CC BY
8УДК 579.66:577.217.3+579.842.11
А. Б. Булатовский1, Н. Н. Веялкина2, А. И. Зинченко1
ПОЛУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ АННЕКСИНА А5 И АДЕНОЗИНДЕГРАДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ
Тосударственное научное учреждение «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220084, г. Минск, ул. Акад. Купревича, 2 e-mail: [email protected] ^Государственное научное учреждение «Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 246007, г. Гомель, ул. Федюнинского, 4
Приведены результаты исследований, посвященных разработке биологической технологии получения препаратов химерных белков, представляющих собой человеческий белок аннексин А5, генно-инженерно слитый с аденозиндезаминазой или пуриннуклеозидфосфорилазой бактериальной природы. Технологическая схема содержит следующие стадии: создание штаммов-продуцентов, глубинное культивирование соответствующих штаммов, ультразвуковая дезинтеграциия клеток и осветление клеточного лизата, металл-аффинная хроматография с последующим диализом растворов целевых белков. Указанная технология позволяет получать химерные белки аннексин-аденозиндезаминаза и аннексин-пуриннуклеозидфосфорилаза с чистотой более 95% и выходом порядка 74%. Препараты полученных белков проявили ограниченную противоопухолевую активность на мышиной модели солидной опухоли при перевивке клеток асцитной карциномы Эрлиха. .
Ключевые слова: химерный белок, аннексин А5, Escherichia coli, фосфатидилсерин, аденозиндезаминаза, пуриннуклеозидфосфорилаза, лабораторная технология.
Введение
Рак является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. По данным Американского онкологического общества, в 2022 г. в Соединенных Штатах произошло 1,9 млн новых случаев заболевания раком и 610 000 случаев смерти от рака, что представляет серьезную угрозу для здоровья человека [1, 2].
В настоящее время для лечения рака применяются главным образом лучевая терапия, хирургия и химиотерапия — раздельно или в комбинациях. Радиация и хирургия имеют ограниченные возможности, так как они не могут излечивать метастазы, которые образуются иногда уже на ранних стадиях заболевания.
Основной проблемой, тормозящей развитие химиотерапии рака, является неспособность таких препаратов эффективно отличать «больные» клетки от здоровых. Так, считается, что в результате системного введения противоопухолевых цитостатиков лишь 1% препаратов
достигает цели, тогда как основная часть поражает здоровые ткани организма. В результате они вызывают серьезные побочные эффекты, которые часто сводят на нет пользу от такого лечения. Кроме того, традиционная химиотерапия (предусматривающая непосредственную гибель опухолевых клеток) становится фактором отбора резистентных клеточных вариантов и ослабляет иммунитет организма в отношении инфекционных заболеваний и рецидивов рака в будущем.
Важный успех в изучении рака (обнаружение молекулярных мишеней, уникальных для раковых клеток) дал толчок к развитию так называемой таргетной (или адресной) терапии — одного из перспективных направлений лечения онкологических заболеваний. Этот способ лечения предполагает использование препаратов, мишенью которых служат молекулы, синтезирующиеся только опухолевыми клетками [3, 4].
Фосфатидилсерин (ФС) представляет собой
компонент клеточной мембраны, находящийся главным образом на ее внутренней стороне, за исключением раковых клеток и кровеносных сосудов опухолей, где он находится на наружной стороне клеточных мембран [5]. Поэтому ФС служит в качестве мишени для таргетной терапии рака [6]. В качестве транспортера противораковых субстанций при такой терапии может выступать аннексин А5 — человеческий плацентарный белок, который имеет сильное сродство к ФС [7].
Нами ранее предложена идея устранения защиты рака от хозяйского иммунитета с помощью аденозиндеградирующих ферментов, в частности аденозиндезаминазы (АДазы) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФазы), слитых с человеческим белком аннексином А5 [8, 9].
Целью данной работы явилось создание простой лабораторной технологии получения и предварительное изучение противоопухолевой активности препаратов химерных белков аннексин-АДазы («Аннексин-АДаза») и ан-нексин-ПНФазы («Аннексин-ПНФаза»).
Материалы и методы
Полученные нами ранее плазмиды pAA17 и pAD19 [10, 11] использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli Rosetta 2(DE3), в результате чего были получены рекомбинантные штаммы E. coli AA17 — продуцент химерного белка аннек-син-АДазы и E. coli AD19 — продуцент химерного белка аннексин-ПНФазы.
