТЦД 50/см3. Накопление вируса Волгоград/14с AA238L в первичной культуре клеток макрофагов свиней также находится в интервале 4,0-5,0 lg ГАЕ 50/см3 и сопровождается гемадсорбцией и последующим лизисом клеток.
Таким образом, титры накопления ре-комбинантного вируса в данных культурах клеток подобны титрам исходного штамма Волгоград/14с.
эпизоотология
27...9М A231L left
HD№7...1gl5 p72 prpiiiDtE-rl
DElta_A23SL_Vblfi4rad-14c.xdna - 5B29 nt +
\
1214...1S3D EGFP
Рис. 1. Рекомбинантная плазмида для делеции гена A238L на основе вектора pGEM®-T Easy vector
Рис. 2. Клетки культуры С08-1, инфицированные вирусом АЧС Волгоград/14с АЛ238Ь, спустя 72 часа после заражения (увеличение микроскопа х 20)
Для определения ростовых характеристик образцы рекомбинантного вируса АЧС Волгоград/14с AA238L и исходного вируса Волгоград/14с собрали после 1 часа контакта (1 hpi) и через каждые 24 часа после инокуляции вируса в течение 5-ти дней (1-5 dpi) при множественности заражения 0,1 и 1. Продукцию вируса измеря-
ли с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. Согласно полученным результатам, при множественности заражения 0,1 наблюдается экспоненциальная кривая роста рекомбинантного и исходного вирусов, которые одинаково достигают пика количества копий на 4-й день после заражения (4 dpi) на культуре
клеток COS-1 (рис. 3). По мере репродукции вируса Волгоград/14с ДA238L отмечено увеличение инфицированных флуоресцирующих клеток, формирующих фокусы по 5-10 клеток. На 5-й день после заражения репортерная флюоресценция ге-
I
s
Ранее проведенные исследования по изучению функций гена A238L показали, что характеристики роста рекомбинант-ного вируса с делецией 5EL в геноме вирулентного Malawi Lil-20/1 были неотличимы от роста родительского вируса в культуре клеток макрофагов свиней. Таким образом, несмотря на высокую консервативность среди изолятов вируса АЧС, 5EL несущественен для роста в свиных макрофагах in vitro и не влияет на вирулентность у домашних свиней. Однако 5EL может иметь значение, когда вирус и хозяин более адаптированы друг к другу, как это происходит в естественном жизненном цикле вируса. Обсуждается возможная роль этого гена в передаче вируса АЧС в природе между клещами вида Ornithodoros и бородавочниками или кустарниковыми свиньями, обитающими в Африке к югу от Сахары [28].
Проведенные нами два независимых эксперимента показали, что кинетика роста вируса Волгоград/14с AA238L была неотличима от исходного Волгоград/14с, доказывая, что делеция A238L не оказывает влияния на репликацию вируса. Высокое количество копий рекомбинантного вируса свидетельствует об эффективности
на EGFP также наблюдается на всей части клеточного монослоя. При множественности заражения 1 в инфицированных клетках прослеживается логистическая кривая роста и отмечено образование флуоресцентных локусов.
его накопления на перевиваемой культуре клеток COS-1. Различий в ЦПЭ при репродукции исходного и рекомбинантного вирусов не наблюдалось.
В результате проведенной ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена A238L штамма Волгоград/14с вируса АЧС, наличие исходного родительского типа в рекомбинант-ном вирусе Волгоград/14с AA238L не выявлено, что свидетельствует о чистоте вирусного материала.
