CC BY
152
Химия
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2009, № 0, с. 95-102
95
УДК 541.64
ПОЛУЧЕНИЕ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ БЛОК- И ПРИВИТЫХ СОПОЛИМЕРОВ ХИТОЗАНА И МЕТИЛАКРИЛАТА
© 2009 г. В.Ф. Смирнов 1, А.Е. Мочалова 1, И.В. Белышева 1, А.В. Маркин 1,
М.А. Батенькин 2, Л.А. Смирнова 1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН
Поступила вридабцою 04.06.2009
Синтезированы сополимеры хитозана с метилакрилатом с различной архитектурой макромолекул (блок- и привитые сополимеры), отличающиеся как пространственной ориентацией природных и синтетических цепей, так и их молекулярной массой. Выявлено влияние структуры сополимеров на физико-механические свойства их пленок и способность последних к биодеградации микромицетами.
Ключивыи слова: хитозан, метилакрилат, привитые и блок-сополимеры, биодеградация.
Введение
В настоящее время утилизация отходов полимерных материалов является актуальной задачей с позиции охраны окружающей среды. Большинство синтетических полимеров, пластмасс, резин не пригодны для вторичного использования и в течение долгого времени не разлагаются в «мусорных отвалах». Все крупные в области производства полимерной продукции фирмы с конца прошлого века разрабатывают экологически безопасные стратегии утилизации полимерных отходов. Одна из них заключается в создании биоразлагаемых материалов на основе смесевых композиций природных и синтетических полимеров, другая -сополимеров, содержащих полимерные блоки различной природы. Среди природных полимеров предпочтение отдается классу полисахаридов - крахмалу, целлюлозе, получаемых из постоянно возобновляемых и практически неисчерпаемых источников растительного сырья [1]. Установлено, что способность полимеров разлагаться и усваиваться микроорганизмами зависит от ряда их структурных характеристик. Наиболее важными являются молекулярная масса, раз-ветвленность макроцепи, надмолекулярная структура и химическая природа полимера.
Перспективным природным полимером, который может провоцировать биодеградацию, является хитозан - продукт деацетилирования хитина, второго по распространенности в природе полисахарида. Интерес к нему связан с уникальными физиологическими и экологическими свойствами, такими как биосовмести-
мость, физиологическая активность при отсутствии токсичности, доступность и возобновляемость сырьевых источников, биодеструкция [2]. Несмотря на перечисленный комплекс свойств, хитозан в настоящее время не нашел широкого применения в качестве пленко- и волокнообразующих материалов. Это в значительной мере обусловлено низким уровнем физико-механических свойств изделий на основе полисахарида, получаемого традиционными методами, степень деацетилирования которого, как правило, не превышает 0.8. Высокие физико-механические показатели имеют пленки и волокна хитозана при степени деацетилирования более
0.92, однако синтез такого полимера требует существенного усложнения технологического процесса. С целью устранения указанных недостатков в настоящее время проводятся исследования по химической модификации хито-зана путем полимераналогичных превращений и синтеза его сополимеров с синтетическими мономерами винилового ряда. Перспективным представляется синтез привитых и блок-сополимеров, в которых может быть достигнуто совмещение и усиление полезных свойств, присущих каждому из составляющих его компонентов, а именно: во-первых - улучшение физико-механических свойств самого хитоза-на, во вторых - создание биодеградируемых материалов с заданным комплексом эксплуатационных характеристик и варьируемым временем разложения микроорганизмами окружающей среды.
В качестве модельного объекта синтетических полимеров (мет)акрилового ряда был вы-
бран метилакрилат (МА), поскольку он легко сополимеризуется почти со всеми мономерами. Особенно широко распространены сополимеры с винилхлоридом, винилиденхлоридом, акрило-нитрилом, стиролом. Полиакрилаты и их сополимеры широко применяют для производства листовых и пленочных материалов. Водные дисперсии полимеров алкилакрилатов и их сополимеров используют в качестве основы для приготовления лакокрасочных материалов, клеев и пропиточных составов для бумаги, кожи, дерева и ткани. Наконец, метилакрилат - мономер с одним из наиболее низких значений ПДК паров в воздухе (0.02 мг/л).