Трансформированные бактерии высевали на среду Luria-Bertani с селективным антибиотиком (канамицин 100,0 мкг/мл) и растили в течение 18 ч. По прошествии этого времени выросшие колонии анализировали по цвету, прозрачности и текстуре края колоний (светло-бежевого цвета, прозрачные, с ровным краем). Колонии, имеющие правильные признаки, подвергали молекулярно-генетическо-му скринингу методом ПЦР, для определения вставки генов химерных белков в плазмидах.
Реакционная смесь для ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1 ед. активности Flash ДНК-полимеразы (ООО «АртБиоТех», Беларусь), 20 мкл 2,5Х буфера для Flash ДНК-полимеразы, по 20 пмоль прямого (5'-GT GGTGGTCCACAACGCTACCCCACACATTA
ATG-3') и обратного праймеров (5'-GGTGAT GGTGATGCTCGTCATCTTCTCCACAGAGC AG-3') и ДНК бактериальных клеток трансформантов. Амплификацию проводили по следующей программе: этап предденатура-ции (2 мин — 98 °С); 25 циклов амплификации (5 сек — 98 °С; 5 сек — 55 °С; 60 сек — 72 °С); финальная элонгация (2 мин — 72 °С). Использованные в работе олигонуклеотидные праймеры синтезированы ООО «АртБиоТех» (Беларусь).
Колонии, имеющие вставки генов химерных белков, были пересеяны и использованы для наработки целевых белков.
На первом этапе работы проводили культивирование ночной культуры полученных ре-комбинантных штаммов E. coli АА17 и E. coli AD19 в 50 мл жидкой питательной среды Luria-Bertani с селективным антибиотиком ка-намицином 100,0 мкг/мл в течение 18 ч.
Глубинное культивирование полученных штаммов-продуцентов для экспрессии химерных белков проводили в двухлитровых колбах Эрленмейера с 540 мл жидкой питательной среды ZYM505 [12], содержащей канамицин в концентрации 100,0 мкг/мл. В каждую колбу вносили по 10 мл ночной культуры E. coli АА17 и E. coli А019.
Бактерии культивировали на термостати-руемой качалке в течение 4 ч при температуре 37 °С до достижения оптической плотности культуральной жидкости (КЖ) 0,6 (X = 600 нм), затем в колбы вносили по 200 мкл индуктора изопропил^-0-1-тиогалактопира-нозида (0,5 M) и продолжали культивирование в течение 4 ч. Далее клетки осаждали центрифугированием при 15 000 g в течение 10 мин и температуре 4 °С. Супернатант отбрасывали, осадок промывали 100 мл буфера А (300 мМ NaCl, 50 мМ Na2HPO4, 10 мМ имидазол, pH 8,0) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Клетки ресуспендировали в 25 мл охлажденного буфера А и разрушали ультразвуком, используя прибор «Sonifier-450» («Brandson», США) при следующих режимах: мощность — 0,05 кВт; температура — 4 °С; продолжительность — 600 импульсов по 0,5 сек. Клеточные лизаты осветляли центрифугированием при 60 000 g в течение 40 мин и температуре 4 °С.
Супернатанты, содержащие целевые бел-
ки, наносили на хроматографические колонки с 5 мл смол Ni-NTA («Quagen», США). Через колонки последовательно пропускали 200 мл промывочного буфера А. Химерные белки элюировали буфером Б (300 мМ NaCl, 50 мМ Na2HPO4, 500 мМ имидазол, pH 8,0). Полученные в результате металл-аффинной хроматографии растворы белков объединяли и подвергали диализу против 400-кратного объема фосфатно-солевого буфера (137 мМ NaCl, 10 мМ Na2HPO4, 2,7 мМ KCl, 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4; PBS). Препараты химерных белков после диализа анализировали с помощью доде-цилсульфат натрия (ДСН) полиакриламидно-го гель-электрофореза.
Измерение ферментативных активностей (АДазной и ПНФазной) проводили как описано нами ранее [9].