Поскольку иммуномодулирующие белки могут мешать иммунному ответу хозяина, делеция таких генов как из аттенуиро-ванных, так и из вирулентных штаммов вируса АЧС может усиливать иммунный ответ. Различные исследования показали, что свиньи, иммунизированные живыми атте-нуированными вирусами АЧС, содержащими делеции генов, связанных с вирулентностью вируса, были защищены при заражении гомологичным родительским вирусом. В частности, делеция отдельных генов DP69R (UK), DP71L (23-NL), A240L (TK) и B119L (9GL) или делеция нескольких генов из MGF360 и -505 (MGF360/505) в геномах патогенных вирусов АЧС (Malawi Lil-20/1, Pretoriuskop/96/4, E70 и Georgia 2007)
Рис. 3. Количественная оценка (GE/ml) ростовых характеристик вируса АЧС Волгоград/14с AA238L и Волгоград/14с в перевиваемой культуре клеток COS-1 при множественности заражения (MOI) 0,1 и 1
привела к снижению вирулентности вируса у свиней. Животные, иммунизированные этими ослабленными вирусами, были защищены от заражения гомологичным вирусом [37, 42-45]. Напротив, удаление двух генов DP71L и DP96R из аттенуи-рованного штамма OUR T88/3 снизило его способность защищать свиней от заражения вирулентным вирусом OUR T88/1 [46]. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить наиболее подходящие гены для таргетной делеции.
В связи с тем, что NF-kB и кальциней-рин являются важными мишенями для им-муномодулирующих препаратов, существует значительный интерес к определению того, как один белок может опосредовать ингибирование обоих этих путей. Понимание того, как регулируются две функции гена A238L, важно для оценки его роли во время инфицирования вирусом АЧС [1].
Белок 5EL является высококонсервативным среди различных африканских и европейских патогенных полевых изоля-тов вируса АЧС и во всех случаях его сходство с генами IkB ограничивается наличием четырех повторов анкиринов [28]. Это наблюдение предполагает, что ген A238L может иметь значение для аспектов патогенеза и вирулентности вируса АЧС у домашних свиней, мешая нормальному противовирусному ответу хозяина. Согласно мнению Abrams et al., 2012 для понимания важности роли определенных путей при взаимодействии вируса с его хозяевами, было бы полезно последовательно удалять различные гены из генома вируса [41]. В результате наблюдений Salguero et al., 2008 инфицирование свиней мутантны-ми вирусами с делецией A238L продемонстрировало увеличение мощного провос-палительного цитокина TNFa [32].
Требуется гораздо больше исследований для определения возможности использования иммунизации вирусами с измененными иммуномодулирующими белками для оказания помощи иммунному ответу хозяина при заражении.
Выводы и заключение
В настоящее время не прекращаются
исследования, связанные с изучением роли отдельных белков вируса АЧС. Приблизительно от половины до двух третей из 150 генов, кодируемых вирусом АЧС, не являются необходимыми для репликации в клетках, но играют важную роль в выживании и распространении вируса в организме хозяина. Эти гены предоставляют неиспользуемый репозиторий и будут ценными инструментами для расшифровки не только того, как АЧС манипулирует иммунной системой хозяина в ответ на инфекцию, чтобы избежать элиминации, но также полезны для понимания важных антивирусных механизмов хозяина.
В результате работы нами создана ре-комбинационная кассета для получения рекомбинантного вируса с делецией гена-мишени A238L. В результате гомологичной рекомбинации данной плазми-ды и культурального вируса АЧС штамма «Волгоград/14с» в перевиваемой культуре клеток COS-1 получен рекомбинант-ный вирус АЧС Волгоград/14с ДA238L и определены его ростовые характеристики. Удаление гена A238L из вирулентного штамма Волгоград/14с не изменяло характеристик роста рекомбинантного вируса Волгоград/14с ДA238L в перевиваемой культуре клеток COS-1. Репортерная флюоресценция от EGFP наблюдаемая при использовании различных доз заражения, свидетельствует об эффективной репликации вируса в данной культуре.
Рекомбинантный штамм Волгоград/14с ДA238L вируса АЧС депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ под инвентарным номером 3181.
Требуется дальнейшее изучение роли делеции гена A238L вируса АЧС во взаимодействии с иммунной системой хозяина и влиянии на регуляцию апоптотиче-ских механизмов в инфицированных клетках. Таким образом, дальнейшая характеристика цикла репликации рекомбинант-ного вируса Волгоград/14с ДA238L и процессов, вовлеченных в молекулярный патогенез при АЧС, может предоставить новые возможности для разработки эффективных вакцин.