Цель работы - получение блок- и привитых сополимеров хитозана и метилакрилата, изучение комплекса их физико-механических свойств и способности к биодеградации.
Материалы и методы
В работе использовали хитозан (ХТЗ) с молекулярной массой (ММ) 1.2x10 и степенью деацетилирования 0.8 без дополнительной очистки (акционерное общество «Биопрогресс», Московская обл.), содержание основного вещества не ниже 99%. Хитозан растворяли в водных растворах уксусной кислоты (УК).
Привитые сополимеры хитозана и метилак-рилата (полиХТЗ-прив-полиМА) получали в водно-уксуснокислых растворах полисахарида (3 мас.%) с концентрацией уксусной кислоты 6 мас.% с использованием в качестве инициатора 2,2’-азо-бос-изобутиронитрила (ДАК) при 333353 К в течение 4 ч. Навеску ДАК (0.01 моль/л) предварительно растворяли в объеме мономера, после чего смешивали с раствором полисахарида: соотношение [МА]/[звено глюкозамина] изменяли от 0.88 до 3.14 (моль/осново-моль).
При синтезе блок-сополимеров развит подход, предложенный в работе [3]: полимеризация виниловых мономеров непосредственно в процессе радикальной деструкции цепей хитозана под действием окислительно-восстановительной системы пероксид водорода - аскорбиновая кислота. Блок-сополимеры хитозана с метилак-рилатом (полиХТЗ-блок-полиМА) получали в водно-уксуснокислых растворах полисахарида (3 мас.%) с концентрацией уксусной кислоты 6 мас.% при 291-296 К. При перемешивании в раствор хитозана последовательно добавляли МА (соотношение [МА]/[звено глюкозамина] изменяли от 1.3 до 4.7 в моль/осново-моль), аскорбиновую кислоту ([С6Н8О6]/[Н2О2] = 1 в моль) и Н202 (соотношение [звено глюкозами-на]/[Н2О2] изменяли от 50 до 100 в осново-
моль/моль). Через 24 ч после начала реакции продукт высаживали двухкратным объемом осадителя, после чего осадок сушили при 323 К под вакуумом до постоянной массы.
Глубину превращения МА при сополимери-зации с хитозаном определяли по результатам анализа остаточного мономера бромид-бромат-ным и гравиметрическим методами. В качестве осадителя продуктов синтеза использовали 5%-ный раствор аммиака.
Для оценки эффективности прививки (отношения массы привитого полимера к массе всего заполимеризовавшегося мономера) и степени прививки (отношения массы привитого полимера к массе хитозана) метилакрилата на хитозан проводили экстракцию гомополимеров МА из продукта реакции ацетоном на аппарате Со-кслета в течение 48 ч.
Для определения ММ блоков ПМА и привитых цепей ПМА в сополимерах проводили деструкцию хитозановых фрагментов NaNO2. Для этого продукт, выделенный из реакционной системы коагуляцией NaNO2, растворяли в ди-оксане. Затем добавляли концентрированную HCl и NaNO2 ([HCl]/[NaNO2] = 1:1 моль/л). Через 24 ч выделяли ПМА, высаживая его этиловым спиртом. ПМА идентифицировали методом ИК-спектроскопии (спектрофотометр In-fralum FT-801). Специальные опыты по обработке ПМА раствором NaNO2 в тех же условиях показали, что цепи синтетического полимера оставались неизменными. Молекулярномассовое распределение (ММР) блоков и привитых цепей ПМА определяли методом гель-проникающей хроматографии при 313 К на жидкостном хроматографе Prominence LC-20VP «Shimadzu» с набором колонок, наполненных полистирол- дивинилбензольными стандартами с размером пор 106 и 105 А. В качестве детектора использовали дифференциальный рефрактометр. Элюентом служил тетрагидрофуран. Калибровку хроматографической колонки осуществляли по
узкодисперсным стандартам полиметилметак-рилата.