Проверку противоопухолевой активности препаратов «Аннексин-АДаза» и «Аннек-син-ПНФаза» проводили на самках мышей линии BALB/с в возрасте 2,5-3 месяца. Животных содержали в условиях стационарного вивария Института радиобиологии НАН Беларуси на полноценном стандартном пищевом рационе и свободным доступом к воде, 12/12-часовом режиме освещения и темноты.
Использование животных в эксперименте проводилось с соблюдением норм, регламентированных международными рекомендациями и правилами Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 г.
Суспензию клеток асцитной карциномы Эр-лиха (АКЭ), для последующей перевивки получали у мышей-доноров на 9-е сутки роста опухоли. Для прививки опухоли приготавливалась суспензия клеток АКЭ в концентрации 9 х 107 клеток на 1 мл суспензии. Животным вводили по 0,1 мл суспензии (9 х 106 клеток) в область первой пары молочной железы у правой передней конечности животного, место прокола обрабатывали спиртом.
Начиная с 5-х суток прививки опухолевых клеток животным двух групп вводили препараты химерных белков «Аннексин-АДаза» и «Аннексин-ПНФаза» в область образования опухолевого узла в дозе 5 мг/кг массы животного. Контрольной группе животных вводили стерильный 0,9%-й раствор NaCl в соот-
ветствующем объеме.
Наблюдение за состоянием животных вели на протяжении всего экспериментального периода. На 22 сутки эксперимента выполнялся рентгеновский снимок при помощи установки для облучения биологического назначения Х-КАО 320 с системой визуализации ОрйМАХ (PrecisionX-RayInc., США), для чего мышь наркотизировали и фиксировали на специальной подложке. Далее полученные изображения обрабатывали при помощи программного пакета ImageJ. Значения площади опухолевого узла использовали для расчета процента торможения роста опухоли (ТРО, %). Расчеты проводили по формуле 1:
TPO =
S - S
контроля о:
S X
контроля
100
(1)
Животных выводили из эксперимента путем декапитации на фоне глубокого эфирного наркоза на 22-е сутки после прививки опухолевых клеток.
Приведенные в работе экспериментальные данные (кроме табл. 2) представляют собой доверительный интервал среднего арифметического для 95%-го уровня вероятности.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы проводили глубинное культивирование бактерий и выделение из них химерных белков. Для этого мы использовали подобранные условия: штаммы E. coli АА17 и E. coli AD19; среда ZYM505; время индукции синтеза целевых белков — 4 ч. Полученные клеточные биомассы подвергали непрерывной ультразвуковой дезинтеграции и центрифугированию на ультраскоростной центрифуге при 60 000 g в течение 40 мин для освобождения от телец-включения. Клеточные лизаты наносили на колонку со смолой и проводили промывку смолы для удаления примесных компонентов. Первый, отмывочный, буфер А служил для отмывки от не целевых клеточных компонентов. Второй буфер Б служил для проведения элюции химерных белков со смолы Ni-NTA. Элюцию проводили градиентным методом, начиная от 80 мМ имидазола в буфере и заканчивая буфером с концентрацией имидазола 500 мМ. Этот метод элюции помогает получить более чистые фракции хи-
мерного белка, содержащих минимальное количество имидазола.
Концентрацию белка в образцах определяли методом Брэдфорд [13]. Пробы с наибольшей концентрацией белка объединяли и подвергали диализу против 400-кратного объема буфера PBS. В данном буфере осмолярность и концентрации ионов соответствуют концентрациям в теле человека и животных. Применение этого буфера в качестве растворителя препаратов химерных белков не будет способствовать вызову неспецифического иммунного ответа или воспаления, поэтому PBS-буфер является более удобным для проведения исследований на мышах. Чистота полученных препаратов химерных белков по данным гель-электрофореза (рис. 1) составила не менее 95%.
желез. При этом у мышей сформировались опухолевые узлы плотной консистенции с бугристой неровной поверхностью, которые хорошо определялись при пальпации и при рентгенографии.