Библиографический список:
1. Silk R. N. African swine fever virus A238L inhibitor of NF-kB and of calcineurin phosphatase is imported actively into the nucleus and exported by a CRMl-mediated pathway / R. N. Silk, G. C. Bowick, C. C. Abrams, L. K. Dixon // J. Gen. Virol. -2007. - Vol. 88. - № 2.- P 411-419.
2. Penrith M. L. African swine fever virus eradication in Africa / M. L. Penrith, W Vosloo, F Jori, A. D. Bastos // Virus Res. - 2013. - Vol.173. - № 1. - P. 228-246.
3. Sánchez-Vizcaíno J. M. African swine fever (ASF): five years around Europe / J. M. Sánchez-Vizcaíno, L. Mur,
B. Martinez-Lopez // Vet. Microbiol. - 2013. - Vol. 165. - № 1-2. - Р. 45-50.
4. Балышев В. М. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В. М. Балышев, В. В. Ку-риннов, С. Ж. Цыбанов, Ю. Ф. Калантаенко, Д.
B. Колбасов, В. В. Пронин, и др. // Ветеринария.
- 2010. - № 7. - С. 25-27.
5. Kurinnov V V Diagnostic and monitoring investigations of African swine fever outbreaks in Nothern Caucasus republics in 2007-2008 / V V Kurinnov // Infectious Animal Pathology. - 2009. -P. 63-70.
6. Gulenkin V M. Cartographical analysis of African swine fever outbreaks in the territory of the Russian Federation and computer modeling of the basic reproduction ratio / V M. Gulenkin, IF I. Korennoy, A. K. Karaulov, S. A. Dudnikov // Prev. Vet. Med. -2011. - Vol. 102. - № 3. - P. 167-174.
7. Gavier-Widen D. African swine fever in wild boar in Europe: a notable challenge / D. Gavier-Widen,
C. Gortazar, K. Stahl, A. S. Neimanis, S. Rossi, C. Hard av Segerstad [et al.] // Vet. Rec. - 2015. - Vol. 176. - № 8. - Р. 199-200.
8. Chenais E. Epidemiological considerations on African swine fever in Europe 2014-2018 / E. Chenais, K. Depner, V. Guberti, K. Dietze, A. Viltrop, K. St hl // Porcine Health Manag. - 2019. -5:6.
9. Zhou X. Emergence of African swine fever in China, 2018 / X. Zhou, N. Li, Y. Luo, Y. Liu, II Miao, T. Chen [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. - 2018. -Vol. 65. - № 6. - Р. 1482-1484.
10. Wang T. African swine fever: an unprecedented disaster and challenge to China / T. Wang, Y. Sun, H. J. Qiu // Infect Dis Poverty. - 2018. - Vol. 7. - № 1. - I? 111.
11. Болезни, выявленные в 2019 году, о которых сообщили в МЭБ со 16.02.2019 по 22.02.2019 [электронный ресурс] / Россельхознадзор // Эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: https:// www.fsvps.ru/fsvps/iac/messages/3002.html [Дата обращения: 3 июня 2019].
12. Сводная информация МЭБ о регистрации болезней в 2019 году в странах мира (01.01.19 -31.01.19) в ранее благополучных странах [электронный ресурс] / Россельхознадзор // Эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: https:// www.fsvps.ru/fsvps/iac/messages/2982.html [Дата обращения: 3 июня 2019].
13. Сводная информация МЭБ о регистрации болезней в 2019 году в странах мира (02.04.19 -30.04.19) в ранее благополучных странах [электронный ресурс] / Россельхознадзор // Эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: https:// www.fsvps.ru/fsvps/iac/messages/3060.html [Дата обращения: 3 июня 2019].
14. Болезни, выявленные в 2019 году, о которых сообщили в МЭБ с 11.05.2019 по 17.05.2019 [электронный ресурс] / Россельхознадзор // Эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: https:// www.fsvps.ru/fsvps/iac/messages/3069.html [Дата обращения: 3 июня 2019].