ММР хитозана, полученного радикальной деградацией исходного полисахарида в растворе 0.5% HCl с использованием окислительновосстановительной системы на основе пероксида водорода, определяли методом гель-прони-кающей хроматографии высокого разрешения на ВЭЖХ-системе Bio-Rad с рефрактометрическим детектором и системой компьютерной регистрации, колонка - Waters Protein Pakl25 (7.5 х 300 мм), элюент - фосфатный буфер (0.1 М, рН = 2.9) с добавлением 0.2 М NaCl,
скорость потока 0.75 мл/мин. Калибровку хроматографической колонки осуществляли по декстранам с известной молекулярной массой.
Пленки на основе блок- и привитых сополимеров ХТЗ и МА готовили методом полива на лавсановую или стеклянную подложку [4]. Механические свойства пленок (разрывную прочность (о) и относительное удлинение (е)) определяли на разрывной машине ZWIC 2005 при скорости растяжения 50 мм/мин. С целью перевода солевой формы хитозана в непротониро-ванную, пленки блок-сополимеров обрабатывали 5%-ным раствором NaOH (в течение 5 мин), с последующей промывкой дистиллированной водой до рН = 7. Структуру поверхности пленок хитозана, блок- и привитых сополимеров исследовали методом атомно-силовой микроскопии (<^о^ег-Р4», Зеленоград).
Изучение термических характеристик синтезированных сополимеров в области 273-573 К осуществляли с использованием дифференциального сканирующего калориметра DSC204F1 производства фирмы Netzsch Geratebau, Германия. Методика работы аналогична описанной в работе [5].
Устойчивость привитых и блок-сополимеров хитозана и метилакрилата к действию грибов определяли по ГОСТ 9.049-91, метод 1 [6]. Данный метод позволяет оценить природную гри-бостойкость материалов, то есть возможность их использования микромицетами в качестве источников питания. Испытания проводили как к ассоциативной культуре грибов, так и к отдельным видам - активным деструкторам различных полимерных материалов. Сущность метода заключается в следующем: полимерную композицию помещали в чашки Петри, иноку-лировали суспензией спор грибов (1x10 6 в мл) и термостатировали в течение 28 суток при 301 ± 2 К и влажности > 95%. Грибостойкость оценивали в баллах (по шестибалльной шкале) на основе визуальной оценки интенсивности роста грибов на испытуемых сополимерах.
Результаты и их обсуждение
В работе [3] автор показал, что под действием окислительно-восстановительной системы пероксид водорода - аскорбиновая кислота происходит радикальная деструкция цепей хи-тозана по гликозидным связям с образованием на них активных центров. Можно предположить, что введение виниловых мономеров в реакционную систему непосредственно в процессе деструкции цепей полисахарида будет приводить к образованию блок-сополимеров.
На первом этапе работы методом гель-про-никающей хроматографии было изучено влияние концентрации окислительно-восстановительной системы на ММР образцов полисахарида, подвергшихся деградации (табл. 1).
Все образцы имели широкий профиль молекулярно-массового распределения от 1.2*105 и ниже, причем содержание высокомолекулярной фракции нарастало с уменьшением концентрации пероксида водорода. Из табл. 1 видно, что снижение концентрации пероксида водорода в 5 раз (изменение соотношения [звено глюкоза-мина]/[Н202] с 20 до 100 (в осново-моль/моль)) при деструкции цепей хитозана позволяет в широком диапазоне варьировать молекулярную массу (от 9*103 до 17*103) блоков полиглюко-замина и, соответственно, количество образующихся активных центров.
Далее была исследована возможность получения блок-сополимеров ХТЗ с метилакрила-том. Из рис. 1 видно, что в указанных условиях синхронно с процессом деструкции цепей хитозана происходит исчерпание МА в реакционной системе и нарастание ее вязкости. За 30 мин достигается предельное разрушение цепей полисахарида и за это же время глубина превращения МА достигает своего максимального значения 84-98%, в зависимости от концентрации Н202 в системе.
Установлено, что изменение концентрации Н202 практически не влияет на ММ блоков образующегося ПМА (табл. 1). Молекулярная масса ПМА, полученного в тех же условиях ([звено глюкозамина]/[Н202] = 50 осново-
моль/моль, [МА] = 0.348 М) в отсутствие ХТЗ, существенно выше и составляет 2.63х 10 .