Создание штамма-продуцента E. coli AA17
Создание штамма-продуцента E. coli AD19
I
I
Культивирование штамма-продуцента и индукция биосинтеза химерного белка
Центрифугирование культуральной жидкости (15 000 g 15 мин)
I
I
Ультразвуковая дезинтеграция клеток штаммов-продуцентов с последующим центрифугированием
I
I
Аффинная хроматография на Ni-NTA Agarose
Диализ
Рис. 1. Электрофореграмма в ДСН-полиакриламидном геле очищенных химерных белков: 1 — белок аннек-син-ПНФаза, 2 — белок аннексин-АДаза; М — стандарты молекулярной массы белков
Препарат химерного белка «Аннексин-АДаза»
Препарат химерного белка «Аннексин-ПНФаза»
Разработанная в настоящем исследовании общая технологическая схема получения препаратов химерных белков «Аннексин-АДаза» и «Аннексин-ПНФаза» представлена на рисунке 2.
Применение этой схемы позволяет получать высокоочищенные препараты целевых белков с выходом не менее 74% (табл. 1).
Результаты исследования противоопухолевой активности препаратов «Аннексин-АДа-за» и «Аннексин-ПНФаза» на мышах линии ВАЬВ/с показали, что на 5-6 сутки после прививки клеток опухоли АКЭ у животных наблюдалось наличие опухолевого очага и припухлости в области верхних правых молочных
Рис. 2. Схема получения препаратов химерных белков
Введение мышам-опухоленосителям обоих изучаемых препаратов вызывало снижение размеров опухоли по сравнению с контролем (табл. 2). В качестве примера противоопухолевого действия изученных препаратов приведена на рисунке 3 обзорная рентгенограмма мышей в задне-передней проекции на 22 сутки после прививки клеточной суспензии АКЭ, которым вводили препарат «Аннексин-АДаза».
В частности, при введении растворов препаратов «Аннексин-АДаза» и «Аннексин-ПНФа-за» показатель торможения роста опухоли составлял 49,82 и 32,18% соответственно.
Рис. 3. Рентгеновский снимок животных с опухолью. А — животное из контрольной группы, Б и В — животные после введения препарата «Аннексин-АДаза» в дозах 5 и 10 мг/кг соответственно
Таблица 1
Выделение и очистка химерных белков
Стадия очистки Химерный белок Общая активность, ед. Удельная активность, ед./мг Степень очистки Выход, %
Осаждение клеток из КЖ центрифугированием (15 000 g, 15 мин) аннексин-АДаза 7 100 ± 56 6,8 ± 0,5 1 100
аннексин-ПНФаза 13 500 ± 86 7,9 ± 0,6 1 100
УЗ-дезинтеграция клеток с последующим центрифугированием (15 000 g, 30 мин) аннексин-АДаза 6 900 ± 56 6,5 ± 0,5 1 95,6
аннексин-ПНФаза 12 800 ± 81 7,7 ± 0,6 1 94,8
Аффинная хроматография на смоле №-№ГА с последующим диализом аннексин-АДаза 5 280 ± 25 50,6 ± 4,1 7,4 74,4
аннексин-ПНФаза 10 000 ± 86 57,9 ± 4,3 7,1 74,1
Таблица 2
Изменение массы опухоли мышей после введения им препаратов химерных белков
Вводимый препарат Масса опухоли, г Площадь опухоли, см2 Торможение роста опухоли, %
«Аннексин-АДаза» 1,11 ± 0,23* 1,394 ± 0,26 49,82
«Аннексин-ПНФаза» 1,71 ± 0,20 1,884 ± 0,25 32,18
Контроль 2,33 ± 0,55 2,779 ± 0,40 —
Примечание. * — стандартная ошибка среднего арифметического
А Б В
Заключение
Для проверки ранее высказанной нами идеи устранения защиты рака от хозяйского иммунитета с помощью аденозиндеградирующих
ферментов, слитых с аннексином А5, в ходе настоящего исследования была создана биологическая технология получения препаратов химерных белков «Аннексин-АДаза» и «Ан-
нексин-ПНФаза». Разработанная технология позволяет получать указанные белки с чистотой более 95% и выходом порядка 74%. В частично оптимизированных экспериментальных условиях изученные белки проявили ограниченную противоопухолевую активность на мышиной модели солидной опухоли при перевивке клеток асцитной карциномы Эрлиха.
Список использованных источников
1. Li, K. Development of small-molecule immune checkpoint inhibitors of PD-1/PD-L1 as a new therapeutic strategy for tumour immunotherapy / K. Li, H. Tian // J. Drug. Target. - 2019. - Vol. 27. - Р. 244-256.