15. Эпизоотическая ситуация по АЧС в РФ с 2007 по 2019 года [электронный ресурс] / Россельхознад-зор // Эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: https://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/ asf/2019/05-13/03.pdf [Дата обращения: 3 июня 2019].
16. Sanchez-Vizcaino J. M. An update on the epidemiology and pathology of African swine fever / J. M. Sanchez-Vizcaino, L. Mur, J. C. Gomez-Villamandos, L. Carrasco // J. Comp. Pathol. - 2015.
- Vol. 152. - № 1. - P. 9-21.
17. Dixon L. K. African swine fever virus replication and genomics / L. K. Dixon, D. A. G. Chapman, C. L. Netherton, C. Upton // Virus Res. - 2013. - Vol.173.
- № 1. - P. 3-14.
18. Макаров В. В. Иммунологическая концепция африканской чумы свиней / В. В. Макаров // Ветеринарная практика. - 2013. - № 3. - С. 7-22.
19. Макаров В. В. Апоптоз в системе «вирус африканской чумы свиней - мононуклеарные фагоциты свиньи» / В. В. Макаров // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1995.
- № 3. - С. 38-43.
20. Tulman E. R. Novel virulence and host range genes of African swine fever virus / E. R. Tulman, D. L. Rock // Curr. Opin. Microbiol. - 2001. - Vol. 4. - № 4. - I? 456-461.
21. Quembo C. J. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype / C. J. Quembo, F. Jori, W. Vosloo, L. Heath // Transbound Emerg Dis.
- 2018. - Vol. 65. - № 2.- P 420-431.
22. Malogolovkin A. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups / A. Malogolovkin, G. Burmakina, I. Titov, A. Sereda, A. Gogin, E. Baryshnikova [et al.] // Emerging Infect. Dis. - 2015. - Vol. 21. - № 2. - P. 312-315.
23. Середа А. Д. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней / А. Д. Середа, В. М. Балышев // Вопросы вирусологии. - 2011. - Т. 56.
- № 4. - С. 38-42.
24. Cobbald C. Involvement of the endoplasmic reticulum in the assembly and envelopment of African swine fever virus / C. Cobbald, J. T. Whittle, T. Wileman // J. Virol. - 1996. - Vol. 70. - № 12. - P. 8382-8390.
25. Mosser D. M. Receptor mediated subversion of macrophage cytokine production by intracellular pathogens / D. M. Mosser, C. L. Karp // Curr. Opin. Immunol. - 1999. - Vol. 11. - № 4. - P. 406-411.
26. Miskin J. E. African swine fever virus protein A238L interacts with the cellular phosphatase calcineurin via a binding domain similar to that of NFAT / J. E. Miskin, C. C. Abrams, L. K. Dixon // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - № 20. - P. 9412-9420.
27. Correia S. Identification and utility of innate immune system evasion mechanisms of ASFV / S. Correia, S. Ventura, R. M. Parkhouse // Virus Res. -2013. - Vol. 173. - № 1. - P. 87-100.
28. Neilan J. G. A conserved African swine fever virus I kappa B homolog, 5EL, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine / J. G. Neilan, Z. Lu, G. F. Kutish, L. Zsak, T. L. Lewis, D. L. Rock // Virology. - 1997. - Vol. 235. - № 2. - P 377-385.
29. Powell P. P. An IkappaB homolog encoded by African swine fever virus provides a novel mechanism for downregulation of proinflammatory cytokine responses in host macrophages / P. P. Powell, L. K. Dixon, R. M. Parkhouse // J. Virol. -1996. - Vol. 70. - № 12. - P. 8527-8533.
30. Revilla Y. Inhibition of nuclear factor kappaB activation by a virus-encoded IkappaB-like protein / Y. Revilla, M. Callejo, J. M. Rodriguez, E. Culebras, M. L. Nogal, M. L. Salas [et al.] // J. Biol. Chem. -1998. - Vol. 273. - № 9. - P. 5405-5411.
31. Miskin J. E. A viral mechanism for inhibition of the cellular phosphatase calcineurin / J. E. Miskin, C. C. Abrams, L. C. Goatley, L. K. Dixon // Science. -1998. - Vol. 281. - № 5376. - P. 562-565.