Мы не исключаем, что под действием окислительно-восстановительной системы Н2О2 -аскорбиновая кислота может протекать гомополимеризация акриловых мономеров, поэтому выделенный после полимеризации продукт гипотетически мог представлять собой либо блок-сополимер полисахарида с МА, либо смесь гомополимеров хитозана и ПМА, или смесь гомополимера и блок-сополимера. Методами экстракции и ИК-спектроскопии доказано образование блок-сополимеров. Содержание гомополимера в продукте реакции определяли по разности массы навески полимера до и после экстракции его на аппарате Сокслета в течение 48 часов. Выход гомополимера ПМА оказался чрезвычайно низким и составил 3%. В ИК-спектрах продуктов полимеризации, отмытых от гомополимеров на аппарате Сокслета, присутствуют полосы, соответствующие колебани-
Таблица 1
Значение ММ образцов ХТЗ после деструкции при различных концентрациях Н2О2 (столбец 2). Значение ММ исходного хитозана 1.2х105. Значение ММ блоков ПМА в сополимерах после разложения цепей хитозана NaNO2 (столбец 3)
[Звено глюкозамина]/[Н2О2], осново-моль/моль Хитозан, ММх10-3 ПМА, ММх10-4
20 9 -
50 15 13
100 17 13.8
40
30
20
10
П, сП
Время, мин
Рис. 1. Зависимость глубины превращения МА (Г) от времени в процессе деструкции ХТЗ при [МА]/[звено глю-козамина] = 1.87 моль/осново-моль ([МА] = 0.348 моль/л, [ХТЗ] = 0.186 моль/л, [УК] = 1 моль/л) при 295 К: 1 - [звено глюкозамина]/[Н202] = 50 осново-моль/моль, 2 - [звено глюкозамина]/[Н202] = 100 осново-моль/моль. Изменение вязкости раствора хитозана со временем в присутствии окислительно-восстановительной системы Н202 - аскорбиновая кислота: 3 - [звено глюкозамина]/[Н202] = 50 осново-моль/моль
ям карбонильных групп ПМА - 1728 см-1 (карбоксильная группа).
Как отмечалось выше, биодеградация полимеров существенно зависит от структуры полимерных цепей. Поэтому следующим этапом работы был синтез привитых сополимеров ХТЗ с МА. В качестве инициатора был выбран динитрил азоизомасляной кислоты. В работе [7] было показано, что этот инициатор не вызывает деградацию цепей полисахарида, что обусловливает получение привитых сополимеров с высокой молекулярной массой основной цепи. Из рис. 2 видно, что полимеризация характеризуется высокими скоростью и глубиной превращения МА: за час полимеризуется ~98% мономера.
Как и в случае блок-сополимеров, в продуктах привитой сополимеризации было определено содержание гомополимера ПМА путем экстракции его ацетоном. По полученным данным были рассчитаны глубина превращения, сте-
пень и эффективность прививки в зависимости от соотношения реагентов (табл. 2).
Обращает на себя внимание тот факт, что эффективность прививки, т.е. отношение количества мономера, вошедшего в привитой сополимер, к количеству заполимеризовавшегося мономера, независимо от соотношения реагентов и глубины превращения, составляет лишь ~50%. Таким образом, продукт синтеза представляет собой смесь гомополимера ПМА (~50%) и привитого сополимера ХТЗ и МА. Несмотря на то, что ПМА в воде нерастворим, образовавшаяся в процессе синтеза дисперсия полимеров является агрега-тивно устойчивой не менее 6 месяцев, т.е. привитой сополимер выступает в качестве эффективного стабилизатора ПМА. В ИК-спектрах привитых сополимеров ХТЗ-МА, отмытых от гомополимеров на аппарате Сокслета, присутствуют полосы, соответствующие колебаниям карбонильных групп МА - 1732 см-1 . Молекулярная
Таблица 2
Глубина превращения, степень и эффективность прививки при привитой полимеризации МА на хитозан в зависимости от концентрации мономера
Соотношение [МА]/[звено глюкозамина], моль/осново-моль Г, % Выход гомополимера, % Степень прививки, % Эффективность прививки, %
1.25 41 51 33 49
1.78 98 - - -
3.14 99 51 82 49
4.71 87 45 74 55
Время, мин
Рис. 2. Зависимость глубины превращения МА в процессе привитой сополимеризации в растворах хитозана от времени ([МА] = 0.58 моль/л, [ДАК] = 0.01 моль/л, [ХТЗ] = 0.186 моль/л, [УК] = 1 моль/л), Т = 343 К
масса цепей ПМА, выделенных из привитых сополимеров, как и в случае блок-сополимеров, зависит от концентрации мономера в реакционной смеси (табл. 3).