2. New developments in the mechanism and application of immune checkpoint inhibitors in cancer therapy (Review) / Y. Wang [et al.] // Int. J. Oncology. - 2023. - Vol. 63, № 1. - Art. 86.
3. Basistyi, V. S. A sticky situation for targeted cancer therapy / V. S. Basistyi, J. H. Frederich // Cell. Chem. Biol. - 2023. - Vol. 30, № 6. -P. 569-572.
4. Trajkovic-Arsic, M. Is metabolism the magic bullet for targeted cancer therapy? / M. Trajkovic-Arsic, E. Subramani // BMC Cancer. - 2023. -Vol. 23, № 1. - Art. 484.
5. In search of a novel target—phosphatidylserine exposed by non-apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment efficacy / S. B. Riedl [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 2011. - Vol. 1 808, № 11. - P. 2 638-2 645.
6. Delivery of IL-2 to the T cell surface through phosphatidylserine permits robust expansion of CD8 T cells / A. MacDonald [et al.] // Front. Immunol. - 2021. - Vol. 12. - Art. 755 995.
7. Ran, S. Phosphatidylserine is a marker of tumor vasculature and a potential target for cancer imaging and therapy / S. Ran, P. E. Thorpe // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 2002. - Vol. 54, № 5. - P. 1 479-1 484.
8. Зинченко, А. И. Аденозин как потенциальная мишень для биотерапии рака / А. И. Зин-ченко // Вес. Нац. акад. навук Беларусь Сер. &ял. навук. - 2016. - № 4. - С. 118-128.
9. Булатовский, А. Б. Создание штамма — продуцента бактериальной нуклеозидфосфо-рилазы, слитой с человеческим аннексином А5 / А. Б. Булатовский, А. И. Зинченко // Вес. Нац. акад. навук Беларусь Сер. бiял. навук. -2020. - Т. 65, № 2. - C. 239-244.
10. Создание штамма-продуцента химерного белка, состоящего из человеческого аннек-сина и бактериальной аденозиндезаминазы / А. Б. Булатовский [и др.] // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. - 2017. - Т. 61, № 4. - С. 89-95.
11. Булатовский, А. Б. Создание генетической конструкции для получения штамма-продуцента пуриннуклеозидфосфорилазы, слитой с аннексином-А5 / А. Б. Булатовский, И. С. Казловский, А. И. Зинченко // Сб. науч. трудов Института микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Минск, «Беларуская навука», 2019. - Т. 11. - С. 62-71.
12. Validation of the catalytic mechanism of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase by structural and kinetic studies / G. Mikleusevic [et al.] // Biochimie. - 2011. - Vol. 93. - P. 1 610-1 622.
13. Walker, J. M. The protein protocols handbook / J. M. Walker. - 2-d ed. - Totowa: Humana Press, 2002. - 15 p.
A. B. Bulatovski1, N. N. Veyalkina2, А. I. Zinchenko1
PRODUCTION OF PHARMACOLOGICALLY PROMISING CHIMERIC PROTEINS BASED ON ANNEXIN A5 AND ADENOSINE DEGRADING ENZYMES
1State Scientific Institution "Institute of Microbiology of the National Academy of Sciences of Belarus" 2 Kuprevich St., 220084 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: [email protected] 2State Scientific Institution "Institute of Radiobiology of the National Academy of Sciences of Belarus" 4, Fedyuninskogo St., 246007 Gomel, the Republic of Belarus
A biological technology for the production of chimeric protein preparations, representing the human protein annexin A5, genetically engineered and fused to bacterial adenosine deaminase or purine nucleoside phosphorylase, has been developed. The technological scheme contains the following stages: development of producer strains, submerged cultivation of relevant strains, ultrasonic disintegration of cells, and metal affinity chromatography with subsequent dialysis of target protein solutions. The specified technology enables to obtain chimeric proteins — annexin-adenosine deaminase and annexin-purine nucleoside phosphorylase, with the purity of more than 95% and the yield of about 74%. The obtained protein preparations showed limited antitumor activity on the mouse model of a solid tumour during the transplantation of Erlich ascites carcinoma cells.
Keywords: chimeric protein, annexin A5, Escherichia coli, phosphatidylserine, adenosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, laboratory technology.
Дата поступления в редакцию: 31 августа 2023 г.