32. Salguero F. J. Cytokine mRNA expression and pathological findings in pigs inoculated with African swine fever virus (E-70) deleted on A238L / II J. Salguero, S. Gil, Y. Revilla, C. Gallardo, M. Arias, C. Martins // Vet. Immunol. Immunopathol.
- 2008. - Vol. 124. - № 1-2. - P. 107-119.
33. Granja A. G. The viral protein A238L inhibits cyclooxygenase-2 expression through a nuclear factor of activated T cell-dependent transactivation pathway / A. G. Granja, M. L. Nogal, C. Hurtado, V.
Vila [et al.] // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - № 51. - P. 53736-53746.
34. Miskin J. E. African swine fever virus protein A238L interacts with the cellular phosphatase calcineurin via a binding domain similar to that of NFAT / J. E. Miskin, C. C. Abrams, L. K. Dixon // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - № 20. - P. 9412-9420.
35. Granja A. G. A238L inhibits NF-ATc2, NF-kappa
B, and c-Jun activation through a novel mechanism involving protein kinase C-theta-mediated up-regulation of the amino-terminal transactivation domain of p300 / A. G. Granja, N. D. Perkins, Y. Revilla // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. - № 4. - P. 2429-2442.
36. Rodriguez J. M. Genetic manipulation of African swine fever virus: construction of recombinants expressing the b-galactosidase gene / J. M. Rodriguez, IF Almazan, E. Vinuela, J. IF Rodriguez // Virology. - 1992. - Vol. 188. - P. 67-76.
37. Zsak L. An African swine fever virus virulence-associated gene NL-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34.5 gene / L. Zsak, Z. Lu, G. II Kutish, J. G. Neilan, D. L. Rock // J. Virol. - 1996. -Vol. 70. - № 12. - P. 8865-8871.
38. Afonso C. L. African swine fever virus NL gene is not required for virus virulence / C. L. Afonso, L. C. Zsak, C. M. V. Carrillo, M. V. Borca, D. L. Rock // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol. 79. - № 10. - P. 2543-2547.
39. Borca M. VAn African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption / M. V. Borca, G. I. Kutish,
C. L. Afonso, P. Irusta, C. Carrillo, A. Brun [et al.] // Virology. - 1994. - Vol. 199. - № 2. - P. 463-468.
40. Zsak L. A nonessential African swine fever virus gene UK is a significant virulence determinant in domestic swine / L. Zsak, E. Caler, Z. Lu, G. I. Kutish, J. G. Neilan, D. L. Rock // J. Virol. - 1998. -Vol. 72. - № 2.- P 1028-1035.
41. Abrams C. C. Sequential deletion of genes from the African swine fever virus genome using the cre/loxP recombination system / C. C. Abrams, L. K. Dixon // Virology. - 2012. - Vol. 433. - № 1. - P. 142-148.
42. Lewis T. An African swine fever virus ERV1-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine / T. Lewis, L. Zsak, T. G. Burrage, Z. Lu, G. I. Kutish, J. G. Neilan [et al.] // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - № 3. - P. 1275-1285.
43. Moore D. M. The African swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine / D. M. Moore, L. Zsak, J. G. Neilan, Z. Lu, D. L. Rock // J. Virol. - 1998. - Vol. 72. - № 12. - P. 10310-10315.
44. O>Donnell V African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of MGF360 and MGF505 genes is attenuated in swine and confers protection against challenge with the virulent parental virus / V O>Donnell, L. G. Holinka, D. P. Gladue, B. Sanford, P. W Krug, X. Lu [et al.] // J. Virol. - 2015. - Vol. 89. - № 11. - P. 6048-6056.
45. O>Donnell V African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of 9GL and MGF360/505 genes is highly attenuated in swine but does not confer protection against parental virus challenge / V. O>Donnell, L. G. Holinka, B. Sanford, P. W. Krug, J. Carlson, J. M. Pacheco [et al.] // Virus Res. - 2016. - Vol. 221. - P. 8-14.