С увеличением содержания в реакционной системе МА от 0.165 М до 0.585 М при постоянной концентрации инициатора ([ДАК] = = 0.01 моль/л) значение средневесовой ММ возрастает с 0.54х106 до 1.28х106, а полидисперсность образующихся полицепей существенно снижается.
Были исследованы физико-механические свойства пленок привитых и блок-сополимеров ХТЗ и МА (табл. 4).
Из табл. 4 видно, что значение разрушающего напряжения пленок привитых сополимеров ХТЗ-МА, содержащих до 50% гомополимера, при соотношении [МА]/[звено глюкозамина] = = 1.87 (осново-моль)/моль достигает ~42 МПа, деформация - 11%. Физико-механические показатели блок-сополимеров несколько ниже и в данном случае.
Различия физико-механических свойств блоки привитых сополимеров, по-видимому, связаны с различием в их надмолекулярной структуре, что можно наблюдать на снимках топографии поверхностей этих пленок, полученных методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) (рис. 3).
Из рис. 3 а видно, что поверхность пленки хитозана имеет зернистую структуру с более-менее регулярным распределением зерен. На АСМ-изображении привитого сополимера ХТЗ-МА при соотношении [МА]/[звено глюкозами-на] = 1.8 моль/осново-моль (рис. 3б) образования расположены в плоскости поверхности пленки нерегулярным образом, «плотность» зерен становится меньше, средний размер составляет ~0.3-0.4 мкм, а их высота доходит до 65 нм. На АСМ-изображении блок-сополимера ХТЗ-МА ([МА]/[звено глюкозамина] = = 1.8 моль/осново-моль) (рис. 3в) можно видеть, что рельеф существенно изменяется, что, по-видимому, связано с ассоциацией себе подобных фрагментов цепей.
Таблица 3
ММ цепей ПМА при различной концентрации мономера в реакционной смеси ([ХТЗ] = 0.186, [УК] = 1, [ДАК] = 0.01 моль/л)
[МА], моль/л Мп х10-6 М„ х10-6 М w/ М п
0.165 0.13 0.54 4.0
0.331 0.24 1.13 4.7
0.585 0.56 1.28 2.3
Таблица 4
Физико-механические свойства пленок, полученных на основе привитых* и блок-сополимеров хитозана и МА
Полимер Концентрация МА в синтезе, моль/л ст, МПа е, %
ПолиХТЗ-прив-полиМА [ДАК] = 0.01 моль/л 0.165 очень хрупкие
0.331 37.1 6.8
41.46** 11.3**
0.585 27.69 6.52
ПолиХТЗ-блок-полиМА [звено глюкозамина]/[Н2О2] = 50 осново-моль/моль 0.348 4.5 2.70
27.58*** 8.52***
ПолиХТЗ-блок-полиМА [звено глюкозамина]/[Н2О2] = 100 осново-моль/моль 0.348 31.73 3.33
24.84*** 4.99***
* Привитой сополимер представляет собой смесь привитого сополимера и гомополимера. ** Непротонированная форма ХТЗ.
*** Для получения однородности пленки в дисперсию полимеров добавлен растворитель диметилформамид.
Рис. 3. Снимок АСМ хитозана (а), привитого сополимера хитозана с метилакрилатом (б), блок-сополимера хитозана с метилакрилатом (в). ([МА]/[звено глюкоза-мина] = 1.8 моль/осново-моль). Плоскостное изображение (размер 3х3 мкм)
б
а
в
Таблица 5
Устойчивость ряда полимерных композиций к действию микромицетов
Вид микромицета / Интенсивность развития плесневых грибов, балл
№ Материал а £ О S S Си 5 S ъ О -с -2 си Q 6 ■S £ S S -2 3 S .Jjj S о £ S з Л £ £ в о б и р и а и ц о с с А
1 ПолиХТЗ-прив-полиМА 3 5 3 4 4 4 4 5 2 4
2 ПолиХТЗ-блок-полиМА 3 3 5 5 3 4 4 5 4 4
3 ПолиХТЗ-блок-полиМА (солевая форма) 0 0 1 1 0 1 0 1 1 2
* Метод 1 (ГОСТ 9.049-91).
