CC BY
489
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 575.27
Профессор О.С. Корнеева, аспирант В.А. Анненков (Воронеж, гос. ун-т инж. технол.) кафедра биохимии и биотехнологии, тел. (473)255-55-57
Получение ферментного препарата липазы методом рекомбинантных ДНК
Рассмотрено влияние условий биосинтеза (рН, t, времени культивирования, концентрации IPTG-индуктора, времени внесения IPTG и времени биосинтеза) на получение максимального количества фермента LipA.
The influence of the conditions of biosynthesis (pH, t, the culture time, the concentration of IPTG-inducer, IPTG time of application and time of biosynthesis) to obtain the maximum amount of the enzyme LipA.
Ключевые слова: рекомбинантная липаза, индуктор, IPTG, активность фермента, биосинтез.
На основании данных по пространственной структуре ферментов-липаз микробного происхождения и их термостабильных гомологов, а также исходя из новых представлений о механизмах повышения термостабильности белков и новейших компьютерных методов моделирования структуры и свойств биомакромолекул с применением методов генной инженерии предложен способ получения липазы LipA с увеличенной термостабильностью.
Ферментные препараты используются в пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и сельском хозяйстве. Препараты липазы входят в состав лекарств для коррекции нарушений процесса пищеварения и регуляции функций поджелудочной железы (панкреатин). Также липаза применяется в процессах пере-этерификации жиров, в составе синтетических моющих средств.
Известно, что существующие коммерческие препараты липазы обладают недостаточной термоустойчивостью, чистотой и являются нестабильными в условиях промышленного производства. Эти недостатки делают процесс применения липаз трудоемким и дорогостоящим.
Одним из путей решения данной проблемы является создание препаратов рекомбинантных липаз, отличающихся повышенной термостабильностью за счет внесения аминокислотных замен, увеличивающих устойчивость молекулы фермента к внешним воздействиям. Кроме того, препараты рекомбинантных липаз обладают высокой активностью и специфичностью действия.
Рекомбинантный белок получали путем плазмидной трансформации гена синтеза липазы LipA в клетки Е. coli ТОР-10. Донором гена служили клетки В. subtilis 168, выбранные путем скрининга продуцентов грибного и бактериального происхождения.
(С)Корнеева О.С., Анненков В.А., 2014
Наращивание биомассы кишечной палочки осуществлялось глубинным способом культивирования в качалочных колбах с питательной средой Лурия-Бертани. Очистку проводили методом аффинной хроматографии [1].Активность липазы определяли титриметрическим методом [2].
Получали порошкообразный препарат липазы с помощью сушки фермента на лиофильной сушилке ЛС-500 (рис.1).
Рис. 1. Схема получения рекомбинантной липазы с повышенной термостабилъностъю
Результаты исследования характеризуют рекомбинантный штамм как высокостабильный. Активность липазы Е. сой ТОР-10 остается выше 90 ед/мг (сохраняется более 80 % активности по сравнению с 1 пассажем) после 3 пересевов культуры [3].
Экспериментом установлено, что оптимальные условия для биосинтеза липазы на питательной среде Лурия-Бертани достигаются при рН = 6 и t = 42 °С.
Зависимость активности липазы от температуры и рН отображена на рис. 2 и 3.
100
£
j 60 StJ
IH-1- -1-1-—-
J J • 5 » 7 » ♦ 1« 11 1; pH
Puc. 2. Зависимость актив- Рис. 2. Зависимость активно-
ности липазы от рН сти липазы от температуры
21 28 30 32 34 36 38 40 42 Температура, С
О 7
1РТСт-индуктор запускает ген синтеза липазы в бактериальных клетках, увеличивая выход требуемого белка и его растворимость. Правильно рассчитанное время его внесения и оптимальная концентрация индуктора косвенно влияет и на искомую активность липолитического фермента.
Максимальную активность белок проявлял при концентрации 1 ммоль 1РТСт. При этом значении активность фермента составила 113,1 ед/мг. Допустимо снизить концентрацию вносимого индуктора в связи с его высокой стоимостью, но не ниже концентрации 0,1 ммоль (при данной концентрации активность снижается до 94,2 ед/мг).
Исследовав продолжительность биосинтеза липазы 1лрА, установили, что оптимальное время культивирования штамма Е.сой ТОР-10 -8 ч. Внесение 1РТСт-индуктора целесообразно проводить через 4 ч после начала биосинтеза вследствие накопления максимальной биомассы культуры микроорганизмов (рис. 4).
120 100 80 £ во
о
5 40 х
% 20 <
0
Рис. 4. Зависимость липазной активности культуры рекожбинантной E.coli от времени внесения индуктора
Исследование физико-химических свойств липазы позволило установить, что фермент может работать в нейтральных и щелочных средах. Оптимум pH = 9,0. Ферментативный гидролиз липазой LipA можно проводить в условиях жестких температур (до 90 °С). Оптимум температуры составляет 60 °С.
Полученные в ходе эксперимента параметры биосинтеза высокоактивной липазы LipA отображены в таблице.
Таблица
Оптимальные условия для синтеза рекомбинантной липазы из штамма E.coli ТОР-Ю на питательной среде Лурия-Бертани
Параметры оптимизации Величина
Время внесения 1РТО, ч 4
Время биосинтеза после внесения индуктора, ч 4
Общее время культивирования, ч 8
Концентрация индуктора, ммоль 1
Температура, °С 42
рН 9
Время внесения индуктора, ч
Большая удельная активность липолитического фермента расширяет область использования LipA на производстве. Полученный высушенный ферментный препарат можно использовать для улучшения органолептических показателей мяса, рыбы, напитков, хлебобулочных изделий; при получении жиров и масел; на химических, косметических, фармацевтических предприятиях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Don, S. М. Optimal conditions for the growth of E. Coli // Biology EEI.- 2008.-№ 4,- P. 3-18.
2. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов [Текст] / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, Л. В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003.
- 375 с.
3. Черенков, Д.А. Получение термостабильной липазы с помощью методов компьютерного моделирования и генной инженерии [Текст] / Д. А. Черенков, В. А. Анненков, Е. В. Першина [и др.] // Актуальная биотехнология.- 2013.- № 3.
- С. 34-35.
REFERENCES
1. Don, S. М. Optimal conditions for the growth of E. Coli // Biology EEI.- 2008.-№ 4,- P. 3-18.
2. Polygalina, G.V. Determination of activity of enzymes [Text] / G. V. Polygalina, V. S. Cherednichenko, L.V. Rimarev. - M.: Put a print, 2003. - 375 p.
3. Cherenkov, D. A. Receiving a thermostable lipase by means of methods of computer modeling and genetic engineering [Text] / D.A. Cherenkov, V.A. Annenkov, E. V. Pershina [etc.] // Actual biotechnology. - 2013. - № 3.- P. 34-35.