46. Abrams C. C. Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulent virus / C. C. Abrams, L. Goatley, E. Fishbourne, D. Chapman, L. Cooke, C. A. Oura [et al.] // Virology. - 2013. - Vol. 443. - № 1. - P. 99-105.
References:
1-3. Vide supra.
4. Balyshev V M. Biologicheskie svojstva virusa afrikanskoj chumy svinej, vydelennogo v Rossijskoj Federacii [Biological properties of African swine fever virus isolated in the Russian Federation] / V M. Balyshev, V V Kurinnov, S. Zh. Cybanov, Yu. F Kalantaenko, D. V Kolbasov, V V Pronin i dr. // Veterinariya. - 2010. - № 7. - S. 25-27.
5-10. Vide supra.
11. Bolezni, vyyavlennye v 2019 godu, o kotoryh soobshchili v MEB so 16.02.2019 po 22.02.2019 [Diseases identified in 2019 reported to the OIE from February 16, 2019 to February 22, 2019] [elektronnyj resurs] / Rossel>hoznadzor // Epizooticheskaya situaciya ACHS. - Rezhim dostupa: https-www-fsvps-ru-fsvps-iac-messages-3002-html [Data obrashcheniya: 3 iyunya 2019].
12. Svodnaya informaciya MEB o registracii boleznej v 2019 godu v stranah mira (01.01.19 - 31.01.19) v ranee blagopoluchnyh stranah [Summary of the OIE on the registration of diseases in 2019 in countries around the world (01/01/19 - 01/31/19) in previously prosperous countries] [elektronnyj resurs] / Rossel>hoznadzor // Epizooticheskaya situaciya ACHS. - Rezhim dostupa: https-www-fsvps-ru-fsvps-iac-messages-2982-html [Data obrashcheniya: 3 iyunya 2019].
13. Svodnaya informaciya MEB o registracii boleznej v 2019 godu v stranah mira (02.04.19 - 30.04.19) v ranee blagopoluchnyh stranah [Summary of the OIE on the registration of diseases in 2019 in the countries of the world (April 2, 19 - April 30, 19) in previously prosperous countries] [elektronnyj resurs] / Rossel>hoznadzor // Epizooticheskaya situaciya ACHS. - Rezhim dostupa: https-www-fsvps-ru-fsvps-iac-messages-3060-html [Data
obrashcheniya: 3 iyunya 2019].
14. Bolezni, vyyavlennye v 2019 godu, o kotoryh soobshchili v MEB s 11.05.2019 po 17.05.2019 [Diseases identified in 2019 reported to the OIE from 05/11/2019 to 05/17/2019] [elektronnyj resurs] / Rossel>hoznadzor // Epizooticheskaya situaciya ACHS. - Rezhim dostupa: https-www-fsvps-ru-fsvps-iac-messages-3069-html [Data obrashcheniya: 3 iyunya 2019].
15. Epizooticheskaya situaciya po ACHS v RF s 2007 po 2019 goda [Epizootic situation on ASF in the Russian Federation from 2007 to 2019] [elektronnyj resurs] / Rossel>hoznadzor // Epizooticheskaya situaciya ACHS. - Rezhim dostupa: https-www-fsvps-ru-fsvps-docs-ru-iac-asf-2019-05-13-03-pdf [Data obrashcheniya: 3 iyunya 2019].
16-17. Vide supra.
18. Makarov V. V. Immunologicheskaya koncepciya afrikanskoj chumy svinej [Immunological conception for african swine fever] / V. V. Makarov // Veterinarnaya praktika. - 2013. - № 3. - S. 7-22.
19. Makarov V V Apoptoz v sisteme «virus afrikanskoj chumy svinej - mononuklearnye fagocity svin>i» [Apoptosis in the system 'African swine fever virus - mononuclear phagocytes of the pig"] / V. V. Makarov // Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. - 1995. - № 3. - S. 38-43.
20-22. Vide supra.
23. Sereda A. D. Antigennoe raznoobrazie virusa afrikanskoj chumy svinej [Antigenic diversity of African swine fever viruses] / A. D. Sereda, V. M. Balyshev // Voprosy virusologii. - 2011. - T. 56. - № 4. - S. 38-42.