Изучение термического поведения хитозана, его привитого и блок-сополимеров с МА ([МА]/[звено глюкозамина] = 1.8 в моль/осново-моль) в области 273-573 К проводили методом ДСК. Для трех изученных образцов на кривой температурной зависимости ДСК-сигнала обнаружен явно выраженный экзотермический эффект, начинающийся с температуры ~523-533 К и не заканчивающийся в изученной области. Наблюдаемый эффект обусловлен строением полимерной цепи хитозана, элементарные звенья которого присутствуют в модифицированном виде в сополимерах. В области температур 273-523 К на кривой ДСК-сигнала отчетливо проявляется релаксационное превращение -расстеклование. По завершении растеклования для изученных образцов наблюдается экзоэффект (выделение энергии), обусловленный началом термической деструкцией полимеров.
Полученные гибридные сополимеры были исследованы на биостойкость. Из табл. 5 видно, что присутствие звеньев природного полисахарида ХТЗ в цепях синтетического полимера вызывает биодеградацию последнего. Привитой сополимер ХТЗ-МА ([МА]/[звено глюкозамина] = = 1.87 моль/осново-моль), содержащий ПМА (~50%), и блок-сополимер ХТЗ-МА ([МА]/[звено глюкозамина] = 2.37 моль/осново-моль) разлагаются практически всеми видами грибов (степень обрастания в баллах равна 3-5).
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности создания гибридных природно-синтетических сополимеров хитозана с (мет)акрилатами с высокими физико-механическими свойствами и регулируемым временем биоразложения.
Выводы
Синтезированы блок- и привитые сополимеры хитозана с метилакрилатом с различной молекулярной массой фрагментов цепей природного и синтетического полимеров. Модификация хитозана метилакрилатом позволяет получить пленочные материалы с высокими физикомеханическими свойствами с регулируемым временем биоразложения микромицетами.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, программа «Развитие научного потенциала высшей школы 2009-2010 годы» (проект № 2.1.2/1056).
Список литературы
1. Клинков А.С., Беляев П.С., Соколов М.В. Утилизация и вторичная переработка полимерных материалов // Учебное пособие. Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та. 2005. 80 с.
2. Иощенко Ю.И., Каблов В.Ф., Заиков Г.Е. // Пластические массы. 2008. № 7. С. 50-54.
3. Федосеева Е.Н. Автореф. дис. ... канд. хим. наук. Н. Новгород: ННГУ, 2007. 24 с.
4. Серенсон У., Кемпбел Т. Препаративные методы химии полимеров. М.: Изд-во иностр. лит., 1963. С. 70.
5. Hohne G. W. H., Hemminger W. F., Flammer-sheim H. F. Differential scanning calorimetry. Heidelberg: Springer-Verlag Berlin, 2003. 299 p.
6. ГОСТ 9.049-91.ЕСЗКС. Материалы полимерные и их компоненты. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов. М.: Изд-во стандартов, 1995. 14 с.
7. Мочалова А.Е., Смирнова Л.А., Семчи-ков Ю.Д. и др. // Высокомолек. соед. Сер. А. 2005. Т. 47. № 6. С. 990-999.
PRODUCING BIODEGRADABLE MATERIALS ON THE BASIS OF BLOCK AND GRAFT COPOLYMERS OF CHITOSAN AND METHYL ACRYLATE
V.F. Smirnov, A.E. Mochalova, I. V. Belysheva, A. V. Markin, M.A. Batenkin, L.A. Smirnova
Copolymers of chitosan with methyl acrylate of various macromolecular architecture (block and the graft copolymers) have been synthesized being different both by spatial orientation of natural and synthetic circuits and their molecular weight. The impact of copolymer structure on the physical-mechanical properties of their films and the ability of the latter to biodegradation by micromycetes has been revealed.
Keywords: chitosan, methyl acrylate, graft and block copolymers, biodegradation.