24-46. Vide supra.
DOI: 10.25690/VETPAT.2020.72.2.001 Nefed>eva M. V., Titov I. A., Malogolovkin A. S.
OBTAINING AND STUDYING IN VITRO OF THE RECOMBINANT VIRUS OF THE AFRICAN SWINE FEVER WITH A238L GENE DELETION
Key Words: African swine fever, immunomodulating proteins, A238L gene, cloning, plasmid vector, green fluorescent protein (EGFP), recombinant virus, COS-1 cell culture, homologous recombination, real-time quantitative PCR.
Abstract: African swine fever (ASF) is a deadly and dangerous viral disease of pigs and wild boars, which leads to significant economic losses. Despite the progress in the study of immunopathology in ASF, the creation of a universal effective and safe vaccine against ASF virus has not been successful so far. This is due to the complex structure of the virus, the high variability of the genome and the presence of a large number of immunomodulating proteins. As is the case with other large DNA viruses, the ASF virus genome encodes several proteins that help the virus evade the host's immune response. One of them is the powerful immunosuppressant protein 5EL (A238L gene) - an IkB homolog and calcium neurin phosphatase inhibitor that causes programmed cell death. The aim of the study was to obtain a recombinant ASF virus with deletion of the A238L gene by homologous recombination and to study its reproduction in vitro. As a result, a recombinant Volgograd / 14c AA238L ASF virus was obtained from the strain of ASF virus «Volgograd / 14c» in the transplanted cell culture COS-1. According to the results of our studies, the removal of the A238L gene from the virulent Volgograd / 14c strain did not lead to a change in the cultural properties of the recombinant Volgograd / 14c AA238L virus in the transplanted cell culture COS-1. Reproduction of the recombinant strain Volgograd / 14c AA238L in primary culture of pigs macrophage cells and COS-1 cell culture is 4.0-5.0 lg GAE 50 / cm3. There were no differences in the the dynamics of reproduction of the initial and recombinant strains. It was shown that reporter fluorescence of the EGFP gene is observed at different multiplicity of infection (0.1 and 1), which indicates the effective replication of the virus.
Сведения об авторах:
Нефедьева Мария Владимировна, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории геномики вирусов Федерального государственного бюджетного научного учреждения (ФГБНУ) «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»; стр. 1, ул. Академика Бакулова, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, Российская Федерация, 601125; e-mail: [email protected]
Титов Илья Андреевич, канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории геномики вирусов Федерального государственного бюджетного научного учреждения (ФГБНУ) «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»; стр. 1, ул. Академика Бакулова, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, Российская Федерация, 601125; e-mail: [email protected]
Малоголовкин Александр Сергеевич, канд. биол. наук, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного научного учреждения (ФГБНУ) «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»; стр. 1, ул. Академика Бакулова, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, Российская Федерация, 601125; e-mail: [email protected]
Author affiliation:
Nefed'eva Mariya Vladimirovna, post-graduate Student, Junior Researcher of the Viral Genomics Laboratory of the Federal State Budget Scientific Institution (FSBSI) «Federal Research Center of Virology and Microbiology»; building 1, Academician Bakulov str., settlement Volginsky, Petushinsky District, Vladimir Region, Russian Federation, 601125; e-mail: [email protected]
Titov Il'ya Andreevich, Ph. D. in Biology, Researcher of the Viral Genomics Laboratory of the Federal State Budget Scientific Institution (FSBSI) «Federal Research Center of Virology and Microbiology»; building 1, Academician Bakulova str., settlement Volginsky, Petushinsky District, Vladimir Region, Russian Federation, 601125; e-mail: [email protected]
Malogolovkin Aleksander Sergeevich, Ph. D. in Biology, Chief Researcher of the Federal State Budget Scientific Institution (FSBSI) «Federal Research Center of Virology and Microbiology»; building 1, Academician Bakulova str., settlement Volginsky, Petushinsky District, Vladimir Region, Russian Federation, 601125; e-mail: [email protected]
